アデニル化酵素を利用した アミド化合物生産法の開発

アデニル化酵素を利用した アミド化合物生産法の開発

Development of Production Method for Various Amide Compounds Utilizing

Adenylation Enzymes

2019 年 7 月

鈴 木 伸

Shin SUZUKI

アデニル化酵素を利用した アミド化合物生産法の開発

Development of Production Method for Various Amide Compounds Utilizing

Adenylation Enzymes

2019 年 7 月

早 稲 田 大 学 大 学 院 先 進 理 工 学 研 究 科 応 用 化 学 専 攻 応 用 生 物 化 学 研 究

鈴 木 伸

Shin SUZUKI

I 目 次

第 1 章 総 論 ･･････････ ･････････････････････････････ ････････････1 1.1 ア ミ ド 化 合 物 ････ ･･････････ ････････････ ････････････ ････ ･･1 1.2 ア ミ ド 化 合 物 合 成 法 ･････････････････ ･･･････････････ ････ ･･1

1.2.1 有 機 合 成 法 ･････････････････ ･････ ･･･ ･････ ･･･ ･･･ ･･ ･･ ･･1

1.2.2 酵 素 合 成 法 ･･････････････････････････････ ･･ ･･･ ･ ･･ ･･ ･･3

1.3 ア デ ニ ル 化 酵 素 を 利 用 し た ア ミ ド 結 合 形 成 反 応 ････････ ････ ･･4 1.4 結 言 ･････････････････････････････････ ･････････････ ･･････5

第 2 章 非 リ ボ ソ ー ム 型 ペ プ チ ド 合 成 酵 素 の ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン を 利 用 し た L-ア ミ ノ 酸 ア ミ ド 合 成 ････････････････････････ ･･････6 2.1 非 リ ボ ソ ー ム 型 ペ プ チ ド 合 成 酵 素 ･･･････････ ･･････ ･･････ ･･･6 2.2 ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン 単 独 で の 利 用 ････ ･･･････････ ･ ････ ･････ ･7 2.3 L-ア ミ ノ 酸 ア ミ ド 合 成 試 験 ･ ･ ･･･ ･ ･ ････ ･･ ･･･ ･････ ･･････ ･･ ･ ･･8 2.4 結 言 ･･････････････････ ･････････････････････ ･･･････････ ･12

II

第 3 章 合 成 可 能 な ア ミ ド 化 合 物 の 拡 張 ･･･････････････････ ･･･････13 3.1 D-ア ミ ノ 酸 含 有 ジ ペ プ チ ド 合 成 ････････････････････ ･･･ ････14

3.1.1 TycA-A の D-ア ミ ノ 酸 に 対 す る 基 質 特 異 性 評 価 ･･･ ･･･････15

3.1.2 TycA-A に よ る ジ ペ プ チ ド 合 成 ･･････････････････ ･･･････17

3.1.3 D-ア ミ ノ 酸 を 基 質 と す る 新 規 ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン の 探 索 ･･23

3.1.4 候 補 ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン の 基 質 特 異 性 評 価 ･･･ ･･ ･ ･･･ ･ ･･ ･24

3.1.5 BacB2-A に よ る ジ ペ プ チ ド 合 成 ･････････････････ ･･･････26

3.2 -ア ス パ ル チ ル ア ミ ド 合 成 ････････････････････････ ･･･ ････29

3.2.1 ア ス パ ラ ギ ン 合 成 酵 素 の 利 用 ･ ･････････ ･･････ ･･ ･･ ･･ ･･･30

3.2.2 -ア ス パ ル チ ル ア ミ ド 合 成 試 験 ････････････････ ････ ･･･31

3.3 脂 肪 酸 ア ミ ド 合 成 ･･･････････････････････ ･････････ ････ ･･･35

3.3.1 脂 肪 酸 を ア デ ニ ル 化 可 能 な 酵 素 の 探 索 ････ ････ ･ ･ ･･･ ･ ･･･35

3.3.2 脂 肪 酸 に 対 す る 基 質 特 異 性 評 価 ･･････ ･ ････ ････ ･ ･･･ ･･･ ･37

3.3.3 脂 肪 酸 ア ミ ド 合 成 試 験 ･･･････ ････････････････ ･ ･･ ･･ ･･･39

3.4 芳 香 族 カ ル ボ ン 酸 ア ミ ド 合 成 ････････ ･･････････････ ･･･････42

3.4.1 芳 香 族 カ ル ボ ン 酸 を ア デ ニ ル 化 可 能 な 酵 素 の 探 索 ･･ ･･ ･･ ･42

3.4.2 安 息 香 酸 一 置 換 体 に 対 す る 基 質 特 異 性 評 価 ･･･ ･･ ･ ･･･ ･ ･･ ･43

3.4.3 芳 香 族 カ ル ボ ン 酸 ア ミ ド 合 成 試 験 ････ ･････ ････ ･ ･･･ ･･･ ･45

3.5 結 言 ･･･････････････････････････････････････････ ････ ････50

III

第 4 章 AMP か ら の ATP 再 生 系 の 構 築 ････････････････････ ･･･････51

4.1 Class III PPK2 を 利 用 し た ATP 再 生 系 ･･･････････････ ･･･････52

4.1.1 利 用 酵 素 の 選 定 ･････････････ ･････････････････ ･ ･･･ ･･ ･52

4.1.2 ポ リ リ ン 酸 の 活 性 へ の 影 響 ･･･ ････ ･･････ ･･･････ ･･ ･･ ･･･53

4.1.3 ア ミ ノ ア シ ル プ ロ リ ン 合 成 へ の 適 用 ･･ ････ ････ ･ ･ ･･･ ･･ ･･55

4.1.4 ピ ロ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 添 加 効 果 ･･････ ･ ････ ････ ･ ･･･ ･･･ ･58

4.2 PPDK を 利 用 し た ATP 再 生 系 ･･････････ ･･･････････････････59

4.2.1 利 用 酵 素 の 選 定 ･････････････ ････ ･ ･････ ･･･ ･･ ･･ ･･ ･ ･･･ ･59

4.2.2 活 性 評 価 ･ ･ ･･･ ･ ･･･ ･ ･･･ ･ ･･･ ･ ････ ･･･ ･ ･････ ･･･ ･･･ ･･ ･･･ ･60

4.2.3 ア ミ ノ ア シ ル プ ロ リ ン 合 成 へ の 適 用 ･･ ････ ････ ･ ･･･ ･･･ ･･62

4.2.4 酵 素 濃 度 の 最 適 化 ･ ･･･ ･ ･･･ ･ ･･ ･･･ ･･･ ･････ ･･･ ･･･ ･･･ ･･･ ･65

4.3 結 言 ･････････････････ ･････････････････････････････ ･････68

第 5 章 総 括 ･････････････････････････････････････････････ ･････69

参 考 文 献 ･･･････ ･ ･ ･･･ ･ ･･･ ･ ･･･ ･･････ ･････････････････ ･･････ ････72

謝 辞 ･････････････ ･････････････････ ･････････････････ ･････ ･ ･･･ ･77

1 第 1 章 総 論

1 . 1 ア ミ ド 化 合 物

ア ミ ド 化 合 物 は 構 造 中 に ア ミ ド 結 合( − C O − N H − )を 有 し 、 含 窒 素 有 機 化 合 物 と し て 広 く 分 布 し て い る 。 自 然 界 に お い て は 、 ペ プ チ ド や タ ン パ ク 質 と し て 存 在 し 、 生 体 の 構 成 成 分 や 生 体 機 能 を 支 え る 機 能 性 分 子 と し て は た ら い て い る 。 ま た 、 ナ イ ロ ン や ポ リ ア ミ ド と い っ た 人 工 の 高 分 子 化 合 物 と し て も 存 在 し て い る 。 こ れ ら ア ミ ド 化 合 物 は 様 々 な 機 能 性 を 示 す こ と か ら 、 医 薬 品 や 生 理 活 性 ペ プ チ ド 、 機 能 性 食 品 添 加 剤 、香 料 と い っ た 医 薬 ・ 香 粧 品 分 野 や 、界 面 活 性 剤 、機 能 性 ポ リ マ ー と い っ た 化 成 品 分 野 な ど 様 々 な 用 途 に 用 い ら れ る ^{1 )}。 し た が っ て 、 産 業 上 有 用 な 化 合 物 で あ り 、 そ の 合 成 法 開 発 に は 大 き な 意 義 が あ る 。

1 . 2 ア ミ ド 化 合 物 合 成 法

ア ミ ド 化 合 物 の 合 成 法 は 有 機 合 成 化 学 の 技 術 を 中 心 に 利 用 し た 有 機 合 成 法 と 、 酵 素 の 特 性 を 利 用 し た 酵 素 法 の 二 つ に 大 別 さ れ る 。 以 下 に 各 合 成 法 に お け る 既 存 の 手 法 に つ い て 概 説 す る 。

