総説トリプトファンの超高速時間分解分光と蛋白質構造のダイナミクス田中文夫・又賀 曻最 近, 時 間 分 解 蛍 光 偏 光 異 方 性 の測 定 に よ り, 多 くの 蛋 白 質 で 内 部 に 埋 ま って い る トリ プトファン残 基 が ピ コ秒 領 域 で 分 子 内 回転 の 運 動 自由 度 を も っ てい る こ とが わ か って き た。 ま た, トリプ トフ ァ ン残 基 が1つ しか な い に も か か わ らず, そ の 蛍 光 強 度 は 非 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る場 合 が 多い 。 これ ら の両 方 法 か ら トリプ トフ ァ ンの 分 子 内 運 動 に つ い て互 い に相 補 的 な 知 見 が 得 られ る。 本 稿 で ほ 単 一 の トリプ ト7ア ン 残 基 を もつ 蛋 白 質 を 中 心 に, そ の超 高速 時 間分解分学 法 に よ って 得 られ た蛋白 質構造 の 動 的な側面に ついて解 説 す る 。 は じめに X線 解 析 に よ る 蛋 白質 の 立 体 構 造 の 解 明 は, そ の機 能 を理 解 す る うえ で 非 常 に 重 要 な 役 割 を果 た して きた 。1970年 代 ま では 蛋 白質 構 造 は 静 的 な もの と考 え られ, リガ ン ドの 結 合 に 伴 うそ の 立 体 構 造 の 変 化 も, あ る静 的 な 構 造 か ら別 の静 的 な構 造 に 突 然 に 変わ る もの と考 え られ てい た 。 しか しな が ら, さ ま ざ まな 実 験 的 ・ 理 論 的 研 究 の結 果 か ら, 蛋 白質 構 造 は 本 質 的 に 動 的 な も の で あ る こ とが わ か って きた^<1,2)>。 蛋 白質 の分 子 内 運 動 は 次 め よ うな 時 間 領 域 に 分 類 され る^<2)>。(1) 原 子 や分 子 の局 所 運 動 (サ ブ ピ コ秒), (2) 小規 模 な集 団 運 動 (数10ピ コ秒 以下), (3) 大 規 模 な 集 団運 動 (ナ ノ秒 以 下), (4) サ ブユ ニ ッ ト間 運 動 (サ ブマ イ ク ロ秒 か ら ヤ イ クロ秒)。 この よ うな さ ま ざ まな分 子 内運 動 は, 蛋 白質 の 立 体 構 造 の 変 化 に た い へ ん 重 要 な 役 割 を果 た す 。 た とえ ば, 蛋 白質 に リガ ン ドが結 合 す る際 に起 こる 誘 起 適 合 効果 は, ピ コ秒 や オ ノ秒 領域 で起 こる集 団運 動 が 関 与 す る と考 え られ て い る^<2)>。 トリプ トフ ァ ンの 蛍光 特 堆 は周 りの媒 体 に よ って微 細 に 変 化 す るの で, そ の蛍 光 か らい ろ い ろ な知 見 が 得 られ る。蛋 白 質構 造 の分 子 模 型 か らみ る と, イ ン ドール 環 は そ れ 自身 で は蛋 白質 内部 で は ほ とん ど運 動 の 自由 度 を も た な い。 した が っ て イ ン ドール 環 は近 接 して い る他の ア ミノ酸 残 基 の隙 間 で運 動 す る の で な く, これ らの 残 基 の 動 きに 従 っ て運 動 す る の で あろ う。 超 高 速 時 間 分 解 分 光 法 は, 直 接, ナ ブ ピコ秒 か ち ナ ノ秒 領 域 の この よ うな 蛋 白質 の動 的 な 性 質 に つ い て の知 見 を 得 る も っ と も有 力 な 方 法 であ る^<3,4)> (解 説1参 照)。こ こ で は単 一 の ト リプ ト フ ァ ン残 基 を もつ 蛋 白 質 を中 心 に, そ め時 間 分 解 蛍 光 の 解 析 や 過 渡吸 収 スペ ク トル の測 定 に よ り得 られ た蛋 白質 構 造 め ダイ ナ ミク ス につ 小 て解 説 す る。
I
. 時 間 分 解 蛍 光 法
測 定 方 法 に つ い て に 解 説2を 参 照 して いた だ く こ とに して, こ こで は解 析 方 法 た ら い て 概 説 す る。 1. 蛍 光 強 度 一 般 に 溶液 中 に 単 一 の 蛍 光 成 分 しか な く, しか も励起 状 態 で後 に 述 べ る よ うな 特 別 の 相 互 作 用 (II-4項 参 照) を しな い と き, 励 起 分 子 の 濃 度, す な わ ち 蛍 光 強 度 は指Fumio Tanaka, 三 重 県 立 看 護 短 期 大 学 (〒514津 市 鳥 居 町 100番 地) [Mie Nursing College, Toril-cho, Tsu 514, Japan] Noboru Mataga, 大 阪 大 学 基 礎 工 学 部 (〒560豊 中 市 待 兼 山 町 1番1号) [Depaftment of Chemistry, Faculty of Engineering
Science, Osaka University, Toyonaka 560, Japan]
Protein Dynamics Revealed by an Ultrafast Time-resolved Spectroscopy of Tryptophan
Key word 【トリブ トフ ァン】 【時 間 分 解 分 光 】 【蛋 白 質 の ピコ 秒 ダ イ ナ ミク ス 】
2223
52 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol. 35 No. 13 (1990) 数 関数 的 に減 少す る。 F(t)=exp(-t/τ) (1) こ こで τは 蛍 光 寿 命 であ る。 励 起 分 子 が 他 の 分 子 と相 互 作 用 す る と, 蛍 光 消 光 定 数 が 大 き くな り, 蛍 光 寿 命 が 短 くな る。 消 光 定 数 ほ, 蛍 光 分 子 と消 光 作 用 を もつ 分 子 と の相 対 距 離 や 配 向 に 依 存 して 変 わ る。 溶 液 中 の 低 分 子 で は, 分 子 運 動 が速 い た め にナ ノ秒 や サ ブナ ノ秒 領 域 で 消 光 定 数 が 平 均 化 され 定 数 とみ な せ るが, 分 子運 動 が 蛍 光 寿 命 に比 べ て と くに 速 くな け れ ば, 消 光 定 数 は 時 間 に 依 存 す る こ とに な る^<5)>。蛋 白質 中 の トリプ トフ ァ ン残 基 は 溶 液 中 の 分 子 とは 異 な り, そ れ ほ ど速 く運 動 で きな い た め, 蛍 光 強 度 は 周 りめ ア ミノ酸 残 基 の種 類 だ け で な く, トリプ トフ ァ ン の分 子 内 運 動 と も密 接 に 関 係 す る 。 さ ま ざ まな理 由 で 蛍 光 強 度 の減 衰 が 指 数 関 数 か らず れ て く る と, 便 宜 的 に 蛍 光 強 度 は 式 (2) の よ うに 多指 数 関数 で 表 わ され る。 