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Über die Itohsche Methode zur Bestimmung des fötalen Geschlechts mittels der Harnprotease
Von
TakefumiUTsu NoMIYA(宇 都 宮 武 文) Aus dem Biochemischen Institut der Medizinischen Fakultät
zu Nagasaki
(Vorstand : Prof. Dr. T. Uchin o) (Eingegangen am 25, Juni 1942)
Einleitung
Vor kurzem hat I toh (1940, 1941) den Nachweis erbracht, daß im Gravidenharn ein spezifisch auf das Hodeneiweiß wirkendes, proteolytisches Ferment ausgeschieden wird, falls der Fötus dem männlichen Geschlecht angehört. Er hat die aus dem Gravidenharn hergestellte Enzymlösung auf das Kaninchenhodeneiweiß einwirken lassen und die Menge der in Freiheit gesetzten Aminosäuren mit Hilfe des Pul f r i c h-Phothometers bestimmt. Auf Grund der so ermittelten proteolytischen Wirksamkeit des Harns hat er versucht das Geschlecht der Föten praenatal zu bestimmen. Da dies Ex-
periment von Itoh uns von großem Interesse erschien, so haben wir es einer Nachprüfung unterzogen, indem wir die Methode einigermaßen ab- änderten, um noch zuverlässigere Resultate zu erzielen und weiterhin mit gewöhnlichem Kolorimeter auszukommen.
Man muß sich im besonderen erinnern, daß die Aktivität des Harn- enzyms von der Konzentration des verwendeten Harns abhängig ist. Itoh hat schon hervorgehoben, daß dünner Harn eine entsprechend geringe, enzymatische Wirksamkeit auf weist, welche zuweilen zu einer irrtümlichen Beurteilung des fötalen Geschlechts führen kann. Bekanntlich ist die Kreatininausscheidung im Harn bei Frauen von nahezu gleichem Körper- gewicht nicht nur täglich, sondern auch stündlich sehr konstant und in- folgedessen unabhängig sowohl von dem Eiweißstoffwechsel, als auch von dem Grad der Diurese. Diesen Umstand hat Yamada (1925) sinnreicher- weise benutzt, um die zeitliche Ausscheidung der verschiedenen Harnbestand- teile zu verfolgen, indem er die Menge des gleichzeitig ausgeschiedenen Kreatinins als Maßstab wählte. Aus demselben Grunde wurde in der vor- liegenden Untersuchung das Verhältnis zwischen der proteolytischen Aktivität und dem Kreatiningehalt des Gravidenharns als Index für die fötale Ge- schlechtsbestimmung verwendet. Dieser Wert, welcher von der Verdünnung des Harns völlig unabhängig ist, wurde als Geschlechtsbestimmungskoeffizient bezeichnet. Da bei schwangeren Frauen auch verschiedene Mengen von Kreatin zur Ausscheidung gelangen, so wurde das Gesamtkreatinin, welches
134 T. Utsunomiya
sowohl das praformierte Kreatinin als auch das Kreatin umfa t, bestimmt und der Koeffizient inbezug auf,das Gesamtkreatinin berechnet.
Methodik
1. Herstellung des Substrates. Das Substrat wurde genau nach der Angabe von I toh aus Kaninchenhoden bereitet. Der frische Kaninchen‑
hoden wurde zermahlen, in I Liter destilliertem Wasser unter Zusatz von 1‑3 Tropfen Eisessig 30 Minuten gekocht, und dann sechsmal in destilliertem Wasser je 10 Minuten lang gekocht, bis in dem Kochwasser keine ninhydrin‑
positive Substanzen mehr nachzuweisen waren. Danach wurde die Substanz mit Aceton und Ather behandelt, pulverisiert und im Eisschrank aufbewahrt.
2. Herstellung der Enzyml6sung aus Gravidenharn. Das Untersuchungs‑
material wurde uns in dankenswerterweise sowohl von der Frauenklinik der Medizinischen Fakultat zu Nagasaki als auch vom S h i momura‑Kranken‑
haus daselbst tiberlassen.