1 . 2 . 1 有 機 合 成 法

ア ミ ド 結 合 は カ ル ボ キ シ 基 と ア ミ ノ 基 の 縮 合 に よ り 形 成 さ れ る が 、 単 に 両 者 を 混 合 す る の み で は 酸 塩 基 反 応 に よ り 塩 が 生 じ る の み で 、 熱 力 学 的 に 不 利 な 縮 合 反 応 は 進 行 し な い 。 1 6 0 ~ 1 8 0 ° C の 高 温 で 加 熱 す る こ と に よ り 縮 合 が 可 能 で あ る ^{2 )}が 、 エ ネ ル ギ ー 的 に 高 コ ス ト で あ り 、 熱 安 定 性 の 低 い 化 合 物 の 合 成 に は 適 用 で き な い 。

そ こ で 有 機 合 成 法 に よ る ア ミ ド 結 合 形 成 反 応 で は 、 反 応 性 の 低 い カ ル ボ キ シ 基 を よ り 反 応 性 の 高 い 分 子 種 に 活 性 化 し 、 ア ミ ノ 基 と 縮 合 さ せ る 手 法 が よ く 利 用 さ れ る 。 例 え ば 、 カ ル ボ ン 酸 と 塩 化 チ オ ニ ル や 塩 化 オ キ サ リ ル 等 の 塩 素 化 剤 に よ り 生 成 す る 酸 塩 化 物 は 反 応 性 が 高 く 、 酸 塩 化 物 と ア ミ ン を 塩 基 性 条 件 下 で 反 応 さ せ る ( S c h o t t e n - B a u m a n n r e a c t i o n )^{3 )}こ と で ア ミ ド 結 合 が 形 成 可 能 で あ る 。本 手 法 は 高

2

収 率 で あ る が 、 塩 素 化 剤 や 副 生 成 物 の 毒 性 、 副 反 応 の 進 行 な ど の 課 題 が あ る 。 ま た 、 縮 合 剤 ^{4 )}を 用 い て カ ル ボ ン 酸 を 活 性 エ ス テ ル へ と 変 換 し 、 ア ミ ン と 縮 合 す る 手 法 も よ く 利 用 さ れ て い る 。 近 年 で も ペ プ チ ド 合 成 に 用 い ら れ る 固 相 合 成 法 ( s o l i d - p h a s e p e p t i d e s yn t h e s i s ;

S P P S )^{5 )}は そ の 代 表 例 で あ る 。 本 手 法 は 高 収 率 で あ る 利 点 の 一 方 で 、

目 的 物 と 当 量 の 縮 合 剤 が 必 要 で あ り 、 そ の 結 果 当 量 の 副 生 成 物 が 生 じ る 。 さ ら に 希 望 の ペ プ チ ド を 得 る た め に は 副 反 応 を 抑 制 す る た め に 官 能 基 の 保 護 ・ 脱 保 護 の 過 程 が 追 加 で 必 要 と な る 。 い ず れ の 反 応 系 も カ ル ボ ン 酸 の 活 性 化 が 量 論 的 反 応 で あ る 点 が 課 題 の 一 つ で あ り 、 触 媒 的 手 法 が 求 め ら れ る 。

有 機 合 成 法 に お い て も 触 媒 的 ア ミ ド 合 成 法 が 報 告 さ れ て い る ^{6 )}。 ボ ロ ン 酸 触 媒 ^{7 )}は 毒 性 が 低 く 様 々 な カ ル ボ ン 酸 と ア ミ ン に 対 し て 縮 合 反 応 を 触 媒 的 に 進 行 さ せ る が 、反 応 温 度 が 8 5 ° C 以 上 と 高 く 、副 反 応 が 生 じ る 点 が 課 題 と な る 。 チ タ ン や 亜 鉛 、 ジ ル コ ニ ウ ム な ど を 中 心 金 属 と し た 金 属 錯 体 を 触 媒 と す る カ ル ボ ン 酸 と ア ミ ン の 縮 合 法 も 報 告 さ れ て い る が ^{6 )}、 反 応 の 効 率 化 の た め に は 高 温 条 件 が 必 要 で あ る 。ま た 、異 な る 金 属 種 を 利 用 す る こ と で 、ル テ ニ ウ ム 触 媒 を 用 い た ア ル コ ー ル の ア ミ ド 化 、 銅 触 媒 に よ る ア ル デ ヒ ド の ア ミ ド 化 、 マ ン ガ ン 触 媒 に よ る ア ル キ ン の ア ミ ド 化 な ど 、 カ ル ボ ン 酸 以 外 の ア シ ル 供 与 体 を 原 料 と し た 酸 化 的 ア ミ ド 合 成 手 法 も 報 告 さ れ て い る ^{1 )}。

以 上 の よ う に 有 機 合 成 法 に よ る ア ミ ド 合 成 で は 、 幅 広 い ア ミ ド 化 合 物 を 収 率 高 く 合 成 で き る も の の 、 量 論 的 反 応 で あ る こ と や 、 反 応 条 件 、 副 生 成 物 の 観 点 か ら 環 境 調 和 性 が 低 い 点 が 課 題 で あ る 。

3 1 . 2 . 2 酵 素 合 成 法

様 々 な 課 題 を 抱 え る 有 機 合 成 法 に 代 わ る 手 法 と し て 、 近 年 触 媒 的 反 応 で あ る 酵 素 反 応 を 利 用 し た 手 法 が 高 い 注 目 を 集 め て い る 。 多 様 な 種 類 の 酵 素 を 利 用 し た 手 法 が 研 究 ・ 開 発 さ れ て い る 。

ペ プ チ ダ ー ゼ や プ ロ テ ア ー ゼ と い っ た 加 水 分 解 酵 素 の 逆 反 応 を 利 用 し た 手 法 ^{8 , 9 )}で は 、カ ル ボ キ シ 基 お よ び ア ミ ノ 基 の 一 方 を 保 護 し た ア ミ ノ 酸 同 士 を 縮 合 可 能 で あ る 。 ペ プ チ ド 中 の ア ミ ノ 酸 の 順 序 を 規 定 す る た め に は 保 護 基 の 導 入 が 必 要 で あ る 点 が 課 題 で あ る 。 ハ イ ド ロ ラ ー ゼ を 用 い た ア ミ ノ リ シ ス 反 応 1 0 , 1 1 )で は ア ミ ノ 酸 エ ス テ ル と 無 保 護 の ア ミ ノ 酸 か ら ジ ペ プ チ ド が 合 成 可 能 で あ る 。C 末 端 側 と な る ア ミ ノ 酸 に つ い て は 保 護 が 不 要 で あ る が N 末 端 側 と な る ア ミ ノ 酸 の カ ル ボ キ シ 基 は 活 性 化 さ れ て い る 必 要 が あ る 点 が 課 題 で あ る 。 基 質 ア ミ ノ 酸 の 修 飾 が 不 要 な 方 法 と し て L-ア ミ ノ 酸 リ ガ ー ゼ や D-ア ラ ニ ン-D-ア ラ ニ ン リ ガ ー ゼ な ど の AT P 依 存 型 リ ガ ー ゼ 1 2 - 1 4 )が あ げ ら れ 、 遊 離 の ア ミ ノ 酸 か ら ジ ペ プ チ ド が 合 成 可 能 で あ る 。

い ず れ の 手 法 も 触 媒 的 反 応 、 温 和 な 反 応 条 件 、 廃 棄 物 が 比 較 的 少 な い 点 が 利 点 で あ る が 、 高 度 な 基 質 特 異 性 に よ り 合 成 可 能 な 化 合 物 が 限 定 さ れ る 課 題 が あ る 。

4

1 . 3 ア デ ニ ル 化 酵 素 を 利 用 し た ア ミ ド 結 合 形 成 反 応

自 然 界 に お い て は カ ル ボ キ シ 基 の 変 換 反 応 を 触 媒 す る ア デ ニ ル 化 酵 素 と 呼 ば れ る 酵 素 群 が 知 ら れ て い る 。 こ れ ら は AT P の エ ネ ル ギ ー を 用 い て 基 質 の カ ル ボ キ シ 基 を ア デ ニ ル 化 す る こ と で 活 性 化 す る 。 活 性 化 さ れ た カ ル ボ ン 酸 は 、 そ の 後 各 酵 素 の 反 応 特 性 に 従 っ て エ ス テ ル 結 合 や チ オ エ ス テ ル 結 合 、 あ る い は ア ミ ド 結 合 を 形 成 す る ( F i g .