F(t)=Σ^^n__<i=1>αiexp(-t/τi) (2) こ こで αiは 成 分比 で あ る。 2. 蛍 光 偏光 異 方 性 蛍 光 偏 光 異 方性 は, 試 料 を 偏 光 フ ィル ター を 用 い て 縦 方 向 偏 光 で励起 し, 縦 方 向[I_<￨￨>(t)]と横 方 向[I⊥(t)] の偏 蛍 光 を 測 定 して 次 式 で得 られ る (解 説2参 照)。 r(t)=[I_<￨￨>(t)-I⊥(t)]/[I_<￨￨>(t)+2I⊥(t)] (3)r (t) は次 の よ うな 因 子 に よ って 影 響 を うけ る (解 説3 参 照)。(1) 蛍 光 分 子 の回 転 運 動^<6∼9,11)>, (2) 励 起 エ ネル ギ ー 移 動^<8,10)>, (3) 二 状 態 発光^<10)>, な どで あ る。二 状 態 発 光 とは 2つ の 電 子状 態 か ら 同 時 に 蛍 光 が で る 現 象 で あ る。r (t) もF(t) と同 様 い くつ か の指 数 関 数 の和 と して表 わ され る。 r(t)=Σ^^n__<i=1>βiexp(-t/φi) (4) こ こ で βiは 偏光 異方 性 の成 分比 で あ り, 偏 光 解 消 が(1) の 原 因 で 起 こ る と き, φi=ηVi/kTは 回転 体iの 回 転 相 関 時 間 と よば れ, 回 転拡 散 係数 に逆 比例 す る。 η, k, Tは それ ぞれ 媒 体 の 粘度, Boltzmann 定 数, 温 度 であ る。 またViは 回 転 体iの 体 積 で あ る。 トリプ トフ ァ ン や 共 有 結 合 性 の蛍 光 標 識 色 素 が あ る角 度 の コー ンの 内部 (図1) で, 励 起 寿 命 の間 に速 く 分 子 内 回 転 運 動 を す る と き [式 (4)] は, 近 似 的 に二 指 数 関 数 (n=2) で表 わ され^<6,8)>, φ1と φ2は それ ぞれ 蛍 光 分 子 の分 子 内 お よび, 球 状 蛋 白質 全 体 の 回 転 相 関 時 間 で あ る。Lipari と Szabo は^<12)>蛍光 分 子 の 運 動 に 関 す る 木 下 ら^<11)>のモ デル (解 説3参 照) に 従 っ て, (5) に よ っ て order parame ter,Sを 定 義 し た 。 S^2=β_2/(β_1+β_2) (5) S =cosθ(1+cosθ)/2 (6) こ こ で θ は コ ー ン の 半 頂 角 で あ る (図1)。F(t) と r(t) は と も に ト リ プ トフ ァ ン 残 基 の 分 子 内 運 動 と 関 連 し て お り, 後 に 述 べ る よ うに こ れ ら か ら 蛋 白 質 構 造 の ダ イ ナ ミ ク ス に つ い て 互 い に 相 補 的 な 知 見 が 得 ら れ る^<9)>。
II. 蛋 白質 トリプ トフ ァ ンの超 高 速 時 間 分
解 分光 と そ の励 起 状 態 の ダ イナ ミク ス
1. 遊 離 トリプ トフ ァ ンの 時 間 分 解 蛍 光 トリプ トフ ァ ンの芳 香 環 で あ る イ ン ドール の蛍 光 特 性 は, た い へ ん 複 雑 で あ る。近 紫 外 部 (250∼300nm) に は L_aとL_bの 記 号 で記 され る2つ の 電 子 状 態 が 重 な っ て お り^<13,18)>, こ の波 長 領 域 で光 照 射 す る とこれ ら の両 方 が 励 起 され る。1964年 又 賀 ら^<13)>は, イ ン ドール の蛍 光 スペ ク トル の極 大 波 長 が 溶 媒 の極 性 に依 存 して大 き く長 波 長 側 に移 動 す る こ とを最 初 に見 い だ した (図2)。 彼 らは こ の現 象 を, L_a状 態 の双 極 子 モ ー メ ン トがL_b状 態 よ り も大 き いた め に, 溶 媒 と の相 互 作 用 に よ りL_aの ほ うが よ り安 定 化 す るた め で あ る と結 論 した 。 非 極 性 溶 媒 中 で は, 蛍 光 スペ ク トル は300nm付 近 に 極大 を もち, 振 動 構 造 を示 す 。 これ はL_b状 態 か らの 発 光 で あ る。 また ア セ トニ ト リル の よ うな極 性 溶 媒 中 で は330nm, 水 中 で 図1. 分 子 の 首 ふ り運 動 分 子 に 固 定 され た 遷 移 モ ー メ ン トが 半 頂 角 θ の コ ー ン内 で 首 ふ り運 動 を す る。2224
トリプ トファンの超 高速時 間分解分 光 と蛋白質構 造のダイナ ミクス 53 は355nm付 近 に 極 大 を もち, 振 動 構 造 が な く な り, L_a状 態 か ら発 光 す る。 中程 度 の極 性 溶 媒 中 や イ ン ドー ル の誘 導 体 で は両 方 の電 子 状 態 か ら蛍 光 をだ す, い わ ゆ る二 重 発 光 の現 象 が み られ る。 しか しこ の場 合 で も両 状 態 問 の移 動 が 非 常 に速 いた め, 蛍 光 は 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る。 イ ン ドール の蛍 光 スペ ク トル に 影 響 を 及 ぼ す も う 1つ の 因子 は, シ ク ロヘ キサ ンな どの 非 極 性 溶 媒 中 で の NHと プ ロ トン受 容 体 との 水 素 結 合 で あ る。 この と き も, L_b状 態 か らの 振 動 構 造 を もつ 蛍 光 スペ ク トル が若 干 長 波 長 側 に シ フ トして幅 広 にな る^<13)>。 トリプ トフ ァ ンの 蛍 光 特 性 は イ ン ドール と よ く 似 て い る。 ト リプ トフ ァ ンで は イ ン ドール 環 の3位 に 側 鎖-CH_2CH(NH_2)COOHを もつ。 この側 鎖 は溶 液 のpHの 値 に よ りさ ま ざ まな 荷 電 状 態 を 示 し, これ が イ ン ドール 環 の蛍 光 強 度 と 時 間 分 解 蛍 光 に 大 きな 影 響 を 及 ぼ す。 1978年 Rayner と Szabo^<14)>および Fleming ら^<15)>は水 溶 液 中 で トリプ トフ ァ ンが 二 指 数 関数 の 時 間分 解 蛍 光 を 示 す こ とを見 いだ した 。 そ れ ぞ れ の 寿 命 の値 は, 表1に 示 した よ うにpHに よ り変 化 した^<16)>。ト リプ トフ ァ ンが イ ン ドール よ りも蛍 光 寿 命 が 短 くな る の は, 励 起 イ ン ド ール 環 か ら-NH_3^+へ の 電 子 移 動 に よる と 考 え られ て い る。3-メ チル トリプ トフ ァ ンで は単 指 数 関数 で減 衰 す る の で, 彼 らは-NH_3^+グ ル ー プ とイ ン ドー ル環 の 相 対 的 な 位 置 に 関 して2種 類 の コ ン フ ォ ーマ ーが あ り, それ ぞ れ が 固 有 の 蛍 光 寿命 を もつ と 考 えた 。 