反復配列多型（VNTR）分析を利用した結核菌と BCG 推定の可能性

(1)

反復配列多型（VNTR）分析を利用した結核菌と BCG 推定の可能性

1）（公財）結核予防会結核研究所抗酸菌部，^2）北海道科学大学薬学部生命科学分野，^3）帝塚山大学現代生活学部，

4）日本ビーシージー製造株式会社中央研究所

前田伸司

^１）^２）

藤原永年

^３）

山本三郎

^４）

瀧井猛将

^１）

（平成 30 年 3 月 27 日受付）

（平成 30 年 6 月 15 日受理）

Key words : Mycobacterium tuberculosis, BCG, variable number of tandem repeat（VNTR）

序文

ウシ型結核菌の

Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin（BCG）は結核に対するワクチンと

してだけでなく，膀胱がんの治療薬としても使用されている

^１）

．BCG には亜株があり，日本では小児用ワクチンとして

Tokyo 172

株，膀胱がん治療用として

To- kyo 172

株と

Connaught

株が使用されている．また，

世界的には

Pasteur

株の使用も多い

^２）

．副反応として皮下やリンパ節の膿瘍，尿中に抗酸菌が検出されることがある

^３）

．検出された抗酸菌を結核菌群と非結核性抗酸菌群に区別する方法として

16S rRNA

遺伝子の違いを検出するコバス

TaqMan

法，transcription-

reverse transcription concerted reaction（TRC）法

や結核菌群が産生する

Mycobacterial protein fraction from BCG of Rm 0.64 in electrophoresis（MPB64）を

免疫クロマトグラフィーで検出するキャピリア

TB

などの結核菌群検出キットが国内で販売されているが，

これらのキットでは結核菌と

BCG

菌はどちらも結核菌群として判定される．結核の患者が入院又は退院したときには，感染症法第

53

条

11

により，病院の管理者による届け出が義務付けられている．一方，BCG 感染が疑われた場合には，BCG がピラジナミドに自然耐性を示すため，患者への治療が結核とは異なる．

このように，結核の届け出や患者への治療決定において鑑別結果が重要となる．

ゲノムの違いを利用した鑑別法として

region of dif-

ference（RD）1

領域の有無を検出するマルチプレッ

クス

PCR

法

^４）

があるが，依頼頻度が低いため検査施設

では，鑑別用のプライマーが準備されていない場合が多い．一方，反復配列多型（VNTR：variable number

of tandem repeat）法は，結核対策の分子疫学的な手

法として全国の自治体で利用されている

^５）

．そこで本研究では，結核菌の遺伝子型別法として広く使われている

VNTR

法を利用して

BCG

株の推定が可能かどうか検討した．

結果

MIRU10，MIRU40，v-3690，v-2372，v-1982，v-4120，

v-3232

領域のコピー数はウシ型結核菌標準株（ATCC

19210, VA, USA）とBCG

亜株

3

株（Tokyo172（日本

BCG

製造，東京），Connaught （日本化薬，東京），

Pasteur（結核研究所保管））で同一であった（Table 1）．v-2163a

はいずれも

no band

であった（Table 1）．

v-3155，v-3336

領域は

Tokyo 172

株と

Connaught

株間で異なり，MIRU4 領域は

Connaught

株，Pasture 株および

M. bovis

間で異った（Table 1）．2014 年から

2016

年の間に日本

BCG

製造株式会社で製造された経皮用のワクチン株と膀胱がん治療用の

BCG

株

（100 株）も全て

Tokyo 172

株と同じ

VNTR

パターンを示し（Table 1），また，2016 年から

2017

年に結核予防会結核研究所に鑑別依頼があった検体（ワクチン接種後の皮下・リンパ節膿瘍，膀胱がん治療後の尿，

結核菌群同定キットで陽性）も

BCG

株も同一の反復数を示した（Table 1）．東京都内で分離された結核菌

193

株間には

VNTR

パターンの多様性が見られるが，

v-0424，v-1955，v-2372，v-4156，ETR-A

の

5

領域では

BCG

株と同一の反復数を示す結核菌株は少なく，

この

5

領域の

VNTR

パターンを比較することにより

BCG

であることが推定可能であることが示された

（Fig. 1）．さらに，推定結果を確かめるために

Mycobac- 短報

別刷請求先：（〒204―8533）清瀬市松山 3 丁目 1―24

（公財）結核予防会結核研究所抗酸菌部瀧井猛将

(2)

Table 1 VNTR patterns of Mycobacterium strains and clinical isolates suspected as BCG or M.tuberculosis＊1 Strains/Clinical Isolates