1 . 1 )。 こ れ ら 2 段 階 の 反 応 の う ち 、1 段 階 目 の 反 応 に お い て 基 質 の カ

ル ボ キ シ 基 が ア デ ニ ル 化 に よ っ て 活 性 化 さ れ れ ば 、 求 核 性 の 高 い ア ミ ン を 共 存 さ せ る こ と で 化 学 的 な 求 核 置 換 反 応 が 進 行 し 、 ア ミ ド 結 合 を 形 成 す る( F i g . 1 . 2 )と 考 え た 。 低 分 子 の 求 核 剤 は 酵 素 の 基 質 特 異 性 の 影 響 を 受 け に く く 、 多 様 な ア ミ ン を 求 核 剤 と し て 用 い る こ と で 幅 広 い ア ミ ド 化 合 物 が 合 成 可 能 に な る と 推 察 し た 。 本 プ ロ セ ス は 既 存 の ア ミ ド 合 成 法 の 課 題 を 克 服 す る 触 媒 的 か つ 広 範 な ア ミ ド 化 合 物 の 合 成 に 適 用 可 能 な 環 境 調 和 性 の 高 い 新 規 プ ロ セ ス と な る と 考 え た 。

一 方 、 本 プ ロ セ ス の 課 題 が 2 点 挙 げ ら れ る 。1 点 目 は 、 カ ル ボ ン 酸 側 の 基 質 は 酵 素 の 基 質 特 異 性 の 影 響 を 強 く 受 け る 点 で あ る 。 ア ミ ン 側 の 基 質 と 比 較 し て そ の 自 由 度 は 低 く な る も の と 考 え ら れ る 。2 点 目 は ア デ ニ ル 化 反 応 に 必 要 な AT P が 高 価 な 化 合 物 で あ る た め 多 量 の 外 部 添 加 は プ ロ セ ス の 高 コ ス ト 化 に つ な が る 点 で あ る 。

F i g . 1 . 1 . R e a c t i o n m e c h a n i s m o f a d e n yl a t i o n e n z ym e .

F i g . 1 . 2 . A m i d e s yn t h e s i s c a t a l yz e d b y a d e n yl a t i o n e n z ym e .

AMP Adenylation

enzyme

ATP PPi

X=O, S, NH

AMP Adenylation

enzyme

ATP PPi

5

1 . 4 結 言

ア ミ ド 化 合 物 は 医 薬 品 や 化 成 品 な ど 、 産 業 上 重 要 な 有 用 化 合 物 が 多 く 、 そ の 効 率 的 な 合 成 法 の 開 発 に は 大 き な 意 義 が あ る 。 既 存 の 合 成 法 で は 、 縮 合 剤 が 不 要 な 触 媒 反 応 で あ る こ と 、 反 応 条 件 や 副 生 成 物 の 観 点 か ら 環 境 調 和 性 が 高 い こ と 、 多 様 な ア ミ ド 化 合 物 が 合 成 可 能 で あ る こ と 、 の 3 点 を 同 時 に 満 た す こ と の で き る 手 法 は 報 告 さ れ て い な か っ た 。

そ こ で 、 自 然 界 に お け る ア デ ニ ル 化 酵 素 に よ る カ ル ボ キ シ 基 の 変 換 反 応 に 着 目 し 、 ア デ ニ ル 化 酵 素 に よ る カ ル ボ キ シ 基 の ア デ ニ ル 化 に よ る 活 性 化 と 、 つ づ く ア ミ ン に よ る 求 核 置 換 反 応 に よ り ア ミ ド 結 合 を 形 成 す る 新 規 プ ロ セ ス を 考 え た 。 本 プ ロ セ ス で は ア ミ ン は 酵 素 の 基 質 特 異 性 の 影 響 を 受 け に く く 、 多 様 な ア ミ ン を 求 核 剤 と し て 用 い る こ と が 可 能 で あ る と 推 測 し て お り 、 酵 素 反 応 で あ り な が ら 多 様 な ア ミ ド 化 合 物 が 合 成 可 能 で あ る も の と 考 え ら れ る 。 し か し 、 本 プ ロ セ ス の 課 題 と し て 、 カ ル ボ ン 酸 側 の 基 質 特 異 性 と ア デ ニ ル 化 反 応 に 必 要 な AT P の 供 給 が 挙 げ ら れ る 。

本 研 究 で は 、 ア デ ニ ル 化 酵 素 を 利 用 し た ア ミ ド 化 合 物 生 産 プ ロ セ ス の 実 用 性 を 実 証 す る(第 2 章)と と も に 、 本 プ ロ セ ス の 課 題 解 決 に 向 け て 、 様 々 な 種 類 の ア デ ニ ル 化 酵 素 を 利 用 し た カ ル ボ ン 酸 側 基 質 の 拡 張(第 3 章)と 効 率 的 な AT P 供 給 法 の 開 発(第 4 章)を 検 討 し た 。

6

第 2 章 非 リ ボ ソ ー ム 型 ペ プ チ ド 合 成 酵 素 の ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン を 利 用 し た L-ア ミ ノ 酸 ア ミ ド 合 成

2 . 1 非 リ ボ ソ ー ム 型 ペ プ チ ド 合 成 酵 素

非 リ ボ ソ ー ム 型 ペ プ チ ド 合 成 酵 素( N R P S )は 細 菌 や カ ビ な ど の 微 生 物 が 産 生 す る ペ プ チ ド 系 抗 生 物 質 等 の 二 次 代 謝 産 物 の 生 合 成 に 関 与 す る 巨 大 酵 素 複 合 体 で あ る ^{1 5 )}。N R P S は 触 媒 機 能 の 異 な る ド メ イ ン と 呼 ば れ る 単 位 に よ り 構 成 さ れ る モ ジ ュ ー ル が 複 数 連 結 し た 構 造 を と っ て い る( F i g . 2 . 1 )。 こ れ ら が 順 番 に 作 用 す る こ と で ア ミ ノ 酸 を 原 料 と し て ペ プ チ ド が 合 成 さ れ る 。

N R P S に よ る ペ プ チ ド 合 成 に お い て 、 ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン( A ド メ

イ ン)は 基 質 ア ミ ノ 酸 の 認 識 と AT P 依 存 的 な ア デ ニ ル 化 に よ る 活 性 化 を 担 う 。 ア デ ニ ル 化 さ れ た ア ミ ノ 酸 は チ オ ー ル 化 ド メ イ ン( T ド メ

イ ン)上 の 4 ’ -ホ ス ホ パ ン テ テ イ ン に チ オ エ ス テ ル 結 合 を 介 し て 連 結

さ れ る 。続 い て 、縮 合 ド メ イ ン( C ド メ イ ン)に よ り ア ミ ノ 酸 同 士 が 縮 合 す る こ と で ペ プ チ ド 結 合 が 形 成 さ れ る 。

F i g . 2 . 1 . S t r u c t u r e o f N R P S .

ア デ ニ ル 化 酵 素 を 利 用 し た ア ミ ド 化 合 物 生 産 プ ロ セ ス の 開 発 に あ た り 、 本 章 で は こ の N R P S の A ド メ イ ン が 触 媒 す る 基 質 ア ミ ノ 酸 の ア デ ニ ル 化 に よ る 活 性 化 に 着 目 し 、 ア ミ ド 化 合 物 合 成 の 可 否 を 検 証 し た 。

7

2 . 2 ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン 単 独 で の 利 用

N R P S の ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン を 単 独 で 利 用 し た 例 と し て 、大 腸 菌 で

発 現 さ せ た t yr o c i d i n e s yn t h e t a s e 1 ( Ty c A )の A ド メ イ ン が L- P h e -L- P h e ,

L- P h e -L- A l a , L- P h e -L- P h e N H2, L- P h e -L- Le u N H2 の 合 成 を 触 媒 し た と の

報 告 ^{1 6 )}が あ る 。 し か し 、 本 報 告 は ア ミ ノ 酸 お よ び ア ミ ノ 酸 ア ミ ド の

組 み 合 わ せ の み で 、 生 成 物 は ジ ペ プ チ ド に 限 ら れ て い た 。

一 方 、 当 研 究 室 で は B re v i b a c i l l u s p a r a b re v i s IA M 1 0 3 1 由 来 の t yr o c i d i n e s yn t h e t a s e A の A ド メ イ ン( Tyc A - A )が L- Tr p -L- P r o を は じ め と す る 6 種 類 の ア ミ ノ ア シ ル プ ロ リ ン(L- X a a -L- P r o )が 合 成 可 能 で あ る こ と を 報 告 し て い る ^{1 7 )}。

複 数 の ア ミ ノ 酸 お よ び ア ミ ノ 酸 ア ミ ド が C 末 端 に 導 入 可 能 で あ る こ と か ら 、 こ れ ら の 反 応 に お け る ア ミ ド 結 合 形 成 は ア ミ ノ 基 に よ る 非 酵 素 的 な 求 核 置 換 反 応 に よ り 進 行 し て お り 、 ア ミ ノ 酸 の み な ら ず 一 般 的 な ア ミ ン を 利 用 し た 場 合 に も 成 立 す る も の と 推 測 し た ( F i g . 2 . 2 )。

F i g . 2 . 2 . A m i n o a c i d a m i d e s yn t h e s i s c a t a l yz e d b y A d o m a i n o f N R P S .

