2016 年 7 月 12 日受理 連絡責任者：阿部知子（[email protected]）
重イオンビーム育種によるグリーンイノベーションの創出
風間裕介
1）・平野智也
1,2）・大田修平
3）・佐藤陽一
1,3,4）・村井耕二
5）・河野重行
3）・小野克徳
4）・阿部知子
1） 1） 理化学研究所・仁科加速器研究センター・生物照射チーム （〒 351-0198 埼玉県和光市広沢 2-1） 2） 宮崎大学・農学部・応用生物科学科（〒 889-2192 宮崎市学園木花台西 1-1） 3） 東京大学・新領域創成科学研究科・先端生命科学専攻 （〒 277-8561 千葉県柏市柏の葉 5-1-5） 4） 理研食品株式会社（〒 985-0844 宮城県多賀城市宮内 2-5-60） 5） 福井県立大学・生物資源学部・生物資源学科（〒 910-1195 福井県吉田郡永平寺町松岡兼定島 4-1-1） 要旨：重イオンビームは，その飛程にそって高密度に電離作用を及ぼし，細胞に照射すると効率的に DNA 二重鎖 切 断 を 引 き 起 こ す． 放 射 線 が 単 位 長 当 り に 物 質 に 与 え る エ ネ ル ギ ー を， 線 エ ネ ル ギ ー 付 与（Linear Energy Transfer：LET）と言い，イオンビームではイオンの種類や速度を選択することで LET を制御することができる． 私たちは，モデル植物で突然変異誘発における LET の影響を調査し，変異率が最大となる LET（LETmax）を発 見した．また，LET が大きいほど欠失変異のサイズが大きくなったり，染色体再編成の割合が増えることを見い だし，ユーザーの目的に合わせて LET を選択して照射する「オンデマンド変異誘発技術」を提唱した．理研・生 物照射チームは，本技術を品種改良などに活用する 180 団体と共同研究を行っている．その成果として，超早生 の 1 粒系コムギ，オイルを高生産するクロレラ，高成長ワカメの作出に成功した． キーワード：重イオンビーム，LET，変異誘発，超早生コムギ，オイル高生産クロレラ，高成長ワカメ1．はじめに
重イオンビームは，γ線や X 線と比較すると LET が大 きいため，同じ生物効果を得るために必要な照射線量は低 い．また，変異選抜は，γ線や X 線では半致死線量で行う が，重イオンビームでは生存率が低下しない線量でも十分 可能である．そのため，農業上有益な形質には影響を与え ずに，ユーザーの目的とする形質が改良できる技術として 発展してきた（Tanaka et al. 2010; Abe et al. 2012; Abe et al. 2015）．特に，組織培養技術を併用すると，目的形質を付 与した変異体のクローン植物がそのまま新品種となる．例 えば，1998 年に照射した例では，花苗変異体をクローン増 殖し，2 年目には品種候補が固定され，2001 年から 3 つの 新品種の販売が開始された．現在までに国内で重イオン ビーム照射で育成し品種登録出願したものは 70 を超えた． 一口に重イオンビームと言っても様々な種類のビームが ある．理研仁科センターには巨大な重イオン加速器群 RI ビームファクトリー（RIBF）があり，炭素，窒素，ネオン， アルゴン，鉄のイオンを加速して生物に照射することがで きる．重いイオンほど LET が高い．また，ビームと細胞 が作用する時間が長いほど，すなわちビームの速度が遅い ほど LET が高い．そのため，照射するイオンとその速度 を選択することで，LET を制御できる．本稿では，近年 私たちがモデル植物シロイヌナズナを用いて明らかにした LET の変異率や DNA の壊れ方など，突然変異誘発に与え る影響および，ユーザーの目的に合わせて LET を選ぶ「オ ンデマンド変異誘発」の開発を紹介する．また，近年，そ れぞれ工夫を凝らした選抜が精力的に行われている一粒系 コムギ，微細藻類のクロレラ，大型海藻類のワカメで得ら れた数々の有用変異体を紹介したい．2．重イオンビームの変異誘発作用における LET 効果
