「農研機構」は国立研究開発法人
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「農研機構」は国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構のコミュニケーションネームです。農業・食品産業技術総合研究機構のコミュニケーションネームです。農業・食品産業技術総合研究機構のコミュニケーションネームです。農業・食品産業技術総合研究機構のコミュニケーションネームです。
肝クッパ − 細胞を簡便・大量に 回収できる新規培養方法
農研機構 動物衛生研究所 病態研究領域 上席研究員
山中 典子
© 2016 National Agriculture and Food Research Organization.
肝臓マクロファージ（クッパー細胞）
肝臓マクロファージ（クッパー細胞）
肝臓マクロファージ（クッパー細胞）
肝臓マクロファージ（クッパー細胞）
肝実質細胞 肝実質細胞肝実質細胞 肝実質細胞 星細胞
星細胞 星細胞 クッパー細胞 星細胞
クッパー細胞クッパー細胞 クッパー細胞 内皮細胞
内皮細胞 内皮細胞 内皮細胞
類洞 類洞 類洞 類洞
（毛細血管）
（毛細血管）
（毛細血管）
（毛細血管）
肝非実質細胞 肝非実質細胞肝非実質細胞 肝非実質細胞
本技術開発の背景（ 1 ）
サイトカイン等の生理活性物質の分泌
（ TNF α TGF- β IL-1 α IL-1 β IL-6 IL-10 IL-12 など、増殖因子も ）
• 炎症作用の調節（亢進、抑制）
• 肝繊維化
• 毒性メディエーター機能（薬物の作用でサイトカインを分泌、肝 実質細胞等に毒性作用をあらわす）
本技術開発の背景（２）
クッパ − 細胞の機能
貪食
• 細菌等の異物を貪食、処理
• 貪食した異物の情報を抗原提示
• 陳旧化した赤血球など、自己細胞の貪食を行うこともある
• 自己免疫疾患との関連も
3
肝臓 肝臓 肝臓 肝臓
コラゲナーゼ灌流 コラゲナーゼ灌流コラゲナーゼ灌流 コラゲナーゼ灌流
細胞分散 細胞分散 細胞分散
細胞分散 低速遠心低速遠心低速遠心低速遠心
肝実質細胞 肝実質細胞 肝実質細胞
肝実質細胞 遠心力遠心力遠心力遠心力 エルトリエーション遠心 エルトリエーション遠心エルトリエーション遠心 エルトリエーション遠心
従来法の問題点 従来法の問題点 従来法の問題点 従来法の問題点
（１）特殊な遠心分離装置（エルトリエーター）が必要。
（１）特殊な遠心分離装置（エルトリエーター）が必要。
（１）特殊な遠心分離装置（エルトリエーター）が必要。
（１）特殊な遠心分離装置（エルトリエーター）が必要。
クッパー細胞 クッパー細胞 クッパー細胞 クッパー細胞
（２）熟練した技術と複雑な工程が必要。
（２）熟練した技術と複雑な工程が必要。
（２）熟練した技術と複雑な工程が必要。
（２）熟練した技術と複雑な工程が必要。
（３）一回の分離操作で得られる細胞数が少ない。
（３）一回の分離操作で得られる細胞数が少ない。
（３）一回の分離操作で得られる細胞数が少ない。
（３）一回の分離操作で得られる細胞数が少ない。
（４）分離の度に多くの動物を犠牲にせねばならない。
（４）分離の度に多くの動物を犠牲にせねばならない。
（４）分離の度に多くの動物を犠牲にせねばならない。
（４）分離の度に多くの動物を犠牲にせねばならない。
細胞の流れ 細胞の流れ 細胞の流れ 細胞の流れ 肝非実質細胞
肝非実質細胞 肝非実質細胞 肝非実質細胞
従来技術とその問題点
新技術の特徴・従来技術との比較
肝細胞 肝細胞 肝細胞
肝細胞の の の の混合培養系 混合培養系 混合培養系 混合培養系を を を を利用 利用 利用 利用してクッパー してクッパー してクッパー してクッパー 細胞 細胞 細胞
細胞を を を を 単 単 単 単 離 離 離 離する する する する手法 手法 手法 手法
（１）特殊な装置を使わない。
（１）特殊な装置を使わない。
（１）特殊な装置を使わない。
（１）特殊な装置を使わない。
（２）簡易な技術と単純な工程。
（２）簡易な技術と単純な工程。
（２）簡易な技術と単純な工程。
（２）簡易な技術と単純な工程。
（３）分離操作を繰り返すことができる。
（３）分離操作を繰り返すことができる。