Amino acid Aminoacyl adenylate Amino acid amide

AMP A domain

ATP PPi

8

2 . 3 L-ア ミ ノ 酸 ア ミ ド 合 成 試 験

実 験 方 法

・Tyc A - A を 用 い た L- Tr p -N-ア ル キ ル ア ミ ド 合 成 試 験

Ta b l e 2 . 1 に 示 す 反 応 液 を 調 製 し 、3 7 ° C で 2 4 h 反 応 さ せ た 。求 核 剤

と し て は m e t h yl a m i n e , d i m e t h yl a m i n e , t r i m e t h yl a m i n e , β - A l a , γ - a m i n o b u t yr i c a c i d , a z e t i d i n e , p yr r o l i d i n e , p i p e r i d i n e , a z e p a n e , a z o c a n e ,

L- P r o , D- P r o , c i s- 4 - h yd r o x y-L- P r o , c i s- 4 - h yd r o x y-D- P r o , L- P r o N H2, L- a z e t i d i n e - 2 - c a r b o x yl i c a c i d の 1 6 種 類 の ア ミ ン を 利 用 し た 。

T a b l e 2 . 1 . R e a c t i o n m i x t u r e f o r L- T r p - N- a l k yl a m i d e s yn t h e s i s

C o m p o n e n t F i n a l c o n c n .

L- T r p 1 0 m M

N u c l e o p h i l e 1 0 m M

A T P 2 0 m M

M gS O4 2 0 m M

T yc A - A 0 . 1 m g / m L

T r i s - H C l ( p H 8 . 0 ) 5 0 m M 1 0 0 L

・H P LC 分 析

H P LC C h r o m a s t e r H P LC s ys t e m ( H IT A C H I)

C o l u m n X T e r r a M S C 1 8 2 . 5 m 4 . 6×2 0 m m IS c o l u m n ( W a t e r s )

O v e n 4 0° C

E l u e n t A : 0 . 1 % ( w / v ) f o r m i c a c i d i n H2O B : M e t h a n o l

W a v e l e n g t h 2 1 4 n m

9

T i m e ( m i n ) A ( % ) B ( % ) F l o w r a t e ( m L/ m i n )

0 1 0 0 0 1 . 0

2 . 0 1 0 0 0 1 . 0

1 2 . 0 0 1 0 0 1 . 0

1 2 . 1 1 0 0 0 1 . 0

1 5 . 0 1 0 0 0 1 . 0

・M S / M S 分 析

M S : T r i p l e T O F 4 6 0 0 m a s s s p e c t r o m e t e r ( S C IE X )

P o l a r i t y P o s i t i v e

Io n s p r a y b o l t a g e f l o a t i n g 5 . 5 k V D e c l u s t e r i n g p o t e n t i a l 8 0 V

S o u r c e t e m p . 0° C

D e s o l v a t i o n t e m p . 5 0 0° C Io n s o u r c e g a s 2 2 0 p s i C o l l i s i o n e n e r g y 3 0 V

A n a l ys i s A n a l ys t T F s o f t w a r e ( S C IE X )

実 験 結 果

H P LC 分 析 の 結 果 、3 級 ア ミ ン で あ る t r i m e t h yl a m i n e を 除 く す べ て

の ア ミ ン と の 反 応 で 目 的 と す る L- Tr p -N-ア ル キ ル ア ミ ド と 考 え ら れ る 新 規 ピ ー ク が 検 出 さ れ た 。 得 ら れ た 生 成 物 が 目 的 の ア ミ ド で あ る こ と を 明 ら か に す る た め に 、H P LC に て 分 取 ・ 精 製 し た 後 、M S 分 析 お よ び M S / M S 分 析 に よ る 構 造 決 定 を 行 っ た 。M S 分 析 の 結 果 、1 5 種 類 す べ て に つ い て プ ロ ト ン 化 さ れ た L- Tr p -N-ア ル キ ル ア ミ ド の 分 子 量 が 親 イ オ ン と し て 検 出 さ れ た( Ta b l e 2 . 2 )。 さ ら に 、M S / M S 分 析 に お い て は 、F i g . 2 . 3 に 示 す 2 種 類 の 結 合 開 裂 に よ り 生 成 す る フ ラ グ メ ン ト イ オ ン が 検 出 さ れ た( Ta b l e 2 . 2 )。 し た が っ て 、L- Tr p と 使 用 し た ア ミ ン の 間 に ア ミ ド 結 合 が 形 成 さ れ た L- Tr p -N-ア ル キ ル ア ミ ド が 生

10

成 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。本 結 果 は 基 質 L- Tr p が Tyc A - A に よ り ア デ ニ ル 化 さ れ た 後 、 各 種 ア ミ ン が 反 応 し ア ミ ド 結 合 を 形 成 す る と い う 仮 説 を 支 持 す る も の で あ り 、 予 測 通 り の 反 応 が 進 行 し て い る こ と が 実 証 で き た 。

F i g . 2 . 3 . F r a g m e n t a t i o n p a t t e r n o f t h e L- Tr p -N- a l k yl a m i d e . ( A ) Typ e 1 c l e a v a g e . ( B ) Typ e 2 c l e a v a g e .

Methylamine 218.1302 159.0923 58.0300 130.0655 87.0552 Dimethylamine 232.0858 159.0915 72.0446 130.0648 101.0705

β-Ala 276.1371 159.0930 116.0508 130.0674 145.0653

γ-Aminobutyric acid 290.1532 159.0934 130.0663 ND ND

Azetidine 244.1457 159.0927 84.0450 130.0657 113.0713 Pyrrolidine 258.1301 159.0916 98.0598 130.0646 127.0863 Piperidine 272.1783 159.0930 112.0767 130.0661 141.1038 Azepane 286.1944 159.0933 126.0927 130.0663 155.1198 Azocane 300.2090 159.0936 140.1087 130.0665 169.1350

L-Pro 302.1259 159.0916 142.0649 130.0649 171.0765

D-Pro 302.1566 159.0917 142.0647 130.0647 171.0760 cis-4-Hydroxy-L-Pro 318.1136 159.0910 ND 130.0642 187.0707 cis-4-Hydroxy-^D-Pro 318.1481 159.0934 ND 130.0662 187.0742

L-ProNH₂ 301.1682 159.0940 ND 130.0666 170.0626

L-Azetidine-2-carboxylic acid 288.1772 159.0918 128.0342 130.0649 157.0604 Table 2.2. MS detection of amide products formed by activation of L-Trp by TycA-A followed by nucleophilic substitution

aType 1 ^bType 2

ND, not detected

a Fragment ion generated by the cleavage described in Fig. 2.3A.

b Fragment ion generated by the cleavage described in Fig. 2.3B.

MS/MS fragment ion (m/z) Protonated

parent ion (m/z) Nucleophile

Type 1 cleavage

Type 2 cleavage (A)

(B)

11

生 成 し た 各 L- Tr p -N-ア ル キ ル ア ミ ド に つ い て 、 そ の 合 成 量 の 定 量 を 試 み た 。 得 ら れ た 生 成 物 の 多 く は 市 販 さ れ て お ら ず 、 直 接 的 な 定 量 が 不 可 能 で あ っ た た め 、 基 質 で あ る L- Tr p の 減 少 量 か ら 副 生 す る

L- Tr p -L- Tr p の 合 成 量 を 差 し 引 く こ と で 算 出 し た 。 そ の 結 果 、1 0 m M

の L- Tr p か ら 0 . 4 6 m M ~ 1 . 4 0 m M の L- Tr p -N-ア ル キ ル ア ミ ド が 生 成 し て お り 、 対 添 加 L- Tr p 収 率 と し て 4 . 6 % ~ 1 4 . 0 %で あ っ た( Ta b l e 2 . 3 )。

Methylamine 0.81 8.1

Dimethylamine 0.81 8.1

β-Ala 0.96 9.6

γ-Aminobutyric acid 1.16 11.6

Azetidine 0.82 8.2

Pyrrolidine ^{0.92 9.2}

Piperidine 1.40 14.0

Azepane 0.52 5.2

Azocane 1.35 13.5

L-Pro 0.82 8.2

D-Pro 0.46 4.6

cis-4-Hydroxy-L-Pro 0.94 9.4

cis-4-Hydroxy-D-Pro ^{0.78 7.8}

L-ProNH₂ 0.85 8.5

L-Azetidine-2-carboxylic acid 0.78 7.8

b Calculated against the added L-Trp concentration.

a Calculated from the amount of decrease in L-Trp minus the amount of L-Trp-L-Trp generation.