重イオンビームが DNA 二本鎖を切断する際の物理的要 因は，照射線量，LET，そして飛来するイオン数である． 照射線量は LET とイオン数の積に比例する．同じ線量で 比較した場合，LET が高いほど飛来するイオン数が少な くなる．私たちは，変異率への LET の影響を調査するため， 様々な LET の重イオンビームを照射して M2世代でアルビ ノ変異体の出現率を測定した．22.5 keV/μm では，線量を 生存率が低下しない 500 Gy（イオン数は 100μm2あたり 13,600 粒）まで増やしても変異率は 1% 程度であったのに 対し，30.0 keV/μm では，200 Gy（100μm2 あたり 4,000 粒） を超えると変異率が上昇し 3% となった（第 1 図）．この ことから，変異率の上昇には LET とある程度のイオン数 が必要であることがわかった．一方，LET が 61.5 keV/μm 以上では，変異率は最大でも 2% にとどまった．これは LET が高すぎるため，効率的な変異誘発に必要な粒数に 達する前に，致死線量に達してしまうためと考えられる． 以上の結果から，変異誘発に最適の LET（LETmax）があ ることが示唆された（Kazama et al. 2008）。その後，照射 当代（M1世代）で変異率を測定できる（APG3 遺伝子に 薬剤マーカーを導入）実験系を確立 LET を精査した結果， シロイヌナズナの LETmax は 30 keV/μm であることが確認 された（Kazama et al. 2012）．一方，植物では最も低線量 で致死効果が現れる LET は 290 keV/μm であった（Morishitaet al. 2003, Kazama et al.2008）．この二つの LET で誘発さ れる突然変異の種類と規模を比較するため，それぞれの LET の重イオンビームを照射して得たシロイヌナズナの 既知変異体について，PCR とサンガー法で原因遺伝子上 に生じた変異を決定した．LETmax で誘発される変異の 8 割は，数 bp から数十 bp の小さな欠失と塩基置換であり， 残り 2 割が 10 kbp 以上の巨大欠失か染色体再編成であっ た（Kazama et al. 2011）．一方，290 keV/μm 照射では，小 さな欠失の割合は低下し，大きな欠失や染色体再編成の割 合が増大した （Hirano et al. 2012）．量子科学技術研究開発 機構（量研機構）高崎応用研究所の TIARA の実験結果（平 均 LET：113 keV/μm; Shikazono et al. 2005）を加えて比較 すると，LET が高いほど，大きい欠失や染色体再編成の 頻度が高まることがわかった（第 2 図）．290 keV/μm 照射 で作出した 3 つの変異体について，染色体再編成の状態を
調査するため，ゲノムリシーケンスを行った．その結果， 染色体再編成の多くは，染色体内の近接した領域に複数生 じていた（Hirano et al. 2015）．従って，高 LET ビームは， 細胞内を直進し一粒子でも飛跡上の染色体にクラスター切 断を誘発し複数の DNA 断片を形成し，それらが誤って修 復されることで逆位や転座，大規模な欠失が生じると考え られる．遺伝子領域に位置する変異を解析しゲノム当たり の変異遺伝子数を算出した結果，自殖 M3世代においてホ モ接合で存在する変異遺伝子は，3 つの変異体でそれぞれ 5，7，11 個であった （Hirano et al. 2015）． これらの結果から，「変異率が高く 1 遺伝子を破壊する には LETmax 照射」が，「2 遺伝子以上の破壊や染色体再 編成の誘発には高 LET 照射」が有効であることが判明し たため，ユーザーの目的に合わせて LET を選択して照射 する「オンデマンド変異誘発技術」を提唱する．LETmax では，通常の品種改良に加え，主に数 bp 程度の小さな欠 失が高変異率で得られることから，TILLING 等の逆遺伝 学的手法にも有用である．高 LET のビームは，高次倍数 性植物の品種改良や，タンデム重複遺伝子の機能解析，ゲ ノムの位置効果やエピゲノムへの影響研究等に有効なビー ムとして期待できる．
3．一粒系コムギミュータントパネル
