Mem.ResearchInst.B.0.S.T.KinkiUniversityNo.2:26〜32(1999) 26
走 査 型 近 視 野 原 子 間力 顕 微 鏡 に よ る ウ シ精 子 の表 面 形 状 の観 察
︑
彦明
美
井谷入細︑
3・口宏己
暢博
藤藤
n口n]力台刀
へ日ロ弘也
nロロロキ丁壬丁
伯本
佐松
要 約
走 査 型 近 視 野 原 子 間 力顕 微 鏡 は、観 察 した い材 料 に処 理 を加 えず に、その ま まの表 面 形 状 をnanometer 単 位 で非 常 に微 細 に観 察 で き、 容 易 に そ の3次 元 構 築 像 が 得 られ る。 今 回 この 顕 微 鏡 を用 い て 凍 結 保 存 さ れ た ウ シ精 子 を 融 解後 、heparinに よ る受 精能 獲 得処 理 さ らにlysophosphatidylcho/ine(LC)に よ る先 体 反 応 誘 起 処 理 を 行 い、 そ の頭 部 の表 面 形 状 を観 察 した。 融解 直後 、PercoU洗 浄 後 お よ びheparin 処 理 後 の精 子 は先 体 帽、 先 体 赤 道 部 、 後 核 帽 お よ び頚 部 が 観 察 され た。 洗 浄 処 理 やheparin処 理 に よ り 精 子 表 面 の形 状 に は変 化 が 見 られ な か った。LC処 理 後 の精 子 は、 先 体 が 観 察 で きず 頭 部 先 端 部 分 に 胞 状 化 した先 体 の一 部 あ るい は先 体 穎 粒 の結 晶 と思 われ る粒 子 が 数 多 く付 着 して い る像 が観 察 され、LC処 理 に よ り先 体 反 応 が誘 起 され た と思 わ れ た。 ま た、 いず れ の サ ンプ ルで も、 多 くの 結 晶 構 造 が 精 子 付 近 あ る い は精 子 表 面 上 に観 察 され た。 これ は、 精 子 を培 養 液 と と も に直 接 ス ラ イ ドグ ラス 上 に 塗 沫 ・風 乾 し た た め塩 類 の結 晶 が形 成 され た た め と推 察 され た。
緒 言
光 学 顕 微 鏡 や電 子 顕 微 鏡 の解 像 度 は、 光 や放 射 線 の半 波 長 よ り小 さ な 点 が 波 の 屈 折 現 象 に よ りぼ や け て しま う と言 う基 本 的 な限 界 が あ る。 しか しな が ら、 原 子 間 力顕 微 鏡 は、 一 個 の 原 子 を プ ロ ー ブ と して サ ンプ ル表 面 の原 子 との 間 で で きる フ ァ ンデ ル ワ ー ル スカ を 検 出 す る とい う全 く異 な る動 作 原 理 の た め 、 原 子 一 個 ず つ を 直接 観 察 で き る驚 異 的 な解 像 度 を有 し、 そ の 分解 能 は面 内 方 向 で0.2nmお よ び 垂 直 方 向 で0.01nmで あ る。 さ らに、 観 察 した い材料 に処 理 を加 え ず に観 察 で き る た め、 培 養 中 の 細 胞 や 生 物 材 料 を塗 沫 す る だ け の よ うな半 乾 燥 状 態 で も、 そ の表 面 形 状 を 詳細 に観 察 で き る。 最 近 、 発 生 工 学 の分 野 に お い て も、 この原 子 間 力顕 微 鏡 を用 い た研 究 が 多 くな され るよ うに な って きた(1‑7,9‑16,18,22‑25)。
精 子 に関 して は、 ヒ トの奇 形 精 子 頭 部 の容 積 と染 色 体 量 の 関 係(15)や 染 色 体 の 水 分 含 量 の 計 測(3) が 報 告 さ れ て い る。 今 回、 ウ シ精 子 を用 い て、 受 精 能 獲 得 お よび先 体 反 応 に お け る精 子 表 面 形 状 を 原 子 間 力 顕 微 鏡 で 観 察 した の で報 告 す る。
材 料 お よ び 方 法 ウ シ 精 子 の 調 整
ウ シ精 子 は 、 黒 毛 和 種 よ り採 取 し た 市 販 さ れ て い る0.5mlス ト ロ ー の 凍 結 精 液 を 用 い た 。 ス ト ロ ー を LN2よ り取 り 出 し、 直 ち に37℃ の 温 湯 に 浸 漬 す る こ と で 融 解 した 。 融 解 し た 精 子 の 一 部 は 、 そ の ま ま ス
ラ イ ド グ ラ ス上 に 塗 沫 ・風 乾 した 。 一 部 は 、45%お よ び90%に 調 整 し たPercol1密 度 勾 配 溶 液(21)を 用 い て 洗 浄 し た 。 精 子 の 一 部 は 、 ス ラ イ ド グ ラ ス 上 に 塗 沫 ・風 乾 した 。 洗 浄 し た 精 子 は5x107精 子/ml の 濃 度 に 調 整 し、1μg/mlheparinを 添 加 した 修 正definedmedium(m‑DM,20)で5%CO295%