Der Harn wurde filtriert und mit 0.1 n‑NaOH oder mit 0.1 n‑HCI gegen Lackmuspapier neutralisiert. 30 ccm des neutralisierten Harns wurden mit 40 ccm Aceton versetzt und 10 Minuten zentrifugiert (3000 Umdrehungen).
Der ausfallende Niederschlag wurde in 10 ccm physiologischer NaCl‑L6sung gel6st (wenn der Niederschlag nicht sofort in L6sung geht, so empfiehlt es sich, ihn unter Zugabe einiger Tropfen 0.1 n‑HCI in L6sung zu bringen und dann mit 0.1 n‑NaOH zu neutralisieren), mit 2.0 ccm Zitronens ure‑Phosphat‑
mischung nach Mcllvaine (pH 7.2) versetzt und mit physiologischer NaCl‑
L6sung auf 15.0 ccm gebracht.
3. Ausfuhrung der Versuche. Je 7.0ccm der Fermentlosung wurden in zwei 20‑ccm‑Erlenmeyer‑Kolben gebracht und in den einen Kolben 10mg Substrat zugegeben, w hrend mit dem anderen ohne Substrat ein Kontroll‑
versuch angestellt wurde. Die Versuchslosungen wurden nach Zugabe eines Tropfens Toluol mit Korkstopfen verschlossen und ftir 45 Stunden im Thermostat bei 37' gehalten. Die L6sungen wurden sodann mit gehartetem Papier filtriert und mit je 5.0ccm des Filtrates die Mikrobestimmung des Arninostickstoffes durchgeftihrt. Die Differenz zwischen den Bestimmungen des Haupt‑ und des Kontrollversuches gibt die proteolytische Wirkung des in 10 ccm Harn enthaltenen Fermentes an.
I toh hat die Bestimmung des Aminostickstoffes nach der Methode von Florkin (1937) mittels Pulfrich‑Photometers ausgefuhrt. Da das In‑
strument uns nicht zur Verfugung steht, wurde die vorliegende Untersuchung unter Verwendung des D ubosq‑Kolorimeters folgendermaBen ausgeftihrt.
Eine Aminos ure‑Vorratlosung wurde hergestellt, indem man 0.268 g Glykokoll, 0.525 g Glutamins ure und 2.0 g Na‑Benzoat in 0.07 n‑HCI 16ste und auf 1000 ccm aufftillte. Diese L6sung, welche 0.1 mg Aminostickstoff im Kubikzentimeter enth lt, wurde dann mit Wasser so verdUnnt, daB 1.0ccm davon 0.01 mg N entspricht. Ein aliqubter Teil dieser L6sung diente zur Herstellung: der Aminos urevergleichsl6sungen.
Uber die I t o h sche Methode zur Bestimmung des f6talen Geschlechts usw. 135
5.0 ccm der zu untersuchenden L6sung und eine beliebige Menge von Aminostickstoff enthaltende L6sung wurden je in 25.0‑ccm‑Mischzylinder eingebracht, nach Zusatz von I Tropfen Phenolphthaleinl6sung mit 0.1 n‑NaOH‑L6sung tropfenweise versetzt, bis die L6sungen schwachrote F rbung aufwiesen und dann mit destilliertem Wasser je auf 10.0ccm aufgeftillt.
Die L6sungen wurden alsdann mit 2.0 ccm von frisch bereiteter 0.2 igen Naphthochinonsulfons ure‑16sung in Boratmischung (pH 8.25) versetzt, gut umgeschuttelt und 20 Stunden in einem v61lig dunklen Kasten gehalten.
Darauf wurden zu den L6sungen zun chst 2.0 ccm S ure‑Formaldehydl6sung (ein Gemisch von 3 Volurn 0.1 n‑Salzs ure, I V olum Eisessig und 4 Volum 0.15 m‑Formaldehydl6sung) und dann 2.0 ccm 0.1 m‑Thiosulfatl6sung zu‑
gegeben. Nun wurde bis zur Marke 25 aufgefullt, urngeschuttelt und im Kolorimeter verglichen. Da die Aminostickstoffwerte der Versuchsl6sungen vielfachen Schwankungen unterworfen sind, so empfiehlt es sich, zwei oder mehr Standardlosungen von wechselndem Aminostickstoffgehalt nebeneinander darzustellen ur)d die passendste von diesen als Vergleichsl6sung zu gebrachen.