ゲノム中の様々な遺伝子についての変異体の集団である ミュータントパネルは，遺伝子の機能解析研究における重 要なツールとなる．パンコムギ（Triticum aestivum）は 6 倍体（2n=42＝6x, ゲノム構成 AABBDD）であるため，通常， 突然変異の影響が表現型に現れにくい．そこで私たちは， コムギ属植物における大規模ミュータントパネルを作成す る た め，2 倍 体 の 栽 培 型 一 粒 系 コ ム ギ（T. monococcum, 2n=14=2x, AmAm ）を用いている．イオンビームは乾燥種子 に照射し，これを M1世代として圃場で栽培する．M1個 体の穂ごとに自殖種子を採種し，M2系統とする．M2系統 では，系統内で 25％の個体が変異型対立遺伝子ホモ接合 第 1 図 突然変異率に対する LET の影響．シロイヌナ ズナの乾燥種子に各種 LET の重イオンビーム を照射し，M2世代でアルビノ変異体の出現率 を変異率として求めた．M1世代で生存率が 90% 以上を示す照射区のみ示す． 第 2 図 変異の種類や規模に対する LET の影響．シロイヌナズナの乾燥種子に各種 LET の重イオンビームを照射し，M2世代で 既知変異体を選抜し、原因遺伝子に存在する変異を同定した．22.5-30.0 keV/μm は（Kazama 2011）, 113 keV/μm は（Shikazono 2005）, 290 keV/μm は（Hirano 2012）から引用した．となり，表現型の変化が期待される．福井県立大学の研究 グループは過去 10 余年におよぶ作業の結果，現在，約 1 万の M2系統を保有し，変異体のスクリーニングに供試で きる体制にある（第 3 図）．また，私たち独自でも毎年圃 場で変異体のスクリーニングを行っており，これまでに出 穂期（花成），草型，稈長，稔性などに関する多数の変異 体を獲得している．maintained vegetative phase （mvp） 変異 体は，コムギの花成で中心的な役割を担う花成促進遺伝子 VRN1（VERNALIZATION 1）を欠失しており，いつまで経っ ても栄養成長を続け，生殖成長へ移行しない変異体として 同定された（Shitsukawa et al. 2007）．mvp 変異体の解析から， コムギ花成遺伝子群の重要な相互関係が明らかとなった （Shimada et al. 2009）．また，野生型（非突然変異体）に比 べて圃場で 1 カ月も早生となる極早生変異体 extra
ear-ly-fl owering （exe）は，生物時計関連遺伝子が欠失していた． exe 変異体の詳細な解析から，コムギにおける短日応答性 と早生性の関係が明らかとなった（Nishiura et al. 2014）． また，花成の進行が遅く，葉数 / 節数が増加し，茎の上部 の節で分枝するという，極めてドラスティックな体制の変 化を示す興味深い変異体 fushi-darake（fdk）も同定してい る（Tahira et al. 2013）．このような突然変異体を利用して， コムギの花成や花芽形成の遺伝的制御の全貌が明らかにさ れれば，収穫時期の人為的制御や花序構造の人為的変革に よる早生多収性育種という，新しい育種技術が確立される だろう．
4．クロレラの育種の可能性
微細藻類は，光や栄養塩を制御することで，細胞内にデ ンプンやオイル（脂質）を選択的に産生させたり，カロテ ノイドの一種であるアスタキサンチンを多量に産生させた りすることができる．細胞当たりのデンプン量とオイル量 の間には明瞭なトレードオフの関係が見られ，培養の経過 とともに貯蔵物質がデンプンからオイルへと転換される （Mizuno et al. 2013, Takeshita et al. 2014）．この物質転換は 培地中の窒素源や硫黄源などの栄養塩を制限することで加 速されるが，栄養塩を制限すると成長が抑制されバイオマ ス生産量が著しく減少する．バイオ燃料増産のためにはこ の相反する問題を打開する必要があり，近年，物質生産に 適した藻類培養法の研究が進められているが（Vítová et al. 2015），一方で，微細藻類そのものを育種する発想で，バ イオマス生産能を落とさずに有用物質を生産する株の開発 も進められている． 