最 近 Fleming ら^<17)>は, サ ブ ピ コ秒 の 時 間 分解 能 で トリプ トフ ァ ンの蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 の減 衰 過 程 を測 定 した 。 こ の よ うな 極 短 時 間 内 では 数10ピ コ秒 以 上 の時 間 領 域 とは 異 な る 現 象 が 観 測 され た 。 彼 ら は1.6psの 寿 命成 分 を 観 測 し, L_b状 態 か らL_a状 態 お よび そ の逆 の 遷 移 の速 度 定 数 を そ れ ぞ れ0.625と0.044 (ps^<-1>) と得 て い る。Valeur と Weber^<18)>によ り定 常 光 励起 で 測 定 され て い た イ ン ド ー ル の 極 限 異方 性r_0=0 .33(λ_<ex><300nm) は, こ の方 法 で は理 論 値 と等 しい0.4で あ った 。 2. 蛋 白 質 トリプ トフ ァ ン残 基 の 時 間 分 解 分 光 と そ の 分 子 内 運 動 に つ い て の 一 般 的 な 考 察 蛋 白質 内 の ト リプ トフ ァ ン残 基 の 蛍光 強 度 は, ほ とん ど非 指 数 関数 的 に 減 衰 す る^<19)>。こ の場 合, 実 測 の蛍 光 減 衰 曲 線 は, 通 常, 式 (2) で 示 され た よ うな 多 指 数 関 数 の 減衰 関数 を用 い て 表 わ され る (表2)。 ア ミ ノ酸 残 基 の な か で ト リプ トフ ァ ン蛍 光 に 対 し消 光 作 用 を もつ と考 え られ る のは, 正 電 荷 を もつ ア ミノ酸 側 鎖 やC=O基, あ る い はS-S結 合 な どで あ る。Szabo ら^<20)>は遊 離 ト リプ 図2. イ ン ドー ル の 蛍 光 ・吸 収 ス ペ ク トル の 溶 媒 効 果^<13)> 1: シ ク ロヘ キ サ ン, 2: ア セ ト ニ ト リ ル. 3: 水 。 表1. 遊 離 ト リプ トフ ァ ン と3-メ チ ル イ ン ドール の 蛍 光 寿 命^<16)>
54 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol. 35 No. 13 (1990) トフ ァ ンで の コ ン フ ォーマ ーの 考 え 方 を 適 用 して, これ ら の消 光 作 用 基 とイ ン ドール環 と ゐ相 対 距 離 が蛋 白 質分 子 に よ って 異 な る も の と解 釈 した 。 も し蛍 光 減 衰 関 数 が 二 指 数 関 数 で あ れ ば, 2種 類 の分 布 を 示 し, 三 指 数 関 数 で記 述 で きれ ば3種 類 の分 布 が あ る と考 え る の であ る。 Gratton ら^<21)>やそ の 他 多 くの 可 変 周 波 数 位 相 差 蛍 光 法 (解説4参 照) に よ っ て蛍 光 寿 命 を 測 定 す る 研 究 者 た ち は^<22,23)>, Szabo らの よ うな寿 命 の整 数 個 の蛋 白質 内分 布 を考 え る の で は な く, た とえば 式 (7) の よ うに寿 命 の 連 続 的 な分 布 関 数 を導 入 して い る。 f(τ)=A/[1+{(τ-C)/(W/2)}^2] (7) こ こでf(τ) は Lorentz 型 の 分 布 関 数 で あ る。A, C, Wはそ れ ぞ れ 分 布 関 数 の 最 大 値, 寿 命 分 布 の中 心, 分 布 の半 値 幅 で, 実 測 デ ータ と も っ と も よ く合 う よ うに き め る。 これ ら の考 え方 は, 蛍 光 強度 の減 衰 関数 や可 変 周 波 数 位 相 差 蛍 光 法 の測 定 結 果 を よ く説 明 で き るが, 蛍 光 偏 光 異 方 性 の結 果 を解 釈 す る の に何 の指 針 も与 え な い。 蛍 光 減 衰 関 数 と時 間 分 解 偏 光 異 方 性 のふ る ま い につ い て, 次 の4つ の場 合 が 考 え られ る。 [事 例1] 蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 が 同 時 に 指数 関数 的 に減 衰す る。 [事 例2] 蛍 光 強 度 は 非 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る [式 (2) でn≧2] が, 偏 光 異 方 性 は 指 数 関 数 的 に減 衰す る [式 (4)でn=1]。 [事 例3] 蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 が 同 時 に 非 指数 関数 的 に減 衰 す る。 [事 例4] 蛍 光 強 度 は 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る が, 偏 光 異 方 性 は非 指 数 関 数 的 に減 衰 す る。 表2, 表4の 結 果 か ら事 例1, 2, 3に 相 当 す る蛋 白 質 は存 在 す るが, 事 例4に 相 当 す る も のは1例 もな い。 蛋 白質 内 の トリプ トフ ァ ン残 基 の蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 の減 衰 の挙 動 を説 明す るた め に, 次 の よ うな モデ ル が 考 え られ た^<9)>。球 状 の蛋 白質 に結 合 した イ ン ドール環 が 励 起 寿 命 の間 に分 子 内回 転 運 動 を し, そ の蛍 光 消 光 定 数 が 回転 角 に依 存 して変 化 す る。 イ ン ドール 環 は Favro の 回 転 拡 散 方 程 式^<24)>に従 っ て分 子 内運 動 を す る も の と仮 定 す る (図3)。 得 られ た 蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 の 時 間 依 存 性 を表 わ す 理 論 式 を数 但 計 算 して, 次 の よ うな 定 性 的 な 結 論 が 得 られ た^<9)>。(1) 蛍 光 強 度 と 偏 光 異 方 性 は互 い に 相 表2. 単 一 の トリプ トフ ァ ソ残 基 を もつ 蛋 白 質 の 蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 の 減 衰 パ ラ メ ー タ
τ_i, φ_iやβ_iは (2) と (4) で定義 され てい る。また τ_iとφ_iはナノ秒 の単位 で表わ した。
a) φ_2は算 出され なか った。b) 蛍光 強度は3寿 命を もつ減衰関数 よ りも4寿 命を もつ減衰 関数 のほ うが よく実 測データ と適合 し たが, ここでは3指 数関数のデ ータを載せた。偏光異方性 も3指 数関数 で記述 されたが, 短い2つ の φの平均値を φ_1としてあげた。