Table 2.3. Yield of amide products formed by activation of L-Trp by TycA-A followed by nucleophilic substitution

Nucleophile ^aProduct (mM) ^bConversion (%)

12

2 . 4 結 言

本 章 で は 、 ペ プ チ ド 系 抗 生 物 質 の 生 合 成 に 関 与 す る N R P S を 構 成 す る ド メ イ ン の 一 つ で 、 基 質 ア ミ ノ 酸 の ア デ ニ ル 化 を 触 媒 す る A ド メ イ ン に 着 目 し 、 ア ミ ド 合 成 プ ロ セ ス へ の 利 用 可 否 と 検 証 し た 。

Tyr o c i d i n e s yn t h e t a s e A の A ド メ イ ン で あ る Tyc A - A を 利 用 し 、 そ の 基 質 と な る L- Tr p に 対 し て 直 鎖 状 ア ミ ン 、環 状 ア ミ ン 、プ ロ リ ン 誘 導 体 な ど 種 々 の ア ミ ン を 求 核 剤 と し て 反 応 さ せ た 。 そ の 結 果 、 三 級 ア ミ ン を 除 く す べ て の ア ミ ン に 対 応 す る L- Tr p -N-ア ル キ ル ア ミ ド が 生 成 し た 。 し た が っ て 、 予 測 通 り N R P S の A ド メ イ ン に よ り ア デ ニ ル 化 さ れ た 基 質 ア ミ ノ 酸 に 対 し て ア ミ ン を 作 用 さ せ る こ と で 、 酵 素 の 基 質 特 異 性 の 影 響 を 受 け な い 化 学 的 な 求 核 置 換 反 応 に よ り ア ミ ド 結 合 が 形 成 さ れ る 新 規 な 反 応 が 進 行 す る こ と を 明 ら か に し た 。

13 第 3 章 合 成 可 能 な ア ミ ド 化 合 物 の 拡 張

本 章 で は 第 1 章 に て 挙 げ た ア デ ニ ル 化 酵 素 を 利 用 し た ア ミ ド 化 合 物 生 産 プ ロ セ ス の 課 題 の 一 つ で あ る カ ル ボ ン 酸 側 基 質 の 制 限 を 解 決 し 、 合 成 可 能 な ア ミ ド 化 合 物 を 拡 張 す る こ と を 目 的 と し た 。 異 な る 種 類 の カ ル ボ ン 酸 を 基 質 と す る ア デ ニ ル 化 酵 素 を 探 索 し 、 ア ミ ド 合 成 試 験 を 試 み た 。

14

3 . 1 D-ア ミ ノ 酸 含 有 ジ ペ プ チ ド 合 成

D-ア ミ ノ 酸 は 多 く の 生 体 分 子 を 構 成 す る L-ア ミ ノ 酸 の 光 学 異 性 体 で あ り 、物 理 的・化 学 的 性 質 は 同 一 で あ る が 生 物 学 的 性 質 は 異 な る 。 近 年 、D-ア ミ ノ 酸 や D-ア ミ ノ 酸 を 含 有 す る ペ プ チ ド の 生 理 的 意 義 や 生 理 活 性 に 関 す る 研 究 が 盛 ん に な り 、D-ア ミ ノ 酸 含 有 ジ ペ プ チ ド に は L-ア ミ ノ 酸 の み か ら な る ジ ペ プ チ ド よ り 高 い 機 能 や 異 な る 機 能 を 示 す も の が あ る と 報 告 さ れ て い る 。例 え ば 、D- G l u -D- T r p , D-G l u -

D- T r p , D- G l u -L- T r p , D-G l u -L- T r p は 骨 髄 造 血 幹 細 胞 の 増 殖 抑 制 効 果 を 示 す が 、L- G l u -L- T r p お よ び L-G l u - L- T r p に は 効 果 が な い

1 8 )。 環 状 ジ ペ プ チ ド で あ る c yc l o (D- T y r -D- P h e ) は c yc l o (L- T y r -L-

P h e )よ り も 高 い 抗 菌 活 性 や 抗 が ん 作 用 を 示 す ^{1 9 )}。ま た 、c yc l o (L- T r p -

D- P r o )は 心 拍 数 を 上 昇 さ せ る が c yc l o (D- T r p -L- P r o )は 低 下 さ せ る

2 0 )。 こ の よ う に D-ア ミ ノ 酸 含 有 ジ ペ プ チ ド は 様 々 な 生 理 活 性 を 示 す

有 用 化 合 物 で あ る が 、そ の 酵 素 的 な 合 成 法 に つ い て は 報 告 が 少 な く 、 多 様 な D-ア ミ ノ 酸 含 有 ジ ペ プ チ ド を 合 成 可 能 な 手 法 の 開 発 に は 大 き な 意 義 が あ る 。

本 節 で は 、 第 2 章 に て 述 べ た N R P S の A ド メ イ ン に よ る ア ミ ノ 酸 ア ミ ド 合 成 機 構 に 着 目 し た 。 本 機 構 の 2 段 階 目 の 反 応 で あ る ア ミ ン に よ る 求 核 置 換 反 応 は 非 酵 素 的 で あ り 、C 末 端 側 の ア ミ ノ 酸 と し て

D-体 と L-体 の 両 方 が 導 入 可 能 で あ る と 考 え ら れ る 。 ま た 、N 末 端 側 の ア ミ ノ 酸 は 1 段 階 目 の ア デ ニ ル 化 反 応 に よ り 規 定 さ れ る た め 、D- ア ミ ノ 酸 を 基 質 と し て ア デ ニ ル 化 可 能 な A ド メ イ ン を 利 用 す る こ と で 、D-ア ミ ノ 酸 を 導 入 可 能 で あ る と 考 え ら れ る 。 こ れ ら の 予 測 に 基 づ き D-ア ミ ノ 酸 含 有 ジ ペ プ チ ド の 合 成 可 否 を 検 証 し た 。

15

3 . 1 . 1 Tyc A - A の D-ア ミ ノ 酸 に 対 す る 基 質 特 異 性 評 価

実 験 方 法

・ 基 質 特 異 性 評 価

酵 素 に よ り ア デ ニ ル 化 さ れ た 基 質 と ヒ ド ロ キ シ ル ア ミ ン の 反 応 に よ り 生 成 す る ヒ ド ロ キ サ ム 酸 が F e^{3 +}存 在 下 で 波 長 4 9 0 n m の 吸 光 を 示 す こ と を 利 用 し た 簡 便 な 比 色 分 析 法( F i g . 3 . 1 )^{1 7 )}を 用 い た 。 本 手 法 に よ り 有 意 な 吸 光 度 が 検 出 さ れ れ ば 、 ヒ ド ロ キ サ ム 酸 が 合 成 さ れ て お り 、 す な わ ち 基 質 が ア デ ニ ル 化 さ れ て い る と 判 断 可 能 で あ る 。

F i g . 3 . 1 . H yd r o x a m a t e - b a s e d c o l o r i m e t r i c a s s a y.

Ta b l e 3 . 1 に 示 す 反 応 液 を 調 製 し 、3 7 ° C で 2 4 h 反 応 さ せ た 。8 %ト

リ ク ロ ロ 酢 酸 1 0 0 L に よ り 反 応 停 止 後 、3 . 4 % F e C l3 i n 2 M H C l を

1 0 0 L 添 加 し て 呈 色 さ せ た 。遠 心 分 離 後 、上 清 1 0 0 L を マ イ ク ロ プ

レ ー ト リ ー ダ ー に て 4 9 0 n m の 吸 光 度 を 測 定 し た 。

T a b l e 3 . 1 . R e a c t i o n m i x t u r e f o r h yd r o x a m a t e - b a s e d c o l o r i m e t r i c a s s a y

C o m p o n e n t F i n a l c o n c n .

D- X a a 5 m M

H yd r o x yl a m i n e 2 0 0 m M

A T P 1 0 m M

M gS O4 1 0 m M

T yc A - A 1 . 0 m g / m L

T r i s - H C l ( p H 8 . 0 ) 5 0 m M 2 0 0 L

ATP

PPi AMP

+ ^NH2OH

Fe³⁺

Adenylation enzyme

l_max=490 nm

16 実 験 結 果

Tyc A - A が 一 部 の D-ア ミ ノ 酸 を 基 質 に で き る と い う 知 見 の 基 、改 め

て タ ン パ ク 質 構 成 性 ア ミ ノ 酸 の D-体 お よ び D- O r n に 対 し て 基 質 特 異 性 評 価 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、Tyc A - A は D- A l a , D- Tr p , D- Tyr, D- P h e , D-

Le u , D- M e t の 6 種 類 の D-ア ミ ノ 酸 を 基 質 と す る こ と が 明 ら か と な っ

た 。本 結 果 よ り 、Tyc A - A を 利 用 す る こ と で こ れ ら 6 種 類 の D-ア ミ ノ 酸 を N 末 端 に 配 す る ジ ペ プ チ ド が 合 成 可 能 で あ る も の と 考 え ら れ る 。

F i g . 3 . 2 . S u b s t r a t e s p e c i f i c i t y o f Tyc A - A t o w a r d D- a m i n o a c i d s . F i l l e d b a r s , r e a c t i o n m i x t u r e w i t h Tyc A - A ; o p e n b a r s , r e a c t i o n m i x t u r e w i t h o u t Ty c A - A .

