親水性分子の光学分割能を実
現するクロマトグラフィー
分離媒体の発明
京都工芸繊維大学
分子化学系
クロマトグラフィーとは
クロマトグラフィー (Chromatography) は ロシアの植物学者ミハイル・ツヴェットが 発明した、物質を分離・精製する技法。 物質の大きさ・吸着力・電荷・質量・疎水 性などの違いを利用して、物質を成分ご とに分離する。クロマトグラフィーは色 （ギリシャ語で chrōma）を分けるといった 意味合いを持つ。これは、ツヴェットがク ロマトグラフィーで植物色素を分離した 際に色素別に色が分かれて帯ができた ことに由来する。 Wikipediaより 中国語では色譜という。これも色を並べ るという意味からか。楽譜、詩譜という言 葉もある。高速液体クロマトグラフィー （
HPLC）
検出器 移動相 カラム インジェクター ポンプ 記録計 廃液 A B t0 t0 A B溶質の二相間の分配係数の差を移動速度の差に
置き換えて、分離を達成する
クロマトグラフィー分離媒体
医薬品、バイオ生産物 プロテオミクス 環境関連物質 合成有機化合物 異性体、同族体、同位体 高速・精密分離、 分取、実用 高性能分離媒体 液体クロマトグラフィー （相互作用、吸着） 識別、分離、多次元化 微粒子 シリカネットワーク 担体（骨格）調製 官能基の配置 化学修飾 重合反応 識別部位組み込み親水性相互作用クロマトグラフィー
HPLCは、逆相型の分離モードで主に発展してきた。疎水性の分子の
分離分析には不可欠な技術に成長・発展している。
Chromatography Instruments Market worth 9.223 Billion USD by 2020.
System (LC (HPLC, UHPLC, Flash), GC, Other Components (Autosamplers,
Detectors, Fraction Collectors), by Consumable (Reverse Phase Columns, Syringe Filters, Vials). www.marketsandmarkets.com
親水性分子を分離分析することの要求が高まっている。
順相HPLC 親水性の分子に保持がある 親水性の分子の溶解性
逆相HPLC 電荷を持つ分子、親水性の分子（logP < 0）の保持が小さい →イオンペアクロマトグラフィー、極性基含有型固定相、誘導体化 etc.
親水性相互作用クロマトグラフィー
0 50 100 150 200 250 300 350 19 91 19 92 19 93 19 94 19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 20 06 20 07 20 08 20 09 20 10 2 01 1 20 12 20 13 20 14 20 15M. Lämmerhofer, J. Sep. Sci., 33 (2010) 679 + a.
論 文 数 Alpartが HILICという 術語を提唱 Irgumが双性 イオン型固定 相を発表 Chinese Milk Scandal発覚 メラミン分析 学会では逆相 の発表件数と 並んだ
未修飾シリカ 双性イオン型 アミド型 ジオール型 アミノプロピル型 その他 シアノプロピル型 SiO2 35% 25% 14% 12% 9% 4% 2003–2012年の発表に関するデータ
Thermo Scientificの技術報告書「HILIC Separations」に基づき作成。
親水性相互作用クロマトグラフィー 現状と課題
糖は親水性相互
作用クロマトグラ
フィーでも保持
が小さく、分離が
悪いという意見
が多い。
光学分割が可能
なカラムは市販
されていない。
今回の技術の特徴
親水性表面の作成と、光学分割能の発現を同時に実現
アミノ酸を重合
できる形態に
化学変換した
今回の技術の特徴
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 市販カラムの上位３種と同程度 の親水性保持を示した。 重合条件の検討により、もっと 親水性を上げることは可能今回のカラムの分離特性
0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 10 11 14 13 15 a (T b/ Tp ) 固 定 層 表 面 の 酸 性 ・ 塩 基 性 a (U/2dU) 親水性の大小の指標Bare Silica
Neutral
Amides
Zwitterionic
Amines
VS-GSH