Es wurde festgestellt, daB der Aminostickstoff durch diese Methode sich bis auf 0.015 mg mit ziemlicher Exaktheit bestimmen l Bt.
4. Die Bestimmung des pr formierten und Gesamt‑Kreatinins. Das Kreatinin wurde nach der Methode von Jaff6‑Folin und das Gesamt‑
Kreatinin nach der von Folin bestimmt, wie es in Kochs ,, Practical Methods in biochemistry, 2nd Edition," s. 196 beschrieben ist.
5. Berechnung der Geschlechtsbestimmungskoefnzienten : Die Koef‑
fizienten K1 und K2 wurden aus der proteolytischen Wirksamkeit und dem Kreatinin‑ und Gesamtkreatiningehalt des Harns unter Benutzung von folgenden Gleichungen berechnet.
Geschlechtsbestimmungskoeflizient K1
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6. Untersuchung der pathologischen Harnbestandteile : Zur Prufung des Zuckers im Harn dienten die Benedictsche upd die Nylandersche Probe. Der Nachweis von Albuminurie wurde durch die Koch‑ und die Sulfosalicylsziureprobe gefUhrt, w hrend die Gegenwart der Acetonkdrper durch die Gerhardtsche und die LeN belsche Probe gepruft wurde.
In F llen
der folgenden Tabelle zusammengestellt, bei
Ergebnisse
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Albuminurie nachzuweisen war. Die Geschlechtsbestimmung der F6ten mittels der Koeffizienten K1 und K2 wurde folgendermaBen vorgenornmen.
Wenn der Wert des Geschlechtsbestimmungskoeftizient K1 zwischen 1.1 und 3.0 (iln Falle des Koeffizient Kz zwischen 1.0 und 2.5) Iiegt, so wird das Geschlecht der F6ten als m nnlich, und wenn er unterhalb 1.1 (im Falle von K2 unterhalb 1.0) Iiegt, 0 wird es als weiblich beurteilt. Aus dem weiter unten zu erw hnenden Grunde wurde die F lle, wo die Werte von K1 tiber 3.0 (die von K1 tiber 2.5) betragen, nicht in Rechnung getragen.
Tabelle I. Proteolytische Aktivitat des Gravidenharns. (1)
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Geschlecht der F6ten nur auf Grund der proteolytischen Harns beurteilt wird, indem man es bei Werten uber m nnlich und bei Werten darunter als weiblich ansieht, so 64 Fallen zutreffend. Die Treffsicherheit betr gt also Die in der Tabelle aufgezeichneten Geschlechtsbefunde in Klammern wo die Diagnose des f6talen Geschlechts falsch gestellt Koeffizient K1 oder K2 zur Bestimmung des f6talen Ge‑
herangezogen wird, zeigt sich ein deutlicher Anstieg der Treff‑
steigert sie sich auf 78 Proz., wenn der Koeffizient K1 ver‑
wendet wird, w hrend sie inbezug auf den Koeffizienten K2 76 Proz. betr gt.
herausgestellt, daB man unter Benutzung der Koeffizienten bessere Resultate erzielen kann als sonst.
Uber die I t o h sche Methode zur Bestimmung des f6talen Geschlechts usw. 139 Tabelle II. Proteolytische Aktivitat des Gravidenharns. (2)
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Tabelle 111. Proteolytische Aktivitat des Zwillingsschwangerenharns.
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140 T. ut,sunorniya
In der Tabelle 11 sind die Falle zusammengestellt, bei denen sich Glukosurie oder Albuminurie nachweisen liei3.
Schon I toh hat hervorgehoben, daB die f6tale Geschlechtsbestimmung mittels der Harnprotease bei eiweif haltigem Harn keine Bedeutung besitzt.