東京大学の研究グループはパラクロレラ（Parachlorella kessleri）を用いて重イオンビーム育種を実施している．パ ラクロレラは増殖能が高く，オイルやデンプン生産性に優 れたクロレラの一種として注目されている（P㶣ibyl et al. 2012, Li et al. 2013）．パラクロレラにはこれまでリファレ ンスとしてのゲノム配列情報がなく，ゲノムの欠失解析な どはできなかった．最近，全ゲノム配列の完全解読に成功 し（Ota et al. 2016），重イオンビーム照射によるゲノムの 解析なども迅速に実施できるようになり，パラクロレラの 育種研究を理論的に展開できる道が開けた． 微細藻に重イオンビームを照射した育種研究例はこれま でに殆ど無く，研究開始した頃は，生存率などの基礎デー タ収集に終始した（Ota et al. 2013a）．重イオンビームを照 射したパラクロレラ細胞から分離・株化した代表的ミュー タント 23 株の増殖速度，粒子径，デンプン蓄積動態，オ イル蓄積動態，脂肪酸組成を解析した結果，これらの表現 型に様々な変化が生じることが明らかとなった（Ota et al. 2013b）．ここではそのなかで代表的な変異体 2 株と野生株 のオイル生産量とデンプン生産量を比較したグラフを示し た（第 4 図）．特徴的な 2 株はともに野生株の 2 倍以上の オイルを蓄積することが明らかになった．また，PK4 株の ように窒素制限培地でオイル蓄積が急激に上昇する株もあ れば，11A5 株のように硫黄制限培地でオイル蓄積が急激 に上昇する株があった．これは栄養塩制限と重イオンビー ム育種を組み合わせることで，藻類の物質生産をコント ロールできることを意味しており，将来の藻類バイオ研究 にとって有望である．私たちの研究室では，重イオンビー ム照射株のハイスループットスクリーニング法や迅速定量 法（Takeshita et al. 2015）を開発しており，重イオンビー ム育種を用いてバイオ燃料や有用物質の実用化レベルの生 産が期待される． 第 3 図 一粒系コムギの圃場観察会の様子．福井県立 大では，約 1 万の M2系統を保有し，毎年変 異選抜と変異体の固定を行っている．5．ワカメ育種基盤の構築
三陸地方はワカメの国内総生産量の約 7 割を占める一大 産地である．しかしその生産量は近年減少傾向にあり，特 に東日本大震災後は生産者が減少し，市場の国内産回帰の 影響から国内の需要を満たすことができず，生産性の向上 や，高品質原料の安定生産を可能にする系統開発が求めら れている．そこで理研と理研食品（株）は，ワカメの優良 系統開発と実用化に関する試験研究を行っている． 通常のワカメ養殖は海上で秋から春にかけて実施されて おり，継続的な観察に基づく選抜試験が困難であった．そ こで，円形水槽の内部構造を新規開発することにより，藻 体が絡まらずに流動し，三陸における一般的なワカメ養殖 漁場と同等の流速を付与できる浮遊回転式陸上養殖装置を 開発した（特開 2014-36596，第 5 図）．これによりワカメ の生活環を陸上で完結させることが可能となり，年に 2 ∼ 3 回の養殖試験を実施できるようになった．この装置を使 用して，三陸における地域系統の中から早生系統と晩生系 統を選抜し，現在実用化のための実証試験を行っている． 重イオンビーム育種のワカメへの適用として，配偶体およ び胞子体に重イオンを照射したところ，M2世代において 大型化する系統が得られた．現在 M3世代において形質の 固定確認および変異形質の解析を実施している．高成長や 早生・晩生系統は，生産量の増大だけでなく，養殖期間の 延長によって漁業者が時期を選択することができ，これに より作業負荷を分散させ，生産効率の向上にも寄与できる． 三陸のワカメ養殖産業を維持していくために，これら優良 系統および複数回養殖ビジネスモデルを海藻養殖産業にお けるイノベーション・ツールとして推進していきたい．6．おわりに