VS-Cys
今回のカラムの分離特性
0 0.5 1 k(U) α(OH) α(CH2) α(V/A) α(2d/3d) α(α/β) AX CX α(Tb/Tp) 親水性 k(U) 親水性基選択性 a(U/2’dU) 疎水性基選択性 a(U/5MU) 親水性基配置選択性 a(V/A) 親水性基位置選択性 a(2’dG/3’dG) 構造選択性 a(NPaGlu/NPbGlu) アニオン交換性 a(SPTS/U) カチオン交換性 a(TMPA/U) 表面pH効果 a(Theob/Theop) テストしたカラムで最大の選択性を１に規格化した。 アニオン交換、カチオン交換については平均値を１とした。今回の技術の特徴
0" 0.2" 0.4" 0.6" 0.8" 1"k(U)" α(CH2)" α(OH)" α(V/A)" α(α/β)" α(2d/3d)" AX" CX" α(Tb/Tp)" ZIC$HILIC'(3.5'um)' 0" 0.2" 0.4" 0.6" 0.8" 1"k(U)" α(CH2)" α(OH)" α(V/A)" α(α/β)" α(2d/3d)" AX" CX" α(Tb/Tp)" VS#GSH& 0" 0.2" 0.4" 0.6" 0.8" 1"k(U)" α(CH2)" α(OH)" α(V/A)" α(α/β)" α(2d/3d)" AX" CX" α(Tb/Tp)" VS#Cys'高い親水性
糖の
α体、β体
の
選択性が過去
最高
今回の技術の特徴
市販カラムでは、
フルオロウリジ
ン類の完全分
離は困難
今回のカラムによる光学分割
80%ACN-20 mM 酢酸アンモニウムbuffer (30 ℃) 75%ACN-20 mM 酢酸アンモニウムbuffer (30 ℃)現状では、
α値が非常に小さいため、これらのターゲットを
完全分離するには、
高理論段数のカラムの作製が必須
で
ある。今後の条件検討で、より良い分離が達成される可能
性はある。
今回のカラムによる光学分割
• シリカ粒子にビニルスルホン結合型アミノ酸を重合修飾する方法
を新たに開発した。得られたアミノ酸重合型カラムは、ほぼ中性
の表面を持ち、親水性は市販カラムと同等の値を示した。
• アミノ酸重合型カラムは双性イオン型カラムと類似の分離特性を
示した。ポリマー部の構造を考慮すると、妥当な結果が得られた。
• アミノ酸重合型カラムは、高い親水性表面を提供し、糖のα／β
の差に対する選択性が大きいことが示された。
• アミノ酸重合型カラムによる糖のL体／D体、アミノ酸のL体／D体
の分離が可能であった。完全分離には、条件検討とカラムの高
性能化が必要である。
想定される用途
D–Glucose 地球上のほとんどの生命体 がエネルギー源／炭素源と して利用（資化） 解糖系（もっとも原始的な代 謝経路）で分解される。 L–Glucose 高等生物は代謝できない 資化できるバクテリアもある 天然にはわずかに存在する （希少糖）化学合成は可能 味はD−体と大差ない 筑波大学環境バイオマス共生学 中村 顕 先生の資料に基づく想定される用途
L-Arabinose （自然界ではL体優先） 小麦粉100 g中に218 mg、アカキャベツ100 g中 に200 mg、サツマイモ100 g中に19 mg グルコシダーゼ、スクラーゼの阻害 →砂糖の吸収を抑える L-Fucose （自然界ではL体優先） 海藻の粘り成分に含まれる ABO式血液型を区別する抗原として含まれる天然界の糖がD−体優先（ホモキラリティ）である
ことの解明手段の１つを提供する。
想定される用途
H2N N H OH O N H N O HN O NH2 N N O NH2 F OH HO SH SH P O O OH OH N N H NH NH NH2 N H N O NH2 F N H NH O O F N N N H NH O N N OH O P OH O OH NH2 OH O N H N N H N S H N OH O SH O N H NH O SHydroxyurea Fomepizole Cycloserine Methimazole Niacin
Dimercaprol Foscarnet Me ormin Flucytosine Fluorouracil
Fosfomycin Allopurinol Pralidoxime Mercaptopurine Favipiravir
Propylthiouracil Tiopronin Pregabalin
Aspirinより分子量の小さな医薬品 カルボン酸、フェノール、アミン等、
高極性、水 溶 性の官能基を持つ