17

3 . 1 . 2 Tyc A - A に よ る ジ ペ プ チ ド 合 成

実 験 方 法

・X a a - P r o 合 成

C 末 端 側 ア ミ ノ 酸 を 2 級 ア ミ ン で あ り 求 核 性 が 高 い と 推 測 さ れ る

P r o に 固 定 し 、N 末 端 側 ア ミ ノ 酸 に は 3 . 1 . 1 に て Tyc A - A の 基 質 と な

る と 判 明 し た 6 種 類 の ア ミ ノ 酸 を 用 い た 。 い ず れ の ア ミ ノ 酸 も D-体 お よ び L-体 を 用 い て D D-体 、D L-体 、L D-体 の 3 種 類 の D-ア ミ ノ 酸 含 有 ジ ペ プ チ ド 合 成 を 行 っ た 。Ta b l e 3 . 2 に 示 す 反 応 液 を 調 製 し 、3 7 ° C

で 2 4 h 反 応 さ せ た 。

T a b l e 3 . 2 . R e a c t i o n m i x t u r e f o r D D- ,

D L- , L D- d i p e p t i d e s yn t h e s i s b y T yc A - A C o m p o n e n t F i n a l c o n c n .

D- X a a o r L- X a a 1 0 m M

D- P r o o r L- P r o 1 0 0 m M

A T P 2 0 m M

M gS O4 2 0 m M

T yc A - A 1 . 0 m g / m L

T r i s - H C l ( p H 8 . 0 ) 5 0 m M 2 0 0 L

・D- Tr p -D- X a a 合 成

N 末 端 側 ア ミ ノ 酸 を Tyc A - A が 基 質 と す る D- Tr p に 固 定 し 、C 末 端 側 ア ミ ノ 酸 を タ ン パ ク 質 構 成 性 ア ミ ノ 酸 の D-体 お よ び D- O r n と し て 、 C 末 端 側 に 任 意 を D-ア ミ ノ 酸 を 配 す る D- Tr p -D- X a a の 合 成 を 試 み た 。

Ta b l e 3 . 3 に 示 す 反 応 液 を 調 製 し 、3 7 ° C で 2 4 h 反 応 さ せ た 。

18

T a b l e 3 . 3 . R e a c t i o n m i x t u r e f o r D- T r p -D- X a a s yn t h e s i s b y T yc A - A

C o m p o n e n t F i n a l c o n c n .

D- T r p 1 0 m M

D- X a a 1 0 m M

A T P 2 0 m M

M gS O4 2 0 m M

T yc A - A 1 . 0 m g / m L

T r i s - H C l ( p H 8 . 0 ) 5 0 m M 2 0 0 L

・H P LC 分 析

H P LC C h r o m a s t e r H P LC s ys t e m ( H IT A C H I)

C o l u m n X T e r r a M S C 1 8 2 . 5 m 4 . 6×2 0 m m IS c o l u m n ( W a t e r s )

O v e n 4 0° C

E l u e n t A : 0 . 1 % ( w / v ) f o r m i c a c i d i n H2O

B : 0 . 1 % ( w / v ) f o r m i c a c i d i n a c e t o n i t r i l e W a v e l e n g t h 2 1 4 n m

T i m e ( m i n ) A ( % ) B ( % ) F l o w r a t e ( m L/ m i n )

0 1 0 0 0 1 . 0

1 5 . 0 8 0 2 0 1 . 0

1 5 . 1 0 1 0 0 1 . 0

1 7 . 0 0 1 0 0 1 . 0

1 7 . 1 1 0 0 0 1 . 0

2 0 . 0 1 0 0 0 1 . 0

19

・LC - M S / M S 分 析

U P LC A c q u i t y U P LC s ys t e m ( W a t e r s )

C o l u m n A c q u i t y U P LC B E H C 1 8 1 . 7 μ m 2 . 1×1 0 0 m m ( W a t e r s ) O v e n 4 0° C

E l u e n t A : 0 . 1 % ( w / v ) f o r m i c a c i d i n a c e t o n i t r i l e B : 0 . 1 % ( w / v ) f o r m i c a c i d i n H2O

T i m e ( m i n ) A ( % ) B ( % ) F l o w r a t e ( m L/ m i n )

0 5 9 5 0 . 2 5

1 . 0 5 9 5 0 . 2 5

1 6 . 0 2 0 8 0 0 . 2 5

1 6 . 1 9 5 5 0 . 2 5

1 9 . 0 9 5 5 0 . 2 5

1 9 . 1 5 9 5 0 . 2 5

2 2 . 0 5 9 5 0 . 2 5

M S X e v o G 2 - X S Q t o f M S s ys t e m ( W a t e r s )

P o r a r i t y P o s i t i v e

C a p i l l a r y 0 . 5 k V

S a m p l i n g c o n e 2 0 S o u r c e t e m p . 1 2 0° C D e s o l v a t i o n t e m p . 4 5 0° C

D e s o l v a t i o n g a s f l o w 8 0 0 L/ h o u r C o l l i s i o n e n e r g y 6

A n a l ys i s M a s s L yn x

20 実 験 結 果

・X a a - P r o 合 成

反 応 液 の H P LC 分 析 の 結 果 、A l a と P r o を 用 い た 3 種 類 の 反 応 液 で は 新 規 ピ ー ク は 検 出 さ れ な か っ た が 、他 の 1 5 種 類 の 反 応 液 で は 新 規 ピ ー ク が 検 出 さ れ た 。 こ れ ら の 生 成 物 が 目 的 と す る D- X a a -D- P r o , D- X a a -L- P r o , L- X a a -D- P r o で あ る か を 確 認 す る た め に L C - M S 分 析 を 行 っ た 。 併 せ て 、H P LC 分 析 で は A l a - P r o の 検 出 が 難 し か っ た と 考 え 、

LC - M S 分 析 に 供 し た 。M S 分 析 の 結 果 、A l a - P r o も 含 め た す べ て の 組

み 合 わ せ で 、 プ ロ ト ン 化 さ れ た X a a - P r o の 分 子 量 と 一 致 す る ピ ー ク を 検 出 し た( Ta b l e 3 . 4 )。 本 結 果 よ り 、Tyc A - A が ア デ ニ ル 化 可 能 な D- 体 お よ び L-体 の ア ミ ノ 酸 を 用 い 、 キ ラ リ テ ィ の 影 響 を 受 け な い 非 酵 素 的 な 求 核 置 換 反 応 と 組 み 合 わ せ る こ と で 、 使 用 す る ア ミ ノ 酸 の キ ラ リ テ ィ を 反 映 し た ジ ペ プ チ ド が 合 成 可 能 で あ る こ と を 明 ら か に し た 。

D-Ala D-Pro 7.70 187.1085

D-Ala L-Pro 8.52 187.1082

L-Ala D-Pro 8.47 187.1084

D-Leu ^D-Pro 3.45 229.1555

D-Leu L-Pro 4.60 229.1535

L-Leu D-Pro 4.57 229.1529

D-Met D-Pro 1.59 247.1118

D-Met ^L-Pro 3.27 247.1116

L-Met D-Pro 3.19 247.1118

D-Phe D-Pro 4.89 263.1396

D-Phe L-Pro 6.28 263.1396

L-Phe ^D-Pro 6.29 263.1396

D-Tyr D-Pro 2.73 279.1348

D-Tyr L-Pro 3.61 279.1347

L-Tyr D-Pro 3.65 279.1343

D-Trp ^D-Pro 6.35 302.1507

D-Trp L-Pro 6.97 302.1503

L-Trp D-Pro 6.96 302.1501

Table 3.3. MS detection of Xaa-Pro synthesized by TycA-A Substrate Nucleophile Retention time

(min)

Protonated ion (m/z)