「オンデマンド変異誘発」は，ユーザーの目的に合わせ た規模での遺伝子破壊を実現し，重イオンビームを用いた 逆遺伝学や順遺伝学を研究者にとってより身近なものにし た．逆遺伝学では，機能欠失変異体が高効率で得られると いう点で LETmax は優れており，実際に TILLING を併用 し て 変 異 体 を 得 た 成 功 例 が 出 始 め て い る（ 特 開 2016-96808）．高 LET で誘発した欠失をもつ変異体は，ゲノム タイリングアレイを目的に併せて設計することで（Kazama et al. 2013），逆遺伝学的な高速スクリーニングも可能であ る．突然変異体を用いた順遺伝学では，従来，遺伝子同定 に時間がかかることが難点であっが，私たちは，全ゲノム リシーケンス（Ishii et al. 2016）やエキソーム解析用の迅 速変異検出パイプラインを独自に開発し，全ゲノムレベル での変異検出並びに変異体の原因遺伝子の迅速な同定を可 能にした．最近全ゲノム配列の完全解読が終了したクロレ ラはもとより，コムギやワカメについても，ゲノム解読は 日進月歩であり，全ゲノムリシーケンスやエキソーム解析 が可能になる日も近い．今後，これらのミュータントパネ ルの重要性は益々大きくなるに違いない． 一方，様々な種で LET 効果の解析が進むにつれ，LET の効果は植物と微生物の場合では大きく異なることがわ かってきた．微生物では，鉄イオンビーム（640 keV/μm） のほうが炭素イオンビーム（22.5 keV/μm）よりも大きな 欠失が得られ，欠失変異の率も高い（Ichida et al. 2008）． クロレラを初めとする藻類が，これら植物と微生物のどち らの反応性を示すかは，今後の研究課題である．また， LETmax はシロイヌナズナの乾燥種子照射，イネの吸水種 第５図 浮遊回転式陸上養殖装置 (2,000 L)． 第４図 パラクロレラの野生型株（WT）重イオンビー ム照射で得られた代表的な高オイル蓄積株 （11A5 と PK4）のデンプン，オイル蓄積動態． 通常培地（TAP 培地：栄養塩が豊富な培地）， 窒素稀釈培地，硫黄欠乏培地で，デンプンと オイルの蓄積量を比べた．デンプン蓄積は WT と大差ないが，オイルに関しては 11A5 株と PK4 株ともに栄養塩欠乏ストレスがなく ても，いずれも細胞あたりの蓄積量は多い． また，11A5 は硫黄欠乏に，PK4 は窒素稀釈 により強く反応してオイルを蓄積し，重イオ ンビーム照射によって物質生産を制御できる 可能性のある株が単離できることが明らかに なった．子照射では異なり，イネ吸水種子照射では 50-70 keV/μm 程度が最適であるが（Hayashi et al. 2007），LET が大きい ほど変異の規模が大きくなるのはどちらも共通のようであ る．現在，内閣府総合科学技術・イノベーション会議の SIP からの支援を受け，理研仁科センター，量研機構高崎 応用研究所および若狭湾エネルギー研究センターが協力し て，LET 効果の更なる体系化を進めている．一方，植物 でも，キクなどで炭素イオンビーム照射では得られない新 規変異体がアルゴンビーム照射で得られており（阿部ら 2014），重いイオンの重要性が増しているため，RIBF では 新ビームライン（WACAME）を整備した（Fukunishi et al. 2015）．WACAME は，これまでの重イオンビームを更に もう一台のサイクロトロンで加速し生物照射室に戻すビー ムラインである．これまで飛程が 2 ∼ 6 mm と短かった鉄 やアルゴンイオンビームでも飛程が 10 ∼ 16 mm となり， 生物実験に適用できる核種や LET の幅が広がり，高い LET に関してより精密な LET 効果の実験が可能となる． 今後も，重イオンビーム照射技術や変異領域同定技術の更 なる高度化を進め，遺伝子同定や機能解析のツールとして 突然変異体を普及する．これらのことを通じて，新たなグ リーンイノベーション創出の種となる新品種を育成し，エ ネルギー問題，環境問題，食糧問題の解決に貢献していき たい．
謝辞
本研究の一部は，内閣府 総合科学技術・イノベーショ ン会議の SIP（戦略的イノベーション創造プログラム）「次 世代農林水産創造技術」（管理法人：農研機構 生研支援セ ンター），及び，文部科学省東北マリンサイエンス拠点形 成事業の支援を受けて実施された．参考文献