空 気 、 飽 和 湿 度 下 で4時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し て 受 精 能 獲 得 を 誘 起 した 。 一 部 の 精 子 は ス ラ イ ド グ ラ ス に 塗 沫 ・風 乾 した 。 受 精 能 獲 得 処 理 し た 精 子 は 、 そ の 後100μ8/mllysophosphatidylcholine(LC,17)
1.近 畿大学遺伝子工学科 2.近 畿大学生物理工学研究所 3,近 畿大学機械制御工学科
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を 含 むm‑DMで15分 間 イ ンキ ュベ ー トす る こ とで先 体 反 応 を誘 起 した。 このLC濃 度 は受 精 能 獲 得 し た 精 子 の先 体 反 応 を誘 起 す るが受 精 能 獲 得 して い な い精 子 の先 体 反 応 は誘 起 しな い 濃 度 で あ る こ とが 示 さ れ て い る(17,20)。 処 理 後 、 精 子 を ス ライ ドガ ラス に塗 沫 ・風 乾 した。
ウ シ卵 子 の体 外 受 精
受 精能 獲 得処理 した精 子 の一 部 は、体 外成 熟 した ウシ卵子 に授精 し、 その後卵 子 を固定 ・染色 して精 子 侵 入 率 を検 査 した(20)。 す な わ ち、屠 場 で採取 した ウ シ卵巣 の小卵 胞 よ り採取 した卵 子 卵丘 細 胞 複 合 体 を体 外成 熟 させ た。 これ らの卵子 に精 子濃 度 を1x106精 子/m1に 調整 して、1μ8/mlheparin加m‑DM中 で、5%
CO295%空 気、 飽和 湿度 下 で18時 間共培 養 した。培 養後、 卵丘 細胞 と付 着 した精 子 を ボー テ ックス処 理 で 除 去 し、酢 酸 アル コー ルで ホー一ルマ ウ ン ト固 定 し、 その後酢 酸 オ ルセ イ ンで染色 して、受 精 の状況 を調 べ た。
原子 間力顕 微鏡 によ る精 子 頭部 の表面 形状 の観 察
原子 間 力顕 微鏡(SPI3800:セ イ コー電子)を 用 い、 サ イ ク リ ック コ ンタク トモー ドで、 各処 理 後 の精 子 頭 部表 面 を観 察 した。
結果 と考察
図1に 示す よ うに、 凍結 融解 直後 の精子 頭部 は、 そ の長 径 が約9μm、 短 径 が 約4μmで 厚 み は約400nm で あ った。 ウ シの精 子 頭部 の大 きさ は、長 径8.0‑9.2μm、 短 径3.3‑4.6μmと 報 告 され て お り(18)、 今 回 の AFM像 に おい て も同様 の大 きさで あ った。図2は3次 元 構築 像 を示 した。風 乾 した精 子頭 部 に お い て も融 解 直後 の精 子頭 部 で は、 その先体 帽 は明 瞭で赤道 節 は先 体の稜 線 に沿 って筋状 に隆起 して い る ことが観察 で きた。
また、精 子以 外 で は穎粒 状 の小粒 が精 子頭 部 の近 辺 に観察 され凍結保 護剤 に含 まれ る卵 黄 穎 粒 と推 測 で きた。
また ガ ラス表面 の微細 な凹 凸 も同時 に観察 で きた。 図3は 、Percoll液 で洗 浄 した精 子頭 部 で あ る。 無 処 置精 子 と同様 に赤道 節 の筋状 の隆起 が観察 で きた。 頭部 の先端 部 が膨 化 して い るよ うにみ られ たが先 体 の形 態 的 な 変化 なの か析 出 した塩類 の付 着 に よ る もの なのか は不 明 であ った。Heparin処 理 した精 子 の体 外 成 熟 卵 子 へ の 侵入 率 は、69%で あ った。 この ことか らheparin処 理 によ り、 ほとん どの精 子 は受 精 能 獲 得 して い る こ と が 示 され た。 これ ら精子 にお いて も、 無処 置 と同様 に先体 の存 在が観察 され たが、 塗沫 ・風 乾 の過程 で培 養 液 に含 まれ る塩 類 の析 出 と思 われ る結 晶様 物 が精子 に付 着 して お り頭部 表面 の詳細 な像 は得 られなか った(図4)。
精子 の受 精 獲得 は形 態的 変化 は伴 わ ず、卵子 へ の侵入 能力 が可能 にな る可逆 的 な機能 的変 化 で あ る と定 義 され て い る(8)。 今 回の観察 で も受精 能 獲得精 子 に おいて先 体帽 の形態 的変 化 は認 め られ な か った 。 受 精 能 獲 得 した精 子先 体 の表面 形状 につ いて は、 今後 、 さ らに詳 細 な検討 を行 う予定 で あ る。Heparin処 理 後 、 さ らに、