トリプ トファンの超高速時間身解分光 と蛋白質構造 のダイナ ミクス 55 関 して減 衰 し, と もに 分 子 内 画 転 の拡 散 係数 に大 き く依 存 す る, (2) 拡 散 係 数 が 小 さ くな る, す な わ ち回 転 が 遅 く な る ほ ど蛍 光 強 度 は 指 数 関 数 か ら のず れ が 大 き くな る, (3) こ の とき偏 光 異 方 性 は分 子 内運 動 に よ る効 果 が な くな り, 蛋 白質 の回 転 運 動 だ け で偏 光 解 消 が 起 こ り指 数 関 数 的 に減 衰 す る, (4) 偏 光 異 方 性 か ら イ ン ドール 環 の分 子 内 回 転 が 観 測 され れ ば, 蛍 光 強 度 は 必 ず 非 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る, (5) 分 子 内回 転 が 平 均 の消 光 定 数 に 比 べ て 非 常 に 速 けれ ば, 蛍 光 強 度 は 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る, (6) 両 方 の 減 衰 関 数 は分 子 内回 転 の ポ テ ン シ ャル エ ネ ル ギ ーに も依 存 す る。 こ の結 果 を も とに して事 例1∼4に つ い て考 察 してみ よ う。 事 例3は, 拡 散 係 数 が 回 転 角 に つ い ての 平 均 の消 光 定 数 に比 べ て極 端 に は違 わ な い 場 合 に 相 当 して い る。 した が っ て, 強 度 も偏 光 異 方 性 も と もに非 指 数 関数 的 に 減 衰 す る こ と にな る。 事 例2で は 分 子 内 回 転 の拡 散 係 数 が 平 均 の消 光 定 数 に 比 べ て 小 さい た め に, 蛍 光 強 度 は 指 数 関 数 か ら大 き くず れ るが, 偏 光 異 方 性 は 分 子 内 回 転 が 遅 くて観 測 で きず, 蛋 白質 自身 の回 転 に よ って指 数 関 数 的 に減 衰 す る こ とを 示 して い る^<6,8)>。また, イ ン ドー ル の 分 子 内 回 転 が 偏 光 異 方 性 の 減 衰 と して観 測 され れ ば, 蛍 光 強 度 は必 ず 非 指 数 関数 的 に減 衰 す るの で, 事 例4に 該 当 す る系 は 存 在 しな い こ とに な る。一 方, イ ン ドー ル環 のNHと 他 の ア ミノ酸 残 基 が 水 素結 合 して い るた め か, あ るい は な にか 他 の 原 因 で イ ン ドール が 完全 に と ま っ て い る とき, 全 蛋 白質 分 子 の ト リプ ドフ ァ ン残 基 が ま った く同 じ環境 にお か れ るた め, 蛍 光 は 当然 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る で あ ろ う。 こ の場 合 偏 光 解 消 も蛋 白質 の 回 転運 動 で のみ 起 こ る の で, も し蛋 白質 が 球 状 とす る と指 数 関数 的 に 減 衰 す る こ とに な る。 これ は事 例1に 相 当 す る。 エ ラ ブ トキ シ ンbは 分 子 量 が7,000程 度 で単 一 の ト リ プ トラ ァ ン残 基Trp-29を もつ。 これ を化 学 修 飾 す る と 活 性 が 失 わ れ る の で, Trp-29は ア セ チル コ リ ン レセ プ タ ー と結 合 す る と き重 要 な役 割 を果 た して い る と考 え ら れ て い る^<25)>。エ ラ プ トキ シ ンbの 立 体 構 造 はX線 解 析 に よ り解 明 され て い る^<26)> (図4)。 これ に よ る と, Trp-29 イ ン ドール 環 は 蛋 白質 の窪 み に あ っ て水 と接 してお り, Thr-35と ペ プチ ド鎖 に 挟 まれ て い る。 こ の よ うな モ デ ル で 得 られ た 蛍 光 減 衰 関 数 の理 論 式 を用 い て, 海 ヘ ビの ヘ ビ毒 であ る エ ラ ブ トキ シ ンbの 蛍 光 解 析 が 行 な わ れ た^<27)> (図5)。 エ ラ ブ トキ シ ンbの 蛍 光 も 非 指 数 関 数 的 に 減 衰 した 。Trp-29の イ ン ドール 環 の近 傍 で蛍 光 消 光 作用 を もつ と思 わ れ るの はLys-27で あ る。 また, 結 晶 構 造 で のTrp-29の 位 置 が も ら と も 安 定 で あ る と 仮 定 し, X線 回折 で 得 られ た これ ら の座 標 を用 い て, 蛍 光 消 光 定 数 や ポ テ ン シ ャル エ ネ ル ギ ー の回 転 角 依 存 性 が 決 め られ た 。分 子 内 の 回 転 拡 散 係 数, 平 均 の 消 光 定 数 (k_q^0), ポ テ ン シ ャル エ ネ ル ギ ー の高 さ (p) な どを 可 変 パ ラ メ ー タ と して 実 測 した 蛍 光 減 衰 曲線 とも っ と も よ く合 う よ うに 決 め られ た (表3)。 表3の 結 果 か ら, (1) 回 転 拡 散 係 数 が 温 度 に 比 例 す る, (2) z軸が 関 与 す る拡 散 係 数 が も っ 図3. トリプ トフ ァ ン残 基 の 分 子 内 回転 モ デ ル^<9)> イ ン ドール 環 は 蛋 白質 の 座 標 系 (x'y'z') か ら イ ン ドー ル 分 子 の 座 標 系 (xyz) ま で オ イ ラ ー 角, α, β, γ だ け 回転 す る 。 ま た, イ ン ドール の 蛍 光 は あ る消 光 作 用 を もつ グ ル ー プ に よ り消 光 され る と 仮 定 。 消 光 作 用基 の 位 置 は (x'y'z') 系 の 極 座 標 (β_qα_q) で 表 わ さ れ て い る。 図4. エ ラ ブト キ シ ンbの 立 体 構造^<26)> 単 一 めTrp-29の イ ン ドー ル環 に も っ と も近 い ア ミノ酸 残 基 ほThr-35で あ る。 傍 ら に あ って イ ン ドー ル の 蛍 光 を 消 光 す る と考 え られ る ア ミノ酸 はLys-27で あ る 。