Abe, T., H. Ryuto, and N. Fukunishi （2012） Ion beam radiation mutagenesis. In Plant Mutation Breeding and Biotechnology Shu, Q.Y., B.P. Forster, and H. Nakagawa （eds.）, Oxfordshire, CABI. 99-106.
阿部知子・風間裕介・西美有紀・永吉実孝 （2014） 九州ブ ランドを世界に！−突然変異育種の挑戦− . 育種学研究 16：67-71.
Abe, T., Y. Kazama, and T. Hirano （2015） Ion beam breeding and gene discovery for function analyses using mutants. Nuclear Physics News 25:30-35.
Fukunishi, N., M. Fujimaki, M. Komiyama, K. Kumagai, T. Maie, Y. Watanabe, T. Hirano, and T. Abe （2015） New high-energy beam transport line dedicated to biological applications in RIKEN RI beam factory. Proc. HIAT2015 42-44.
Hirano, T., Y. Kazama, S. Ohbu, Y. Shirakawa, Y. Liu, T. Kambara, N. Fukunishi, and T. Abe （2012） Molecular nature
of mutations induced by high-LET irradiation with argon and carbon ions in Arabidopsis thaliana. Mutat. Res. 735: 19-31. Hirano, T., Y. Sato, K. Ichinose, Y. Hayashi, N. Fukunishi, and T.
Abe （2013） Rapid evaluation of mutational effects resulting from heavy-ion irradiation of Undaria pinnatifida. RIKEN Accel. Prog. Rep. 47: 299.
Hirano, T., Y. Kazama, K. Ishii, S. Ohbu, Y. Shirakawa, and T. Abe （2015） Comprehensive identification of mutations induced by heavy-ion beam irradiation in Arabidopsis
thaliana. Plant J. 82: 93-104.
Ichida, H., T. Matsuyama, H. Ryuto, Y. Hayashi, N. Fukunishi, T. Abe, and T. Koba （2008） Molecular characterization of microbial mutations induced by ion beam irradiation. Mutat. Res. 639: 101-107.
Ishii, K., Kazama, Y., Hirano, T., Hamada, M., Ono, Y., and Abe, T. （2016） AMAP: A pipeline for whole-genome mutation detection in Arabidopsis thaliana. Genes Genet. Syst. in press. Kazama, Y., H. Saito, Y.Y. Yamamoto, Y. Hayashi, H. Ichida, H.
Ryuto, N. Fukunishi, and T. Abe （2008） LET-dependent ef-fects of heavy-ion beam irradiation in Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. 25: 113-117.
