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Kyushu University Institutional Repository

遷移金属カチオンにより飛躍的に活性化される部位 特異的RNA化学修飾反応の開発およびmRNA修飾による 翻訳制御法の検討

實﨑, 大地

http://hdl.handle.net/2324/1654814

出版情報:Kyushu University, 2015, 博士(創薬科学), 課程博士 バージョン:

権利関係:Public access to the fulltext file is restricted for unavoidable reason (3)

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1 氏 名 實﨑 大地

論 文 名 遷移金属カチオンにより飛躍的に活性化される部位特異 的RNA化学修飾反応の開発およびmRNA修飾による翻 訳制御法の検討

論文調査委 員

主 査 九州大学大学院 薬学府 教授 佐々木 茂貴 副 査 九州大学大学院 薬学府 准教授 唐澤 悟 副 査 九州大学大学院 薬学府 准教授 麻生 真理 副 査 九州大学大学院 薬学府 准教授 谷口 陽祐

論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨

RNAiの発見により、RNAによる遺伝子発現調整メカニ ズムの重要性が広く認識され、アンチセンス法やsiRNAな ど RNA を標的とした核酸医薬の研究が盛んに行われてい る。しかし、これらの研究は、標的遺伝子(mRNA)の発現 抑 制 、 あ る い は 促 進 を 目 的 と し 、 生 体 に 存 在 す る RNA

editingのような発現タンパク質の機能変化を目的とした手

法は注目されていなかった。

こ の よ う な 状 況 下 、 当 研 究 室 で は ア ン チ セ ン ス 法 や

siRNAとは異なる新たな核酸医薬研究のアプローチとして

mRNAの部位特異的化学修飾によってコドン情報を変化さ せることを最終的な目標に、転移性官能基を導入したODN

プローブ(官能基転移人工核酸)によるRNA部位特異的な化学修飾反応の開発を検討してきた(Fig. 1, 2)。第一世代のジケトン型転移基を用いた官能基転移反応では、転移基を搭載したプローブ分子を 標的 RNA と錯体形成させるだけで部位特異的な修飾を実現した。しかし、生理的条件下では転移 官能基の安定性、反応性の低さから適用が困難であった。そこで、本研究では官能基転移反応の生 理的条件下での適用を目指し、金属塩により活性化される転移官能基の開発を検討し、従来の転移 基の機能を大幅に改善できる新規分子の開発とその反応機構の解明、および新規分子による転移反 応を用いたmRNA修飾と修飾mRNAが翻訳過程に及ぼす影響について検討を行った。

第二世代の転移官能基は、安定性と反応性という相反する性質を達成するために、金属カチオン による反応誘起の利用を考え、ピリジンモノケトン型転移基として設計した(Fig. 3)。転移基を 6- チオグアノシンを含むODNに組み込み反応性を検討した。その結果、中性条件において標的RNA と当量の2価Ni+存在下シトシン選択的で、反応開始15分以内に90%の反応収率という高効率な転 移反応が確認された。また、反応液中へのEDTA添加により反応が完全に停止したことから、金属 カチオンが反応活性化に必須であることが分かった。興味深いことに金属カチオンを添加しない緩 衝液のみの条件においても反応速度は遅いものの反応の進行が観測され、これから官能基転移反応

Fig. 1 化学修飾によるmRNA機能制御

Fig. 2 官能基転移反応

Fig. 3 第二世代官能基の設計

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2

では緩衝液中に含まれる微量金属カチオンによっても活性化する可能性が示唆された(Fig. 4A)。ま た、シトシン以外の標的に対する反応性を比較したところ、他塩基に対する反応性は非常に低く、

高いシトシン塩基選択性が示された (Fig. 4B)。さらに、驚くべきことに転移反応は転移官能基中ビ ニル基の立体異性により反応性が大きく影響され、E体のみが高い反応性をもっていた(Fig. 4C)。

詳細な反応機構を明らかとするため、転移修飾体の構造決定、反応の標的 RNA 配列依存性、反 応の速度論的解析を行った。結果、転移反応は標的 RNA 中シトシン 4 位アミノ基を特異的に修飾 し、標的RNA中シトシンの5’側隣接塩基がプリン塩基(rA, rG)である場合にのみ効率的に進行する ことを明らかとした(Fig. 5)。また、

速 度 論 的 解 析 よ り 転 移 反 応 で は NiCl2濃度上昇に伴い、反応律速段階 が変化しており、非存在下で律速段 階であった 1,4 付加反応から NiCl2

存在下ではβ脱離反応へ律速段階が 変化することが示唆された (Fig. 6)。

以上のことから反応機構について考 察したところ、転移反応では反応活 性段階において DNA/RNA ヘテロ 2 本鎖内でE体の転移官能基と錯体形

成したNi2+がRNA鎖のプリン塩基7位窒素とも相互作用することによって、DNA-RNAを架橋する 錯体構造となり、反応点の近接効果が高まったことで飛躍的に反応が進行することが予測された (Fig. 7)。さらに、新規官能基転移反応によるmRNAを標的とした部位特異的修飾および修飾mRNA が翻訳過程に与える影響の検討を目的に、RNaseH および chimera probe を用いた修飾 mRNA の検 出・定量法の開発し、さらに修飾mRNAを用いたin vitro translationを検討した。

以上、本研究では金属カチオンとの錯体形成を利用した新規転移官能基による高効率な標的RNA 中シトシン特異的修飾反応を開発し、その反応活性化段階におけるDNA-RNAを架橋する錯体構造 による反応点の接近が反応加速に寄与しているという非常に興味深い反応機構を明らかとした。本 研究は RNA を標的とする新しい創薬基礎を確立したものであり、博士(創薬科学)の学位に値す ると認める。

Fig. 4 官能基転移反応評価(A: 金属カチオン反応加速効果, B:塩基選択性, C: E-,Z-異性体の影響)

[ODN]=7.5 μM [RNA]=5μM [NiCl

2]= 5μM pH 7.0, 37oC

(A) (B) (C)

[ODN]=7.5 μM [RNA]=5μM [NiCl2]= 5μM pH 7.0, 37oC 1 h

Fig. 5 転移反応の標的RNA配列依存性

Fig. 6 反応律速段階の変化 Fig. 7 予測反応活性錯体

NiCl2非存在下 NiCl2存在下

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