（３）分離操作を繰り返すことができる。
（３）分離操作を繰り返すことができる。
5
初代混合培養系 初代混合培養系 初代混合培養系 初代混合培養系
（（
（（
5 x 10
6cells / 75 cm
2flask
）））） 成体ラット肝成体ラット肝成体ラット肝
成体ラット肝 細胞分散細胞分散細胞分散細胞分散
1 1 1
1 日後日後日後日後 44日後44日後日後日後 8 8 日後8 8 日後日後日後
高度に純化されたクッパー細胞 高度に純化されたクッパー細胞 高度に純化されたクッパー細胞 高度に純化されたクッパー細胞
ペトリディッシュへの付着 ペトリディッシュへの付着 ペトリディッシュへの付着 ペトリディッシュへの付着 非接着細胞を洗浄・除去 非接着細胞を洗浄・除去非接着細胞を洗浄・除去 非接着細胞を洗浄・除去 上清中のクッパー細胞を回収 上清中のクッパー細胞を回収 上清中のクッパー細胞を回収 上清中のクッパー細胞を回収
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同じフラスコから 同じフラスコから同じフラスコから 同じフラスコから 繰り返して回収可能 繰り返して回収可能 繰り返して回収可能 繰り返して回収可能
（２（２
（２（２〜〜〜３週間）〜３週間）３週間）３週間）
フラスコを振とう フラスコを振とう フラスコを振とう フラスコを振とう 低速遠心
低速遠心低速遠心 低速遠心
肝実質細胞 肝実質細胞 肝実質細胞 肝実質細胞 に富む分画 に富む分画 に富む分画 に富む分画
ラットの場合
培養試験 培養試験培養試験 培養試験
培養日数 培養日数培養日数 培養日数 平均細胞数平均細胞数平均細胞数平均細胞数/ T/ T/ T/ T----75757575 フラスコフラスコフラスコフラスコ(x 10(x 10(x 10(x 105555 ))))
0 0 0 0 10 1010 10 20 2020 20 30 3030 30 404040 40
00
00 10101010 20202020 30303030 40404040 No. 1
No. 1 No. 1 No. 1 No. 2 No. 2 No. 2 No. 2 No. 3 No. 3 No. 3 No. 3
T T T
T- - -75 - 75 75フラスコから繰り返して得られるクッパー細胞数 75 フラスコから繰り返して得られるクッパー細胞数 フラスコから繰り返して得られるクッパー細胞数 フラスコから繰り返して得られるクッパー細胞数
Kitani et. al . (2010) J. Immun. Methods.360:47-55
細胞の回収性
7
EDEDED
ED---1-111 EDED-EDED--3-333 OXOX-OXOX---41414141
Iba IbaIba
Iba----1111 EDED-EDED--1(Day 4)-1(Day 4)1(Day 4)1(Day 4)
Scale bar: 100 µµµµ m
・クッパー細胞はラットマクロファージ特異的抗体により強く免疫染色された。
・クッパー細胞はラットマクロファージ特異的抗体により強く免疫染色された。・クッパー細胞はラットマクロファージ特異的抗体により強く免疫染色された。
・クッパー細胞はラットマクロファージ特異的抗体により強く免疫染色された。
・細胞同士が融合し、多核体を形成した。
・細胞同士が融合し、多核体を形成した。・細胞同士が融合し、多核体を形成した。
・細胞同士が融合し、多核体を形成した。
Kitani et. al . (2010)
J. Immun. Methods.360:47-55
免役染色による細胞の性質の判定
No bead No bead No bead
No bead 1 hr 1 hr 1 hr 1 hr 2 hr 2 hr 2 hr 2 hr 4hr 4hr 4hr 4hr
Blue: DAPI
Green: FITC beads
61.6%
61.6%
61.6%
61.6% 83.6%83.6%83.6%83.6% 93.8%93.8%93.8%93.8%
・クッパー細胞は
・クッパー細胞は・クッパー細胞は
・クッパー細胞はFITCFITCFITCFITC標識ラテックスビーズを活発に貪食した。標識ラテックスビーズを活発に貪食した。標識ラテックスビーズを活発に貪食した。標識ラテックスビーズを活発に貪食した。