JATA No. SupplyHVMulti- plex＊3 123456789101112 v-0424MIRU10v-1955v-2074v-2163bv-2372MIRU26v-3155MIRU31v-3336v-4052v-4156MIRU4＊2MIRU16MIRU40ETR-AETR-Cv-1982v-2163av-2401v-3690v-3232v-3820v-4120TB/BCG Strains M.tuberculosis H37Rv (ATCC)2314523438533ʼ(352bp)21345225432 M. bovis (ATCC)222241652N423ʼ(352bp)22753N42652 BCG Connaught02033154311511ʼ(199bp)32553N22672 BCG Pasteur02033154311512ʼ(276bp)32563N22672 BCG Tokyo17202033155310513ʼ(352bp)32553N22672 BCG Tokyo172＊402033155310513ʼ(352bp)32553N22672 Clinical Isolates No.Years＊5Vaccine/Cancer＊6 21622016Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 21642016Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 21662016Cancer02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 21792016Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 21822016Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22002016Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22142016Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22162016Cancer02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22332016Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22382016Cancer02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22392016Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22492016Cancer02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22592016Cancer02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22832017Cancer02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG 22842017Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-12017Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-22017Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-32017Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-42017Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-52017Cancer02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-62017Cancer2213425431653231345228552TB B-72017Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-82017Cancer02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-92017Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-102017Vaccine02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG B-112017Cancer02033155310513ʼ(352bp)32553N22672BCG ＊1 The methods of PCR reaction and agarose gel electrophoresis for VNTR analysis were described in our previous paper (10). The VNTR loci, reported by Maeda et al. (10) and Supply et al. (9) were used. HV; hypervariable. N; no band. ＊2 Most of the clinical isolates contain the type II repeat, however, M.tuberculosis H37Rv and BCG strains are absence of type II repeat. Following to the original report, Supply et al., Mol. Microbiol., 2,000, the copy numbersin those strains were indicated as “Xʼ”. ＊3 The method of the multiplex PCR reported by Talbot et al. (4), was modified. ＊4 One hundreds of BCG lot for TB vaccine or cancer therapy produced by BCG Japan from 2014 to 2016. ＊5 The year of the bacilli was isolated. ＊6 The BCG clinical isolates were previously administrated to patients for TB vaccine or cancer therapy. HV; hyper variable. N; noband (or No PCR product).

(3)

Fig. 1 The frequency of the copy numbers in the 24 VNTR loci among the clinical isolates of M. tu- berculosis.

193 clinical isolates of M. tuberculosis were analyzed and the copy numbers in the 24 loci were indicated. The numbers on x-axis were the copy number and ʼNʼ means ʼno bandʼ (or No PCR product)．

White arrows indicate the copy numbers in each VNTR locus on BCG sub-strains; C, Connaught, P, Pasteur, T, Tokyo 172. Black arrows indicate the copy numbers in each VNTR locus on M. bovis. Most of the clinical isolates contain the type II repeat, however, M. tuberculosis H37Rv and BCG strains are absence of type II repeat. Following to the original report, Supply et al., Mol. Microbiol., 2000, the copy numbers in M. tuberculosis H37Rv were indicated as Xʼ .

0%

50%

100%

0 1' 1 2' 2 3' 3 4 5

MIRU4

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 < N

v-3336

0%

50%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

v-1955

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 <

v-4120

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 <

v-3820

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 <

v-3232

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

v-3690

0%

50%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7 8

v-0424

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

v-4156

B

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

v-2401

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

v-2372

B 0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

v-2074

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 <

v-4052

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

v-3155

C,P T 0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 <

v-2163b

0%

50%

100%

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 <

v-1982

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

ETR A

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

ETR C

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9

MIRU26

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

MIRU31

C,P,T

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

MIRU40

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

MIRU16

0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8

MIRU10

C,P,T

C,P,T C,P,T

C,P,T

TC,P C,P,T C,P,T

B B B

B B

B B B

B

C P T B B

C,P,T

B C,P,T

C,P,T B B B

B

B B B

C,T P

C,P,T

C,P,T 0%

50%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 < N

v-2163a

C,P,T B

B

(4)