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56 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol. 35 No. 13 (1990) とも大 き く回 転 が 速 い, (3) 平 均 の 蛍光 消光 定数 は 温 度 と とも に増 加 す る, な どいず れ も 合 理 的 な 結 論 が 得 られ た 。 3. い くつ か の 例 こ こで は 前 節 で述 べ た 一 般 的 な 考 察 に 基 づ い て, い く つ か の蛋 白質 の トリプ トフ ァ ン残 基 の時 間 分 解 蛍 光 とそ の構 造 の ダ イナ ミ クスに つ い て 議 論 す る。 ア ズ リン は典 型 的 な青 色 銅 蛋 白質 で"土 壌 中 の脱 窒 素 バ ク テ リアな ど に存 在 し, 電 子 伝 達 系 に 関 与 して い る と 考 え られ て い る。 そ の 性 質 は 山 中 ら^<41)>によ り最 初 に 詳 し く調 べ られ た 。 蛋 白質 が 青 色 を して い る原 因 は, リガ ン ドの1つ で あ る-S^-か らCu (II) へ の 電 荷 移 動 相 互 作 用 に よ る。4種 類 の ア ズ リ ン, Pseudomonas aeruginosa
(Pae), Pseudomonas fluorescens (Pfl), Alcaligenesfaecalis
(Afe), Alcaligenes denitrificans (Ade) の う ち,
PaeとPflは ト リ プ トフ ァ ン残 基 を1つ (Trp-48) も つ 。 こ れ ら の ア ミ ノ酸 配 列 は ほ と ん ど 同 じ で あ る 。 ま た AfeはTrp-118を1つ だ け も つ 。AfeはTrp-48と Trp-118の2つ の ト リ プ ト フ ァ ン 残 基 を も っ て い る 。 こ れ ら の う ちPae^<42)>とAde^<43)>の 立 体 構 造 がX線 回 折 で 決 定 さ れ て お り, 構 造 が た い へ ん よ く 似 て い る (図6)。 こ れ に よ る と, Trp-48は 板 状 の β 構 造 部 分 に あ り, 疎 水 性 の ア ミ ノ 酸 残 基 に 囲 ま れ て い る 。 こ の 蛍 光 ス ペ ク トル の 極 大 は307nmで あ り, シ ク ロ ヘ キ サ ン 中 の イ ン ド ー ル の ス ペ ク トル と よ く似 て い る (図2)。 ま たTrp-118は 蛋 白 質 表 面 の 近 く に あ り, 蛍 光 ス ペ ク トル は335 nmに 極 大 を も つ 。 こ れ ら ア ズ リ ン の 時 間 分 解 蛍 光 が い ろ い ろ な 研 究 者 に よ っ て 研 究 さ れ た^<20,28,34,44)>。 蛍 光 強 度 と 偏 光 異 方 性 の 減 衰 パ ラ メ ー タ を 表2に あ げ た 。PaeとPflの ア ポ 蛋 白 質 で は 蛍 光 強 度 は 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る 。 蛍 光 寿 命 は ほ ぼ 同 じ τ=5nsで あ る 。Pae の 偏 光 異 方 性 も指 数 関 数 的 に 減 衰 し, φ=4.9nsで こ れ は 蛋 白 質 の 回 転 相 関 時 間 に 相 当 す る 。 した が っ て, Pae やPflのTrp-48の 時 間 分 解 蛍 光 は, 事 例1の 場 合 に 該 当 し, ほ と ん ど分 子 内 運 動 が な い (コ ー ン の 半 頂 角 θ≦ 20°)。 こ の 理 由 は イ ン ド ー ル 環 が β構 造 部 分 に 押 し 付 け ら れ て い る た め に 動 け な い の で あ ろ う。 こ れ に 対 し, AfeやAdeのTrp-118は 事 例3の 場 合 に 相 当 し, そ れ ぞ れ φ_1=160psと690psの 分 子 内 運 動 が 観 測 さ れ て い る^<31)>。Trp-118は 蛋 白 質 表 面 近 く に あ り, か な り分 子 内 回 転 が 可 能 で, コ ーン の 半 頂 角 θ はAfeで38°, Ade
で26° と 得 ら れ て い る^<34)>。Paeの ア ポ 蛋 白 質 にCu (II)
が 結 合 す る と 事 情 が 一 変 す る 。 ま ず 非 常 に 短 い 蛍 光 寿命 成 分 が 現 わ れ, 長 寿 命 成 分 も ア ポ 蛋 白 質 よ り も 短 くな る^<25)>。 Fleming ら^<34)>はこ の 原 因 と し て, 励 起 ト リ プ トフ ァ ン か らCu(II) へ の 電 子 移 動 を 考 え て い る 。Trp-48と 図5. エ ラ ブ トキ シ ンbの 蛍 光 減 衰 曲線^<27)> 観 測 され た 蛍 光 強 度 はCの 点 で表 わ され て い る 。aは 分 子 内 回 転 モデ ル に よ る理 論 式 の蛍 光 減 衰 関 数, bは 二 指 数 関 数 で 表 わ され た 蛍 光 減 衰 関 数 [(2)でn=2]。cは 励 起 パ ル ス 。A とBは そ れ ぞ れ 観 測 され た 蛍 光強 度 と理 論 曲 線aお よび 蛍 光 減 衰 関 数bと の重 み 付 き差 異 (deviation) を 表 わす 。aの ほ うが 実 測 値 と よ く合 った 。 時 間 軸 は100チ ャ ン ネル あた り5,12ns で あ る。 表3. エ ラ ブ トキ シ ンb Trp-29の 分 子 内 回転 モ デ ル で 得 られ た 減 衰 パ ラ メ ー タ^<27)> k_q^0とpは それぞれ分子内の回転角 (図2参 照) に依存す る蛍光消光定数の回転角についての平均値 と, 回転 の際 のポテンシャル エネルギーの高さであ る。
トリプ トフ ァン の超 高 速 時間 分 解 分 光 と蛋 白質 構 造 の ダ イ ナ ミクス 57 Trp-118か らCu(II) へ の それ ぞれ の 最 短 距 離 は, 9.6Å と7.3Å で あ る。 これ く らい の距 離 で は, 他 の例 か ら考 え て充 分, 光 誘 起 電子 移動 が可 能 で あ る。 しか し 還 元 電位 の異 な る い ろ い ろ な金 属 イ オ ンでCu(II) を置 換 して も蛍 光 寿 命 は ほ とん ど変 わ らな い の で^<44)>, 電 子 移 動 が 原 因 か ど うか は っき り しな い。 ホ ロ蛋 白質 に な る と, 止 ま って い たTrp-48が 動 く よ うに な る^<28)>。φ1= 510ps, コー ンの半 頂 角 θ=34° で あ る^<25)>。 最 近, ア ズ リン構 造 の ダイ ナ ミクス に つ い て分 子 動 力 学 の方 法 で 理 論 的 に 研 究 され た^<45)>。この方 法 は蛋 白質 の 結 晶構 造 を ベ ー スに して, 各 原 子 間 のい ろ い ろ な 種類 の 相 互 作 用 を考 慮 した 全 原 子 の運 動 方 程 式 を た て て, そ れ らの位 置 の時 間 依 存 性 を 計 算 す る の で あ る^<2)>。この 方 法 に よ っ て もTrp-48が ほ とん ど動 け な い こ と (θ=9°) や, Trp-118が よ り 大 きな 運 動 の 自 由度 が あ る こ と (θ=20°) な ど の結 論 が 得 られ てい る。 