Kitani et. al . (2010)
J. Immun. Methods.360:47-55
貪食能
9
Rat GM-CSF
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 3.1 6.3 12.5 25.0
ng/ml
Bovine GM-CSF
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 3.1 6.3 12.5 25.0
Human GM-CSF
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 3.1 6.3 12.5 25.0 Mouse GM-CSF
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 3.1 6.3 12.5 25.0
Absorbance at 440nm
ng/ml
(WST(WST(WST
(WST---1-111試薬による細胞増殖アッセイ試薬による細胞増殖アッセイ試薬による細胞増殖アッセイ試薬による細胞増殖アッセイ))))
Kitani et. al . (2010)
J. Immun. Methods.360:47-55
サイトカインに対する増殖応答能
サイトカインに対する増殖応答能 サイトカインに対する増殖応答能
サイトカインに対する増殖応答能
Day 2 Day 2 Day 2
Day 2 Day 4Day 4Day 4Day 4
Day 8 Day 8 Day 8
Day 8 Day 16Day 16Day 16Day 16
CK18CK18 CK18CK18
CD68 CD68 CD68
CD68 CD172aCD172aCD172aCD172a
< Day 2 >
< Day 2 >< Day 2 >
< Day 2 >
< Day 15 >
< Day 15 >< Day 15 >
< Day 15 >
CK18 CK18 CK18 CK18
CD68CD68
CD68CD68 CD172aCD172aCD172aCD172a
ウシ肝細胞の初代培養系においても ウシ肝細胞の初代培養系においても ウシ肝細胞の初代培養系においても ウシ肝細胞の初代培養系においても クッパー細胞が活発に増殖した。
クッパー細胞が活発に増殖した。
クッパー細胞が活発に増殖した。
クッパー細胞が活発に増殖した。
ウシ肝実質細胞の初代培養（位相差観察）
ウシ肝実質細胞の初代培養（位相差観察）ウシ肝実質細胞の初代培養（位相差観察）
ウシ肝実質細胞の初代培養（位相差観察）
CK19 CK19CK19 CK19
CK19 CK19 CK19 CK19
振 振 振
振とう・とう・とう・とう・付付付付着着着着法法法法によるによるによるによる クッパークッパー
クッパークッパー細胞細胞細胞の細胞のの選の選選選択択択択的分離的分離的分離的分離
Scale bar: 100 µµµµm
ウシの場合
11
0 00 0 1010 1010 20 20 20 20 30 30 30 30
000
0 10101010 20202020 30303030 40404040 50505050 Culture days
Culture days Culture days Culture days
No. 1 No. 1 No. 1 No. 1 No. 2 No. 2 No. 2 No. 2 No. 3 No. 3 No. 3 No. 3 Experiment Experiment Experiment Experiment
C e ll y ie ld p e r fl a s k ( C e ll y ie ld p e r fl a s k ( C e ll y ie ld p e r fl a s k ( C e ll y ie ld p e r fl a s k ( ×××× 1 0 1 0 1 0 1 0
5555))))
T75T75T75T75フラスコあたりのフラスコあたりのフラスコあたりのフラスコあたりの収収収収量量量量10 min 10 min10 min 10 min
2 days 2 days2 days 2 days