21

・D- Tr p -D- X a a 合 成

H P LC 分 析 の 結 果 、C 末 端 に い ず れ の ア ミ ノ 酸 を 利 用 し た 反 応 液 に

お い て も 、新 規 ピ ー ク を 検 出 す る こ と が で き た 。一 方 で 、D- P h e の よ

う な Tyc A - A の 基 質 と な る D-ア ミ ノ 酸 を 用 い た 場 合 に は 複 数 の ピ ー

ク が 検 出 さ れ 、 結 合 順 序 の 異 な る D- P h e -D- Tr p や ホ モ ジ ペ プ チ ド D-

P h e -D- P h e が 副 生 し て い る も の と 考 え ら れ る 。 目 的 と す る D- Tr p -D-

X a a が 合 成 さ れ て い る か を 確 認 す る た め 、LC - M S 分 析 お よ び LC -

M S / M S 分 析 に よ る 構 造 決 定 を 行 っ た 。M S 分 析 の 結 果 、 す べ て の 反

応 液 で プ ロ ト ン 化 さ れ た D- Tr p -D- X a a に 対 応 す る 分 子 量 が 親 イ オ ン と し て 検 出 さ れ た( Ta b l e 3 . 5 )。 さ ら に 、M S / M S 分 析 の 結 果 、F i g . 3 . 3 に 示 す 結 合 開 裂 に よ り 生 じ る フ ラ グ メ ン ト イ オ ン が 検 出 さ れ た

( Ta b l e 3 . 5 )。 し た が っ て 、C 末 端 側 ア ミ ノ 酸 と し て 利 用 し た D- X a a に

対 応 す る D- Tr p -D- X a a が 合 成 さ れ て い る と 判 断 で き 、 任 意 の D-ア ミ ノ 酸 を C 末 端 に 導 入 可 能 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。

22

F i g . 3 . 3 . F r a g m e n t a t i o n p a t t e r n o f t h e D- Tr p -D- X a a . ( A ) Typ e 1 c l e a v a g e . ( B ) Typ e 2 c l e a v a g e .

Gly D-Trp-Gly 262.1198 130.0657 131.0455 159.0923 102.0208

D-Ala ^D-Trp-^D-Ala 276.1350 130.0654 145.0613 159.0922 116.0366

D-Val ^D-Trp-^D-Val 304.1670 130.0659 173.0920 159.0925 144.0568

D-Leu D-Trp-D-Leu 318.1820 130.0662 187.1096 159.0926 158.0842

D-Ile D-Trp-D-Ile 318.1822 130.0662 187.1113 159.0925 158.0848

D-Ser D-Trp-D-Ser 292.1301 130.0658 ND 159.0923 132.0275

D-Thr D-Trp-D-Thr 306.1461 130.0649 175.0734 159.0924 146.0477

D-Cys D-Trp-D-Cys 308.1074 130.0657 177.0330 159.0923 148.0041

D-Met D-Trp-D-Met 336.1389 130.0659 205.0646 159.0925 176.0442

D-Pro ^D-Trp-^D-Pro 302.1511 130.0658 171.0704 159.0924 142.0486

D-Asn ^D-Trp-^D-Asn 319.1412 130.0659 188.0706 159.0925 159.0454

D-Gln D-Trp-D-Gln 333.1566 130.0640 202.0828 159.0924 173.0520

D-Asp D-Trp-D-Asp 320.1253 130.0658 189.0513 159.0924 160.0189

D-Glu D-Trp-D-Glu 334.1406 130.0656 203.0622 159.0923 174.0465

D-Lys D-Trp-D-Lys 333.1932 130.0659 202.1197 159.0924 173.0971

D-Arg D-Trp-D-Arg 361.1990 130.0658 230.1257 159.0924 201.0988

D-His D-Trp-D-His 342.1568 130.0659 211.0900 159.0921 182.0624

D-Phe ^D-Trp-^D-Phe 352.1667 130.0659 221.0918 159.0925 192.0658

D-Tyr ^D-Trp-^D-Tyr 368.1612 130.0657 237.0898 159.0923 208.0615

a Fragment ion generated by the cleavage described in Fig. 3.3A.

b Fragment ion generated by the cleavage described in Fig. 3.3B.

aType 1 ^bType 2

ND, not detected.

Table 3.5. MS detection of D-Trp-D-Xaa synthesized by TycA-A Nucleophile Putative

product

Protonated parent ion

(m/z)

MS/MS fragment ion (m/z)

Type 1 cleavage

Type 2 cleavage (A)

(B)

23

3 . 1 . 3 D-ア ミ ノ 酸 を 基 質 と す る 新 規 ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン の 探 索

Tyc A - A で の 検 討 結 果 よ り 、D-ア ミ ノ 酸 を 基 質 と す る A ド メ イ ン を

用 い る こ と で D-ア ミ ノ 酸 含 有 ジ ペ プ チ ド が 合 成 可 能 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 そ こ で 、 さ ら に 合 成 可 能 な ジ ペ プ チ ド の 幅 を 広 げ る た め に 、D-ア ミ ノ 酸 を 基 質 と す る 新 規 A ド メ イ ン を 探 索 し た 。

探 索 に 当 た り 、” E ド メ イ ン の 上 流 に 位 置 す る A ド メ イ ン は L-ア ミ ノ 酸 の み な ら ず D-ア ミ ノ 酸 も 基 質 と す る”と い う 仮 説 を 立 て た 。多 く の A ド メ イ ン は L-ア ミ ノ 酸 の み を 基 質 と し 、二 次 代 謝 産 物 中 に D-ア ミ ノ 酸 を 導 入 す る 際 に は A ド メ イ ン に よ る L-ア ミ ノ 酸 の 活 性 化 、T ド メ イ ン へ の ロ ー ド 、E ド メ イ ン に よ る D-体 へ の 変 換 を 経 て C ド メ イ ン に よ り 縮 合 さ れ る ^{2 1 )}。 こ の 機 構 を 考 慮 す る と 、 一 般 的 な A ド メ イ ン が D-ア ミ ノ 酸 を ア デ ニ ル 化 す る と C ド メ イ ン に よ る 縮 合 の 際 に 基 質 特 異 性 の 影 響 で 反 応 が 停 止 す る が 、E ド メ イ ン の 上 流 の A ド メ イ ン が D-ア ミ ノ 酸 を ア デ ニ ル 化 す る 場 合 C ド メ イ ン に よ る 縮 合 に 影 響 は 出 な い 。 し た が っ て 、E ド メ イ ン の 存 在 が 目 的 と す る A ド メ イ ン の 探 索 に お い て 重 要 な 指 標 に な る も の と 推 測 し 、 上 述 の 仮 説 に 至 っ た 。こ れ ま で に D-ア ミ ノ 酸 を 基 質 と す る と 報 告 の あ る A ド メ イ ン

2 2 , 2 3 )や Tyc A - A に つ い て も 本 仮 説 に は 矛 盾 し な い 。

本 仮 説 に 基 づ き 、t yr o c i d i n e s yn t h e t a s e の A ド メ イ ン で あ る Tyc A - A ( F i g . 3 . 4 A )に 加 え て 、 B a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s N B R C 1 2 1 9 9 由 来 の b a c i t r a c i n s yn t h e t a s e^{2 2 )}の A ド メ イ ン で あ る B a c B 2 - A , B a c C 4 - A ( F i g . 3 . 4 B ) お よ び P a e n i b a c i l l u s t h i a m i n o l y t i c u s O S Y- S E 由 来 p a e n i b a c t e r i n s yn t h e t a s e^{2 3 )} の ホ モ ロ グ P a e n i b a c i l l u s a l v e i N B R C 3 3 4 3 由 来 p a e n i b a c t e r i n s yn t h e t a s e の A ド メ イ ン で あ る P b t A 1 - A , P b t B 2 - A , P b t B 3 - A ( F i g . 3 . 4 C )の 計 5 つ の A ド メ イ ン を 候 補 と し て 選 択 し た 。

24

F i g . 3 . 5 . M o d u l e o rg a n i z a t i o n o f t yr o c i d i n e s yn t h e t a s e ( A ) , b a c i t r a c i n s yn t h e t a s e ( B ) , a n d p a e n i b a c t e r i n s yn t h e t a s e ( C ) . Ta rg e t e d A d o m a i n s a r e h i g h l i g h t e d .