Kazama, Y., T. Hirano, H. Saito, Y. Liu, S. Ohbu, Y. Hayashi, and T. and Abe （2011） Characterization of highly efficient heavy-ion mutagenesis in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 11: 161.
Kazama, Y., L. Ma, T. Hirano, S. Ohbu, Y. Shirakawa, S. Ha-takeyama, S. Tanaka, and T. Abe （2012） Rapid evaluation of effective linear energy transfer in heavy ion mutagenesis of
Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. 29: 440-444.
Kazama, Y., T. Hirano, K. Nishihara, S. Ohbu, Y. Shirakawa, T. Abe （2013） Effect of high-LET Fe-ion beam irradiation on mutation induction in Arabidopsis thaliana. Genes Genet. Syst. 88: 189-197.
Li, X., P. P㶣ibyl, K. Bišová, S. Kawano, V. Cepák, V. Zachleder, M. 㶏ížková, I. Brányiková, and M. Vítová （2013）. The mi-croalga Parachlorella kessleri--a novel highly effi cient lipid producer. Biotechnol. Bioeng. 110: 97-107.
Mizuno, Y., A. Sato, K. Watanabe, A. Hirata, T. Takeshita, S. Ota, N. Sato, V. Zachleder, M. Tsuzuki, and S. Kawano （2013）. Sequential accumulation of starch and lipid induced by sulfur defi ciency in Chlorella and Parachlorella species. Bioresour. Technol. 129: 150-155.
Morishita, T., H. Yamaguchi, K. Degi, N. Shikazono, Y. Hase, A. Tanaka, T. Abe. （2003） Dose response and mutation induction by ion beam irradiation in buckwheat. Nucl. Instrum. Methods Phys. Res. B. 206: 565-569.
Nishiura, A., Y. Kazama, T. Abe, N. Mizuno, S. Nasuda, and K. Murai （2014） Level of VERNALIZATION 1 expression is cor-related with earliness in extra early-fl owering mutant wheat lines. Breed. Science 64: 213-221.
Ota, S., T. Matsuda, T. Takeshita, T. Yamazaki, Y. Kazama, T. Abe, and S. Kawano （2013a） Effects of heavy-ion beam irra-diation on survival and growth rates in Parachlorella kessleri. RIKEN Accel. Prog. Rep. 46: 266.
Ota, S., T. Matsuda, T. Takeshita, T. Yamazaki, Y. Kazama, T. Abe, and S. Kawano （2013b）. Phenotypic spectrum of
Pa-rachlorella kessleri （Chlorophyta） mutants produced by
heavy-ion irradiation. Bioresour. Technol. 149: 432-438. Ota, S., K. Oshima, T.Yamazaki, S. Kim, Z. Yu, M. Yoshihara, K.
Takeda, et al. （2016） Highly effi cient lipid production in the green alga Parachlorella kessleri: draft genome and transcrip-tome endorsed by whole-cell 3D ultrastructure. Biotechnol. Biofuels. 9: 13.
P㶣ibyl, P., V. Cepák, and V. Zachleder （2012） Production of lip-ids in 10 strains of Chlorella and Parachlorella, and enhanced lipid productivity in Chlorella vulgaris. Appl. Microbiol. Bio-technol. 94: 549-561. 佐藤陽一・山口正希・阿部知子・平野智也・福西暢尚 （2014） 海 藻 類 養 殖 用 装 置 及 び 海 藻 類 養 殖 方 法． 特 開 2014-36596. 澤田倫平・阿部知子・平野智也（2016）レタスの褐変性を 抑制するための DNA，特開 2016-96808.
Shikazono, N., C. Suzuki, S. Kitamura, H. Watanabe, S. Tano, and A. Tanaka （2005） Analysis of mutations induced by carbon ions in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56: 587-596. Shimada, S., T. Ogawa, S. Kitagawa, T. Suzuki, C. Ikari, N.