ペトリディッシュへの付着 ペトリディッシュへの付着 ペトリディッシュへの付着 ペトリディッシュへの付着 非接着細胞を洗浄・除去 非接着細胞を洗浄・除去 非接着細胞を洗浄・除去 非接着細胞を洗浄・除去
同じフラスコから 同じフラスコから 同じフラスコから 同じフラスコから 繰り返して回収可能 繰り返して回収可能 繰り返して回収可能 繰り返して回収可能
（２
（２（２
（２〜〜〜３週間）〜３週間）３週間）３週間）
Scale bar: 100 µµµµm
ディッシュへの接着による回収と回収性
CD68
CD172a
Iba-1
Iba-1(D8)
85.3%
93.5%
94.0%
None
1 h
2 h
4 h
Blue = DAPI
Green = FITC Red = CD172a
None
1 h
2 h
4 h
ウシ肝由来クッパー細胞の免疫染色と貪食能 ウシ肝由来クッパー細胞の免疫染色と貪食能 ウシ肝由来クッパー細胞の免疫染色と貪食能 ウシ肝由来クッパー細胞の免疫染色と貪食能 ウシ肝由来クッパー細胞の免疫染色と貪食能 ウシ肝由来クッパー細胞の免疫染色と貪食能 ウシ肝由来クッパー細胞の免疫染色と貪食能 ウシ肝由来クッパー細胞の免疫染色と貪食能
Scale bar: 100 µµµµm Scale bar: 50 µµµµm
Kitani et. al . (2011)
Vet. Immun. Immunopath.140:341-345
13
Absorbance at 440 nmAbsorbance at 440 nmAbsorbance at 440 nmAbsorbance at 440 nm
Concentration of bovine Concentration of bovine Concentration of bovine
Concentration of bovine rrrrGMGMGMGM----CSF (CSF (CSF (ng/ml)CSF (ng/ml)ng/ml)ng/ml) 0
0 0 0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.60.6 0.60.6 0.80.8 0.80.8
0 0 0
0 3333 6666 12121212 25252525
ウシ ウシウシ
ウシrGMrGMrGMrGM----CSFCSFCSFCSFに対する増殖応答能に対する増殖応答能に対する増殖応答能に対する増殖応答能
(WST(WST
(WST(WST----1111試薬による試薬による試薬による))))試薬による
LPSLPSLPS
LPS刺激に対するサイトカイン産生応答能刺激に対するサイトカイン産生応答能刺激に対するサイトカイン産生応答能刺激に対するサイトカイン産生応答能
Relative ratio to GAPDHRelative ratio to GAPDHRelative ratio to GAPDHRelative ratio to GAPDH
No stimulation No stimulationNo stimulation No stimulation LPS (1
LPS (1 LPS (1
LPS (1 µµµµg/ml)g/ml)g/ml)g/ml)
0 00 0 10 10 10 10 20 20 20 20 3030 3030 4040 4040 50 50 50 50 60 60 60 60 70 70 70 70
IL ILIL
IL----1111αααα ILIL-ILIL---1111ββββ TNFTNFTNFTNFαααα ILILILIL----6666 ILILILIL---10-101010 ILILILIL----12p4012p4012p4012p40
(Q (Q (Q
(Q---PCR-PCRPCRPCRによる）による）による）による）
Kitani Kitani Kitani
Kitaniet. al . et. al . et. al . et. al . (2011) (2011) (2011) (2011) Vet.
Vet.
Vet.
Vet. Immun. Immunopath.. Immunopath.. Immunopath.140:341. Immunopath.140:341140:341----345140:341345345345