しか し 分 子 内回 転 の相 関 時 間 につ い て は, 実 測 値 よ りも は るか に速 い計 算 値 を与 え る。 リボ ヌ ク レア ー ゼT1 (RNase T1) は佐 藤 と江 上^<46)> に よっ て 発 見 され た 酵 素 で, 104個 の ア ミノ酸 か らな る。 この酵 素 は, 中性pHでRNAを2段 階 で3'-リ ン 酸 モ ノ, お よび オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドに分 解 す る。 こ の酵 素 と阻 害 剤 で あ る2'-GMPと の 複 合 体 の 結 晶 構 造 が Heinemann と Saenger に よ り決 定 され て い る^<47)>。基 質 の結 合 に は, Glu-58, His-92, His-40, Arg-77な どが 関 与 す る。RNase T1は, 基 質 の結 合 部 位 に トリプ トフ ァン残 基 を1つ (Trp-59) もつ 。Trp-59は 芳 香 環 を も つ疎 水性 の ア ミノ酸 残基 に 囲 まれ て い る。 蛍 光 スペ ク ト ル は, ア ズ リンのTrp-48と 似 て 振 動 構 造 を も っ て お り, 320nmに 極 大 を もつ^<35)>。結 晶 構 造 で はTrp-59の NHの そ ば に構 造 水 分 子 が あ り, これ と水 素 結 合 して い る た め に アズ リン よ りも10nmほ ど長 波 長 側 に シ フ ト した もの と思わ れ る。 RNase T1の 蛍 光 弾 度 と偏 光 異 方 性 の減 衰 パ ラ メー タを表2に あ げ た^<35)>。蛍 光 強 度 はpHが6以 下 で指 数 関 数 的 に 減 衰 す る。 しか し6.5以 上 で は 非指 数 関 数 的 であ った 。 偏 光 異 方 性 は どのpHや 温 度 (5∼45℃) で も指 数 関 数 的 に減 衰 した 。 これ らの結 果 か らpH6以 下 で は 事 例1に 該 当す る が, pH6.5以 上 で は 事 例2の 場 合 に 相 当す る こ とが わ か る。 す な わ ち, 酸 性 側 では イ ン ドー ル 環 は止 ま って お り, 偏 光 解 消 も蛋 白質 の回 転 だ け で起 こる。 一 方, アル カ リ側 で は, イ ン ドール 環 が 運 動 す る よ うに な るが, 蛋 白質 の 回転 運 動 よ りも 遅 い た め に 偏 光 異 方 性 の 減 衰 に は 観 測 され な い の で あ ろ う。Rigler ら^<48)>や Prendergastら^<49)>はRNase T1の ダ イ ナ ミ クス に つ い て分 子 動 力 学 の理 論 計 算 を 行 な い, 時 間 分 解 蛍 光 の観 測 結 果 に つ い て考 察 して い る。 結 晶 構 造 か ら算 出す る とイ ン ドール環 が 動 け る 角 度 は ±5° で あ るが, 計 算 結 果 で は コ ー ンの 半 頂 角 θ=17° で あ る。 これ で は 偏光 解 消 は 観 測 され な い の で, 実 験 結 果 とよ く合 っ て い る と い え る。 蛍 光 減 衰 関 数 が アル カ リ側 で非 指 数 関 数 的 で あ る原 因 に つ い て は, Trp-59とHis-40の 相 互 作 用 に よ り蛍 光 寿 命 にあ る分 布 を もつ 可 能 性 を示 唆 して い る^<49)>。 Photobacterium leiognathi の ル マ ジ ン蛋 白質 は, 天 然 の補 欠 因 子 であ る6,7-ジ メ チル-8-リ ビチル ル マ ジ ン (ル マ ジ ン) や, そ の反 応 生成 物 で あ る6-メ チ ル-7-オ キ ソ-8-リ ビチル ル マ ジ ン (オ キ ソル マ ジ ン) お よ び リボ フ ラ ビ ン と結 合 す る。 これ ら芳 香 族 化 合 物 の 時 間 分 解 蛍 光 は事 例1の 場 合 に相 当 し, これ らが蛋 白 質 内 で固 定 さ れ て い る こ とを示 して い る^<39)>。また, この 蛋 白質 の唯 一 の トリプ トフ ァ ン残 基 の 時間 分 解 蛍 光 は, ル マ ジ ンや そ の ア ナ ロ グが結 合 して い て もい な くて も, 事 例3に 相 当 して減 衰 した。 この こ とは ト リプ トフ ァ ン残 基 が か な り 速 く分 子 内運 動 を して い る こ とを 示 して い る (表4)。 θは5, 20, 35℃ で それ ぞれ38, 45, 52° と, 温 度 と とも に広 が った^<38)>。 4. 蛍 光 消 光 機 構 の過 渡 吸 収 ス ペ ク トル の 測 定 に よ る 研 究 これ まで い ろ い ろ な 場 合 に つ い て, トリプ トフ ァ ンの 図6. アズ リン (Ade) の立 体 構 造^<43)>
Cuは 銅 イ オ ンの結 合 部 位 を 表 わ す 。Cu(II) は His
-46お よびHis-117と 配 位 結 合 してい る。 これ らの π電
子 系 とTrp-48, Trp-118の 最 短 距 離 はそ れ ぞ れ9.6と
7.3Å で あ る 。
58 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol. 35 No. 13 (1990) 時 間 分 解 蛍 光 につ い て述 べ て きた 。 蛍 光 強 度 と偏 光 異 方 性 の い ず れ の時 間 変 化 にお い て も, 蛍 光 の消 光 定 数 が た い へ ん 重 要 な 役 割 を果 た す 。 一 般 に蛍 光 の消 光 は, (1)励 起エ ネ ル ギ ー移 動, (2) 無 蛍 光 性 励 起 二 量 体 また は励 起 錯 体 の 生 成, (3) 重 原 子 との 接触 に よる 三 重 項 状 態 へ の 移 行, (4) 光誘 起 電 子 移 動 とそ れ につ づ く反 応, な ど の原 因 に よる。 これ らの うち, (1) か ら (3) ま で につ い て は詳 しい 反 応 機 構 が 早 くか ら解 明 され てい た^<50)>。最 近, 超 高 速 時 間 分 解 過 渡 吸 収 ス ペ ク トル (解 説1参 照) の 測 定 に よ り, これ ま で原 因 の よ くわ か らな か った 蛍 光 の消 光 が ほ と ん ど (4) の機 構 で起 こ る こ とが わ か って きた^<51,52)>。また い ろ い ろ な系 で, 光 誘 起 電 子 移 動 の詳 細 な 機 構 が 解 明 さ れ て き た^<53)>。溶 液 中 で は 励 起 分 子 と消 光 分 子 は 出 会 い, 錯体 に お け る 電 子 移 動 で, ラ ジ カル イ オ ン対 を 生成 す る。 