terium tuberculosis

や

M. bovis

のゲノムと比べて

BCG

亜株に共通して欠損のある

Region of difference

（RD）

1

領域

^６）^７）

を検出するマルチプレックス

PCR

法

^４）

を

VNTR

検査と同じ

PCR

条件で実施した．Talbot らが最初に報告した

PCR

の条件（95℃ で

3

分後，94℃，

30

秒，58℃，1 分，68℃，1 分を

40

サイクル，72℃，10 分）

^４）

と

VNTR

型別で実施している条件（94℃ で

2

分後，94℃，30 秒，63℃，30 秒，72℃，1 分を

35

サイクル，72℃

7

分）は異なるが，VNTR 型別と同一の条件で実施可能であることが示された（Table 1）．

考察

VNTR

法の解析精度は解析対象の領域数に比例し

^８）

，標準的には

Supply

らが報告した

15

もしくは

24

の領域が広く用いられている

^９）

．そこで本研究では本邦での遺伝子型別として提案している

JATA12

領域

^１０）

（v-0424，MIRU10，v-1955，v-2074，v-2163b，v-

2372，MIRU26，v-3155，MIRU31，v-3336，v-4052，

v-4156）とSupply

らの

9

領域（MIRU4，MIRU16，

MIRU40，ETR-A，ETR-C，v-1982，v-2163a，v-2401，

v-3690），更に臨床分離株間での反復数の違いが多く

見られる領域（hyper variable）の

3

領域（v-3232，v-

3820，v-4120）を選び，合計24

領域について遺伝子型別を行った

^９）^１０）

．

v-0424，v-1955，v-2372，v-4156，ETR- A，領域ではTokyo172

株，Connaught 株と同じ反復数を示す結核菌臨床分離株は極めて少なかった（Fig.

1）．過去に報告した本邦での当該5

領域の多様性は低

くない

^１０）

．また，

MIRU4

領域は

BCG

ワクチン亜株（To-

kyo 172，Connaught，Pasteur）とM. bovis

株のいずれも全く別の反復数を示した（Table 1）．この

MIRU 4

領域の多様性は

h

値が

0.38^９）

，

0.20^１０）

との報告があり，

比較的多様性が低い領域である．さらに，

BCG

のロット間での反復数は安定しており，ロット間で違いは見られなかった（Table 1）．26 株の臨床分離

BCG

株においても変化がなかったことから，被検体において，

これら

7

つの領域での反復数が異なる場合は，BCG である可能性が低いと考えられる．本研究においても結核菌/BCG 鑑別依頼株の中に

1

株マルチプレックス

PCR

で結核と判定された株においては，v-0424，v-

1955，v-4156，ETR-A，MIRU4，v-2372

の領域は

To- kyo 172

株とは全く違う反復数であった（Table 1）．

以上のように，BCG 亜株（Tokyo 172，Connaught，

Pasteur）の5

つの

VNTR

領域（v-0424，

v-1995，v-2372，

v-4156，ETR-A）について結核菌臨床分離株のそれ

らの領域の反復数を比較することによって結核菌と

BCG

菌の推定が可能であることが示唆された．さらに，キャピリア

TB

では

BCG

亜株のうち

Connaught

株と

Pasteur

株は陰性となるため結核菌との区別は可

能であるが，

Tokyo172

株との区別は出来ない．

VNTR

型別において

MIRU4

領域を比較することによって，

これらの

BCG

亜株の推定も可能である．但し，確率的には

BCG

菌と同じ反復数を示す臨床分離株の存在を完全には否定出来ないことから，RD1 領域を標的にしたマルチプレックス

PCR

を実施することにより，

鑑別が可能である．

謝辞：本研究の遂行にあたり，多大なご助力を頂き

ました中崇博士，宮林亜希子技師，安田直美技師，若林靖貴博士に深く感謝申し上げます．本研究の遂行にあたり結核臨床分離株の提供を頂いた大角晃弘博士，

カエベタ亜矢医師，神楽岡澄保健師，石原恵子保健師，

に深く感謝申し上げます．BCG Tokyo172 株の製品の提供，研究助成を頂いた日本ビーシージー製造株式会社（委託研究費），及び厚生労働省科学研究費（新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進事業結核低蔓延化に向けた国内の結核対策に資する研究

（課題番号

JP18fk0108041），日本学術振興会（科学研

究費基盤研究

C，16K08346，16K08347，16K08792），

に深く感謝いたします．

利益相反自己申告：申告すべきものなし

文献

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8.

Retrospective Study for Estimation ofMycobacterium bovisBCG Based on the Variable Number Tandem Repeat Location

Shinji MAEDA^１）^２）, Nagatoshi FUJIWARA^３）, Saburo YAMAMOTO^４）& Takemasa TAKII^１）

1)Department of Mycobacteriology, Research Institute of Tuberculosis, Japan Anti-tuberculosis Association,

2)Department of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University of Science,

3)Faculty of Contemporary Human Life Sciences, Tezukayama University,⁴⁾Japan BCG Laboratory

〔J.J.A. Inf. D. 92：705〜709, 2018〕

反復配列多型（VNTR）分析を利用した 結核菌と BCG 推定の可能性