Shitsukawa, T. Abe, H. Kawahigashi, R. Kikuchi, H. Handa, and K. Murai （2009） A genetic network of flowering time genes in wheat leaves, in which an
APETALA1/FRUITFULL-like gene, VRN1, is upstream of FLOWERING LOCUS T. Plant J. 58: 668-681.
Shitsukawa, N., C. Ikari, S. Shimada, S. Kitagawa, K. Sakamoto, H. Saito, H. Ryuto, N. Fukunishi, T. Abe, S. Takumi, S. Nasuda, and K. Murai （2007） The einkorn wheat （Triticum
monococcum） mutant, maintained vegetative phase, is caused
by a deletion in the VRN1 gene. Genes Genet. Syst. 82: 167-170.
Tahira, C., N. Shitsukawa, Y. Kazama, T. Abe, and K. Murai （2013） The wheat plastochron mutant, fushi-darake, shows transformation of reproductive spikelet meristm into vegetative shoot meristem. American J. Plant Sci. 4: 28-36. Takeshita, T., K. Takeda, S. Ota, T. Yamazaki, and S. Kawano
（2015） A simple method for measuring the starch and lipid contents in the cell of microalgae. Cytologia 80: 475-481. Takeshita, T., S. Ota, T. Yamazaki, A. Hirata, V. Zachleder, and S.
Kawano （2014） Starch and lipid accumulation in eight strains of six Chlorella species under comparatively high light intensity and aeration culture conditions. Bioresour. Technol. 158: 127-134.
Tanaka, A., N. Shikazono, and Y. Hase （2010） Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. J. Radiat. Res. 51: 223-233.
Vítová, M., K. Bišová, S. Kawano, and V. Zachleder （2015） Accumulation of energy reserves in algae: From cell cycles to biotechnological applications. Biotechnol. Adv. 33: 1204-1218.
Green Innovation via Heavy-Ion Breading
Yusuke Kazama1）, Tomonari Hirano1,2）, Shuhei Ota3）, Yoichi Sato1,3,4）, Koji Murai5）, Shigeyuki Kawano3）, Katsunori Ono4）,
Tomoko Abe1）
1） Ion beam breeding Team, RIKEN Nishina Center
（2-1 Hirosawa, Wako-shi, Saitama, 351-0198 Japan）
2） Faculty of Agriculture, University of Miyazaki
（1-1 Gakuen-Kibanadai-Nishi, Miyazaki-shi, Miyazaki, 889-2192 Japan）
3） Department of Integrated Biosciences, Graduate School of Frontier Sciences, the University of Tokyo
（5-1-5 Kashiwanoha, Kashiwa-shi, Chiba, 277-8562 Japan）
4） Riken Food Co., Ltd
（2-5-60 Miyauchi, Tagajo-shi, Miyagi, 985-0844 Japan）
5） Department of Bioscience, Fukui Prefectural University
（4-1-1 Matsuoka-Kenjojima, Eiheiji-cho, Yoshida-gun, Fukui 910-1195 Japan）
Summary: Heavy-ion beams effectively induce DNA double strand breaks by their dense ionization effect on the irradiated
cells. The degree of locally deposited energy is represented by the linear energy transfer （LET; the energy transferred per unit length, keV μm-1
）. The value of the LET can be controlled by selecting ion-species or controlling the velocity of the ions. We found the most effective LET on mutation induction in Arabidopsis thaliana, and that the size of deletions induced by heavy-ion irradiatheavy-ion increases as increasing the value of LET. Based on these results, we proposed on demand mutagenesis , in which the value of LET is selected for individual research purposes. Here, we presented the detail of the LET effect in heavy-ion irradiatheavy-ion together with the recently produced benefi cial mutants of einkorn wheat, chlorella, and brown seaweed, which will be seeds of green innovation.
Keywords: Heavy-ion beam, LET, mutation induction, Extra-early-fl owering wheat, oil-rich chlorella, fast growth wakame
Journal of Crop Research 61:69-75（2016） Correspondance: Tomoko Abe （[email protected]）