ラ2カ ル イ オ ン対 こ こ で*印 に励 起 分 子 を表 わ す。DとAは 電 子 供 与 体 と 畳 容 体 で あ る。DとIAが 励 起状 態 の寿 命 の間 に電 子 移 動 が可 能 な 距 離 に固 定 され て い る場 合 に も, 同 様 の現 象 が 起 こ る。 ラ ジ カル イ オ セ対 は, こ の あ とア モ オン とカチ オン に分 離 す るか, Dの 三 重 項 とAに 分 離 す るか, あ る いはも とりDとAに も ど る。 蛋 白質 内 の トリプ トフ ァ ン蛍 光 が, 正 の電 荷 を もつ ア ミノ酸 残 基 や=CO, S-Sな どに よ り消光 され る場 合, ト リプトファンは電 子 供 与 体 と して働 ぐ と思 わ れ るが, ま だ ラジ カル イ オ ン対 の 生 成 を 確 認 した 報 告 は な レこ。 しか し, 溶 液 中 の フ ラ ビ ン の蛍 光 が ト リプ トフ ァ ンに よ り消 光 さ れ る場 合 で は, ラ ジカ ル イ オ ン対 の 生成 が過 渡 吸 収 ス ペ ク トル の測 定 に よ り観 測 され て い る^<54)>ここで は電 子 受 容 体 で あ る フ ラ ビ ンが 励 起 され る。 この ラジ カ ル イ オ ン対 は, D-ア ミノ酸 酸 化 酵 素^<54)>やフ ラ ボ ド キ シ ン^<55)>にお い て も 観 測 され た (図7)。 フ ラ ボ ドキ シ ンで は, 励 起 後33ps以 内 に ラ ジ カル イ オ ン対 が 生 成 した 。 フ ラ ビ ンは蛋 白質 の ア ミ ノ酸 残 基 と水 素 結 合 して い る と 考 え られ る の で, あ ま り 動 け な い で あ ろ う。 した が っ て, フ ラ ビ ンの近 傍 に あ る トリプ トフ ァ ン残 基 が, こ の 時 間 領 域 で 運 動 して相 互 作 用 した も の と思 わ れ る。
III.
ア ミノ酸 残 基 置 換 と蛋 白質 構 造 の
ダ イナ ミク ス
カル モ ジ ュ リンは 分子 量17,000酸 性 蛋 白質 で, 広 く 真 核 細 胞 に 分 布 す る。 こ の蛋 白質 は 多 くの代 謝経 路 にお い て カル シ ウ 染 の調 節 に関 与 して いる。 また カルシ ウ ム 表4. 蛋 白 質 に 結 合 した い ろ い ろ な 単 一 分 子 の 蛍 光 減 衰 パ ラ メ ー タτ_i,φ_iや β_iは式 (2) と式 (4) で 定 義 され て い る。 ま た τ_iと φ_iはナ ノ秒 の 単 位 で 表 わ した 。
a) ル マ ジ ンール マ ジ ン蛋 白質 複 合 体, b) オ キ ソル マ ジ ンール マ ジ ン蛋 白質 複 合 体, c) リボ フ ラ ピ ン-ル マ ジ ン蛋 白 質複 合 体 。d)
蛍 光 減 衰 関 数 は4指 数 関 数 で 記 述 され た が 最 短 寿 命 は省 略 した 。
トリプ トフ ァンの超 高速時間分解 分光 と蛋 白質構 造のダイナ ミクス 59 と 結 合 して サ イ ク リ ッ ク ヌ ク レオ チ ドホ ス ホ ジ エ ス テ ラ ー ゼ, ア デ ニ ル シ ク ラ ー ゼ, ミオ シ ン軽 鎖 ギ ナ ー ゼ な ど を 活 性 化 す る 。 カ ル モ ジ ュ リ ンの 結 晶 構 造 は Babu ら^<56)>によ り決 定 さ れ た 。 こ れ に よ る と, 半 径10Å ほ ど の2つ の 球 状 部 分 が1本 の αヘ リ ッ ク ス で つ な が って い る 。 各 球 状 部 に は そ れ ぞ れ2ヵ 所 の カ ル シ ウ ム結 合 部 位 を も つ 。 カ ル モ ジ ュリ ン は2個 の チ ロ シ ン, Tyr-99とTyr-138を も っ て いる。 こ れ ら の チロシン 互 い セこ隣 殆 っ て お り,
ca結 合 部 位IIIとIVに 近 接 レ て い る。Tyr-99は 部 分 的 に
水 と 接 触 で き るが, Tyr-138は 内 部 に 埋 もれ て い る 。 Anderson ら に よれ ば^<57)>, 280nmの 光 を 照 射 す る と, こ れ らの2個 の チ ロ シ ン残 基 が 結 合 して320nmに 吸 収 帯 を も つ ジ チ ロ シ ン を 生 成 し, こ の ジ チ ロ シ ン が400nm に 蛍 光 を 発 す る 。 Small と Anderson は^<58)>, ジ チ ロ シ ン の 時間 分 解 蛍 光 か ら カ ル テ ジュリ ン構 造 のダ イ ナ ミク ス に つ い て 研 究 し で い る (表4)。 カ ル シ ウ ム を 結 合 した カ ル モ ジ ュ リ ン
では,
蛍 光偏光の減衰は指数関数的 で φ_1=9.9nsを 得
た。 ジチ ロシンでは トリプ トフ ァン残基 の よラな分子 内
回転運 動は不 可能 である。 カル シ ウムを結合 していない
と
き蛍光 偏光 は 非指数関数的 に 減衰 し, φ_1=2.1nsと
φ_2=6.8nsを 得た。φ_2は蛋白質全体の回転相関時間に
相 当 し, カル シ ウ ムが 結 合 す る と カル モ ジュ リン の全 体 の構 造 が 伸 び る こ とが 示 唆 され た 。 こ の こ とは Babu ら の指 摘 と一 致 す る^<56)>。Small と Anderson は^<56)>, カ ル シ ウム の解 離 に よ り現 わ れ た φ_1成分 は セ グ メ ン ト運 動 に 相 当 す る と解 釈 して い る。 蛍 光 強 度 は ど の よ うな条 件 で もす べ て 非 指 数 関 数 的 に減 衰 した の で, ジ チ ロ シ ンは事 例2に 相 当 して ゆ っ く り運 動 してい る可 能 性 も あ る。 Kilhoffer らは^<59,60)>, 遺 伝 子 工 学 に よ りTyr-99を Trp-99に 置 換 して, こ の トリプ トフ ァ ン残基 の 時 間 分 解 蛍 光 か ら, カル モ ジ ュ リン構 造 とそ の ダ イ ナ ミクス に つ い て 研 究 して い る。 こ の置 換 カル モ ジ ュ リ ンは, 機 能 的 に は も と の カル モジ ュ リン とほ とん ど変 わ らな い。 蛍 光 ス ペ ク トル は348nmに 極 大 を もち, カル シ ウム が結 合 して い て もい な くて も変 わ らな い 。 しか し時 間 分 解 蛍 光 ス ペ ク トル (図8) では, カル シ ウ ムが 結 合 して い な い と5ns以 内 に2nmほ ど シ フ トす るだ け で あ る が, やル シ ウ ムが 結 合 す る と20ns以 内 に9nmほ ど長 波 長 側 に シ フ トす る。 ず な わ ち カル シ ウ ムが 結 合 す る と, 結 合 しそ い な い 場 合に 比 べ て, トリプ トフ ァ ン蛍 光 の溶 媒 効 果 が は や か に大 き くゆ っ く りと起 こ る こ とを 示 して い る。 この こ とは光 励 起 ど と もにTrp-99が 蛋 白質 構 造 の 変 化 を伴 りて 表 面 に 出 て くる こ とを 示 して い る。おわ りに ピコ秒か らナ ノ秒領域 の蛋 白質構造 の ダイナミクスは,