LCで 先体 反 応 を誘 起 した精子 を図5お よ び6に 示 した。 いず れの精子 にお いて も、赤 道節 よ り上部 の 厚 みが、
未処 理精 子 に比 して薄 くな って お り先 体が 消失 し、先 体反 応が誘 起 され て い るもの と思 わ れた。 図4で は、 先 体 の 先 端 部 に雲 状 の形 態 が観 察 さ れ た。 これ は先 体 反 応 に よ り先 体酵 素 が放 出 して い る もの と思 わ れ た 。 Allenら(3)は 、 脱水 処理 によ る ウシ精子 頭部 の容 積 の変 化 を原子 間力顕 微鏡 を用 いて調 べ、 風 乾 して い な い精 子 頭部 の容 積 は14.3‑15.15μ ㎡ で風乾 後 の容積(7.21‑7.32μ ㎡)の 約2倍 で あ り、今 まで示唆 されて い た よ うに精 子 が非 常 に コ ンパ ク トな もので はな く、 比較 的含 水量 の多 い細 胞 で あ るこ とが示 され てい る。 この こ とか ら、 今 回風乾 した精子 にお いて も脱 水 に よ りそ の大 き さや表面 形状 は本 来 の形態 とは異 な る ことが 予 想 さ れ る。 今 後、 培 養液 中で の観 察 も行 うことで、本 来 の状 態 に近 い条件 で の精 子頭 部 の受精 能獲 得 お よ び先 体 反 応 の過 程 にお け る表面 形状 の 変化 を検討 す る必 要 が あ ると思 わ れ る。
ウ シ凍結 ・融 解精 子 の洗浄 ・受 精能 獲得 ・先体 反応 にお ける表 面形 状 の原子 間力 顕微 鏡像
図2.図1の3次 元 構 築 像 。 先 体(矢 印a)、 赤 道 節(矢 印b)、 後 核 帽(矢 印c)、
頚 部(矢 印d)が 観 察 で き る。
図3.Perco11洗 浄 後 の精 子 。 融 解 後 の精 子 と同 様 に 先 体 が 観 察 で き る。
図4.Heparinに よ る受 精能 獲得 処理後 の精 子。先 体 に特 に形 態 的変 化 は認 め ら れ な い。培 養 液 の塩 の結 晶 と思 われ る構 造体 が見 られ る(矢 印)。
図6.図5と 同処 理 で先体反 応 を誘起 した精 子。 赤道 節 よ り上部 の厚 み が未処 理 精 子 に比 して減 少 して い る(矢 印)。
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Morphological changes of bovine sperm surfaces during sperm capacitation and acrosome reaction by atomic force microscopy
K. Saeki' . 2, N. Kato', Y. Hosoi' . 2, K. Matsumoto 1. 2, H. Kato'. 2 and A. Iritani' • 2
Abstract
Atomic force microscope (AFM) provides nanometer-resolved, topographic data images of the natural surface structure of the objects. AFM also has a novel 3 D image-contrast mechanisms. In this study, surfaces of bovine sperm heads frozen-thawed, Percoll-washed, capacitated and acrosome-reacted were observed with the AFM. Spermatozoa were smeared on glass coverslip and air-dried. AFM images of spermatozoa after thawing and washing clearly showed their acrosomal caps, equatorial segments, postoacrosomal regions and necks.
Images of capacitated spermatozoa treated with heparin also showed their complete acrosomal caps. However, acrosome-reacted spermatozoa induced by lysophosphatidylcholine were lack of their acrosome caps. Images also indicated salt crystals which were formed during air- drying smears of sperm suspension.