Aus der Tabelle 11 kann man ersehen, daB die proteolytische Wirkung eines solchen Harns stets zu niedrig gefunden wird und infolgedessen irrefuhrend sein kann. Die Gegenwart einer geringen Menge von EiweiB beeintrzichtigt die Reaktion nicht. Auch im Falle der Glukosurie ist die Probe unbrachbar, da die proteolytische Wirksamkeit des zuckerhaltigen Harns meistens zu
hoch, .zuweilen zu niedrig gefunden wird. .
In der Tabelle 111 sind die Ergebnisse bei zwei F llen von Zwillings‑
schwangerschaft angegeben.
Tabelle IV. Proteolytische Aktivitat des Nichigravidenharns.
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0.14 3.77 0.75 0.86 0.27 0.67 3.25 0.77
5.556 6.849 3.333 13.158
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5.051 1 6.329 f 7.712
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Uber die I t o h sche Methode zur Bestimmun " des f6talen Geschlechts usw. 141
Neben diesen Versuchen wurde der Harn von normalen, gesunden Frauen und M nnern zu Kontrollvergleichen auf gleiche Weise aufgearbeitet und die so erhaltene Enzyml6sung des Harns auf ihre Aktivitat gepruft. Die Resultate sind in der Tabelle IV aufgezeichnet.
Bei Harn von normalen Personen zeigte es sich, da die Geschlechts‑
bestimmungskoeffizienten meistens sehr niedrig sind und unterhalb 1.0 Iiegen, zuweilen lieBen sich dennoch Werte von weit tiber 2.5‑3.0 beobachten. Wie diese abnorm hohe proteolytische Wirkung des normalen Harns zu deuten ist, I Bt sich zurzeit nicht sagen. Um die Fehlerquelle, welche durch der‑
artige Faile bedingt wird, zu vermeiden, wurde, wie schon oben dargelegt, die Werte von Kl oberhalb 3.0 und diejenigen von Kz oberhalb 2.5 nicht in Rechnung getragen.
Zusammenfassung und SchluB
In der vorliegenden Untersuchung wurde die Itohsche Methode zur Bestimrriung des f6talen Geschle･chts mittels der Harnprotease einer Nach‑
prufung unterzogen, indem man die Ausftihrung der Versuche in einigen Punkten abanderte, um einerseits bessere Resultate zu erzielen und ander‑
seits anstatt des Photometers mit einem gew6hnlichen Kolorimeter aus‑
zukommen.
1. Da die proteolytische Aktivitat des Harns von der Konzentration desselben abhangig ist und infolgedessen ftir die Geschlechtsbestimmung manchmal irreftihrend sein kann, so wurde das Verh ltnis zwischen der enzymatischen Aktivitzit und dem Kreatiningehalt des Harns, welches von der Verdtunung des Harns v61lig unabh ngig ist, als Index ftir die f6tale Geschlechtsbestimmung verwendet.
2. Wenn das Geschlecht der F6ten nur auf Grund der proteolytischen Wirksamkeit des Harns beurteilt wird, so betrzigt die Treffsicherheit 72 Proz., wzihrend sie sich unter Verwendung der Koeflizienten auf 78 Proz.
steigert.
3. Im Falle von Albuminurie oder Glukosurie ist die Probe unbrachbar.
4. Zuweilen v,'eist auch das Harnenzyrn von normalen, nichtschwangeren Personen abnorm hohe proteolytische Wirkung auf. Auf Grund dieses Um‑
standes wurden bei der Beurteilung des f6talen Geschlechts die abnorm hohen Koeffizientenwerte verworfen.
Zum SchluB m6chte ich dem Herrn Prof. Dr. T. Uchino fur seine freundliche Leitung bei dieser Arbeit meinen herzlichen Dank auszusprechen.
Literatur
Itoh (1940) : Zentralblatt ftir Gynakologie, 31, I toh (1941) : Hukuoka Acta Medica, 34, 237.
1302.