3 . 1 . 4 候 補 ア デ ニ ル 化 ド メ イ ン の 基 質 特 異 性 評 価

候 補 と し て 選 択 し た 5 つ の A ド メ イ ン を 用 い て D-ア ミ ノ 酸 お よ び

L-ア ミ ノ 酸 に 対 す る 基 質 特 異 性 評 価 を 行 っ た 。手 法 は 3 . 1 . 2 に お い て

Tyc A - A を 対 象 と し た 場 合 と 同 様 で あ る 。

基 質 特 異 性 評 価 の 結 果 、B a c B 2 - A , P b t A 1 - A , P b t B 2 - A は L- Lys の み な ら ず D- Lys を も 基 質 と す る こ と が 明 ら か と な っ た( F i g. 3 . 6 A C D , F i g . 3 . 7 A C D )。 一 方 で B a c C 4 - A お よ び P b t B 3 - A は そ れ ぞ れ L- A s p、L- S e r の み を 基 質 と し た( F i g . 3 . 6 B E , F i g . 3 . 7 B E )。

Tyc A - A を 含 め る と 試 験 し た 6 つ の A ド メ イ ン の う ち 、4 つ が 仮 説

通 り L-ア ミ ノ 酸 と D-ア ミ ノ 酸 の 両 方 を 基 質 と し て お り 、 完 全 と は 言 え な い が 有 効 な 探 索 方 法 で あ っ た と 考 え ら れ た 。

T C Asn

C Gln T C Tyr T C Val T C Orn T C Leu T E T E

Phe C Pro T C PheT CPhe T E

module 5 module 6 module 7 module 8 module 3 module 4

module 1 module 2 module 9 module 10

TycA-A

TycA TycB TycC

Ile T C Cys T C Leu T C Glu T E C Ile T module 3 module 4 module 1 module 2

BacA

module 5

T C Lys

C Orn T E

BacB2-A module 6 module 7

BacB

C Ile T C PheT E C His T C Asp T E C Lys T module 10 module 11

BacC

module 12 module 8 module 9

BacC4-A

C Val T C LysT E C Ser T E C Ile T C Pro T PbtB2-A PbtB3-A

module 8 PbtB

module 6 module 7 module 9module 10

T C

C Val Lys T C Ile T module 13 module 12 module 11

PbtC

Orn T C Val T C Thr T C Orn T E C Ser T

C E

PbtA1-A

module 3 module 4

module 2 module 5

module 1

PbtA (A)

(B)

(C)

25

F i g . 3 . 6 . S u b s t r a t e s p e c i f i c i t y o f A d o m a i n s t o w a r d D- a m i n o a c i d s . ( A ) B a c B 2 - A , ( B ) B a c C 4 - A , ( C ) P b t A 1 - A , ( D ) P b t B 2 - A , ( E ) P b t B 3 - A . F i l l e d b a r s , w i t h e n z ym e ; o p e n b a r s , w i t h o u t e n z ym e .

F i g . 3 . 7 . S u b s t r a t e s p e c i f i c i t y o f A d o m a i n s t o w a r d L- a m i n o a c i d s . ( A ) B a c B 2 - A , ( B ) B a c C 4 - A , ( C ) P b t A 1 - A , ( D ) P b t B 2 - A , ( E ) P b t B 3 - A . F i l l e d b a r s , w i t h e n z ym e ; o p e n b a r s , w i t h o u t e n z ym e .

26

3 . 1 . 5 B a c B 2 - A に よ る ジ ペ プ チ ド 合 成

実 験 方 法

・D- Lys -D- X a a 合 成

D-ア ミ ノ 酸 を 基 質 と す る 新 規 A ド メ イ ン の 探 索 に て 見 出 し た 3 つ の A ド メ イ ン は い ず れ も D- Lys を 基 質 と し た 。 そ こ で 、 代 表 と し て B a c B 2 - A を 用 い て D- Lys -D- X a a の 合 成 を 試 み た 。Ta b l e 3 . 6 に 示 す 反 応 液 を 調 製 し 、3 7 ° C で 2 4 h 反 応 さ せ た 。

T a b l e 3 . 6 . R e a c t i o n m i x t u r e f o r D- L ys -D- X a a s yn t h e s i s b y B a c B 2 - A

C o m p o n e n t F i n a l c o n c n .

D- L ys 1 0 m M

D- X a a 1 0 m M

A T P 2 0 m M

M gS O4 2 0 m M

B a c B 2 - A 1 . 0 m g / m L

T r i s - H C l ( p H 8 . 0 ) 5 0 m M 2 0 0 L

・LC - M S / M S 分 析

U P LC A c q u i t y U P LC s ys t e m ( W a t e r s )

C o l u m n A c q u i t y B E H A m i d e 1 . 7 μ m 2 . 1×1 0 0 m m ( W a t e r s ) O v e n 3 0° C

E l u e n t A : 1 0 m M C H3C O O N H4 ( p H 1 0 . 0 a d j u s t e d w i t h N H3) i n a c e t n i t r i l e : H2O = 9 5 : 5

B : 1 0 m M C H3C O O N H4 ( p H 1 0 . 0 a d j u s t e d w i t h N H3) i n a c e t n i t r i l e : H2O = 4 0 : 6 0

27

M S X e v o G 2 - X S Q t o f M S s ys t e m ( W a t e r s )

P o r a r i t y P o s i t i v e

C a p i l l a r y 0 . 5 k V

S a m p l i n g c o n e 2 0

S o u r c e t e m p . 1 2 0℃

D e s o l v a t i o n t e m p . 3 0 0℃

D e s o l v a t i o n g a s f l o w 1 0 0 0 L/ h o u r C o l l i s i o n e n e r g y 6

A n a l ys i s M a s s L yn x

実 験 結 果

反 応 液 は LC - M S 分 析 お よ び LC - M S / M S 分 析 に 供 し 、生 成 物 の 確 認 お よ び 構 造 決 定 を 行 っ た 。M S 分 析 の 結 果 、す べ て の 反 応 液 で プ ロ ト ン 化 さ れ た D- Lys -D- X a a に 対 応 す る 分 子 量 が 親 イ オ ン と し て 検 出 さ れ た( Ta b l e 3 . 7 )。 さ ら に 、M S / M S 分 析 の 結 果 、F i g . 3 . 8 に 示 す 結 合 開 裂 に よ り 生 じ る フ ラ グ メ ン ト イ オ ン が 検 出 さ れ た( Ta b l e 3 . 7 )。し た が っ て 、B a c B 2 - A を 利 用 し た D- Lys -D- X a a 合 成 反 応 に お い て も C 末 端 側 ア ミ ノ 酸 と し て 用 い た D- X a a に 対 応 す る ジ ペ プ チ ド が 生 成 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。

T i m e ( m i n ) A ( % ) B ( % ) F l o w r a t e ( m L/ m i n )

0 8 0 2 0 0 . 2 0

1 . 0 8 0 2 0 0 . 2 0

1 6 . 0 2 8 7 2 0 . 2 0

2 2 . 0 2 8 7 2 0 . 2 0

2 2 . 1 8 0 2 0 0 . 2 0

2 8 . 0 8 0 2 0 0 . 2 0

28

F i g . 3 . 8 . F r a g m e n t a t i o n p a t t e r n o f t h e D- Lys -D- X a a . ( A ) Typ e 1 c l e a v a g e . ( B ) Typ e 2 c l e a v a g e .

Gly D-Lys-Gly 204.1352 84.0814 ND 129.1030 74.0268

D-Ala ^D-Lys-^D-Ala 218.1507 84.0815 116.0360 129.1027 88.0403

D-Val ^D-Lys-^D-Val 333.1928 84.0814 231.0796 129.1025 203.0820

D-Leu D-Lys-D-Leu 278.1542 84.0814 176.0419 129.1028 148.0455

D-Ile D-Lys-D-Ile 260.1974 84.0812 ND 129.1031 130.0863

D-Ser D-Lys-D-Ser 248.1612 84.0815 146.0462 129.1028 118.0549

D-Thr D-Lys-D-Thr 246.1817 84.0811 144.0621 129.1025 116.0713

D-Cys D-Lys-D-Cys 250.1228 84.0824 147.9908 129.1015 120.0120

D-Met D-Lys-D-Met 261.1563 84.0816 159.0387 129.1031 131.0510

D-Pro ^D-Lys-^D-Pro 275.1719 84.0810 173.0522 129.1024 ND

D-Asn ^D-Lys-^D-Asn 244.1660 84.0812 142.0518 129.1027 114.0555

D-Gln D-Lys-D-Gln 151.0849 84.0815 230.1219 129.1030 173.1073

D-Asp D-Lys-D-Asp 262.1405 84.0811 ND 129.1029 132.0318

D-Glu D-Lys-D-Glu 276.1559 84.0814 ND 129.1028 146.0456

D-Arg D-Lys-D-Arg 234.1444 84.0814 132.0218 129.1023 104.0391

D-His D-Lys-D-His 284.1728 84.0805 182.0543 129.1041 154.0724

D-Phe D-Lys-D-Phe 294.1820 84.0813 192.0709 129.1027 164.0713

D-Tyr ^D-Lys-^D-Tyr 310.1769 84.0818 208.0622 129.1024 180.0598

D-Trp ^D-Lys-^D-Trp 333.1928 84.0814 231.0796 129.1025 203.0820

a Fragment ion generated by the cleavage described in Fig. 3.8A.

b Fragment ion generated by the cleavage described in Fig. 3.8B.

aType 1 ^bType 2

ND, not detected.

Table 3.7. MS detection of D-Lys-D-Xaa synthesized by BacB2-A Nucleophile Putative

product

Protonated parent ion

(m/z)

MS/MS fragment ion (m/z)

Type 1 cleavage

Type 2 cleavage (A)

(B)