アロステリック蛋白質な どの大きな構造変
化
にた いへん重要な役割 を果たし てい る と思わ れ る。本
図7. フ ラボ ドキ シ ン内 で の フ ラ ビ ン と ト リプ トフ ァ ン間 の ラ ジ カル イ オ ン対 の 過 渡 吸 収ス ペ ク トル^<55)>Desulfovibrio vulgaris Miyazaki フ ラ ボ ドキ シ ンのFMN
を 励 起す る と, こ の近 傍 に あ る トリプ トフ ァン残 基 か ら光 誘 起 電 子移 動 が起 こ り, ラ ジ カル イ オ ン対 (Trp^+…Flavin^-) が 生 成 す る 。 図 中 に光 励起 後 の時 間 が 記 され て い る。 図8. Ca結 合 ア ミノ酸 置 換 カル モ ジ ュ リ ンの 時 間 分 解 蛍 光 スペ ク トル^<60)> カ ル モ ジ ュ リ ンは, チ ロ シ ン を2個 (Tyr-99, Tyr-138) も つ が トリプ トフ ァ ンを もた な い 。 ア ミノ酸 置 換 カ ル モ ジ ュ リ ンで は, Tyr-99が トリプ トフ ァ ンで 置 換 され て い る。 蛍 光 ス ペ ク トル は 励 起 後 の 時 間 と と も に 長 波 長 側 に シ フ トす る 。 励 起 後 の時 間 は, 短 長 側 の ス ペ ク トル か ら そ れ ぞれ, 0.1, 2.2, 6.5, 16.2nsで あ る。 2231
60 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol. 35 No. 13 (1990) 稿 の例 か ら明 らか な よ うに, 1つ の蛋 白質 分 子でも 「か た い」 部 分 と 「や わ らか い」 部 分 が存 在 す る。 した が っ て, 蛋 白質 構 造 の ダイナ ミクス と構 造 転 位 との 関連 に つ い て 明 らか にす る た め に は, 時 間 領域 と空 間領 域 の両 面 か ら検 討 す る必 要 が あ る。 遺 伝 子工 学 的手 法 に よる トリ プ トフ ァ ンの ア ミノ酸 置換 は, 1つ の蛋 白質 の い ろ い ろ な部 分 で の動 的 な 性 質 を 知 る の に た い へ ん 有 用 で あ ろ う。 また 今 後 の課 題 と して, ト リプ トフ ァ ンの蛍 光 消 光 機 構 を解 明 し, 実 験 結 果 を定 量 的 に解 釈 で き る よ り正 確 な モ デル を確 立 す る こ とも大 切 で あ る。
文
献
1) 木 原 裕 ・小 林 孝 嘉 ・木 下 一 彦 ・永 山 国昭 ・広 海 啓 太 郎:時 間領 域 か ら見 た 生命 現 象, 分 子 過 程 か ら機 能 ま で, 本 誌 別 冊 No. 28 (1985)2) Karplus, M., McCammon, J.A.: Ann. Rev. Biochem., 53, 263-300 (1983)
3) Tanaka, F., Mataga, N.: in Photochemistry on Solid Surfaces (eds. Ampo, M., Matuura, T.), p. 551, Elsevier, Tokyo (1989)
4) “c’†•¶•v: ƒŒ•[ƒU•[Œ¤‹†, 15, 992-1002 (1987) 5) “c’†•¶•v: ‘æ24‰ñ•ªŽq‰ÈŠw‰Ä‚ÌŠw•Z•u‰‰—vŽ|•W
p. 103 (1984)
6) Gottlieb, Y., Wahl, P.: J. Chim. Phys., 60, 894-899 (1963)
7) Belford, G.G., Belford, R.L., Weber, G.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 1392-1396 (1972)
8) Tanaka, F., Mataga, N.: Biophys. J., 39, 129-140 (1982)
9) Tanaka, F., Mataga, N.: Biophys. J., 51, 487-495 (1987)
10) Tanaka, F., Mataga, N.: Photochem. Photo biol.,29, 1091-1097 (1979)
11) Kinoshita, K., Kawato, S., Ikegami, A.: Bio phys.J., 20, 289-305 (1977)
12) Lipari, G., Szabo, A.: J. Am. Chem. Soc., 104, 4559-4570 (1982)
13) Mataga, N., Torihashi, Y., Ezumi, K.: Theor. Chim. Acta, 2, 158-167 (1964)
14) Rayner, D.M., Szabo, A.: Can. J. Chem., 56, 743-745 (1978)
15) Fleming, G.R., Morris, J.M., Robbins, R.J., Woolfe, G.J., Thistlethwaite, P.J., Robinson, G.W.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4642-4656 (1978)
16) Robbins, R.J., Fleming, G.R., Beddard, G.W., Thistlethwaite, P.J., Woolfe, G.J.: J. Am. Chem. Soc., 102, 6271-6279 (1980)
17) Ruggiero, A.J., Todd, D.C., Fleming, G.R.: J. Am. Chem. Soc., ˆó•ü’†
18) Valeur, B., Weber, G.: Photochem. Photobiol.,
25, 441-444 (1977)
19)
Beechem, J.M.,
Brand, L.:
Ann.
Rev. Bio
chem.,54,
43-71 (1985)
20)
Hutnik,
C.M.,
Szabo, A.G.:
Biochemistry,
28, 3923-3934 (1989)
21)
Alcala, J.R.,
Gratton, E., Prendergast,
F.G.:
Biophys.
J., 51, 925-936
22)
Jameson, D.M.,
Gratton, E., Eccleston, J.F.:
Biochemistry,
26, 3894-3901 (1988)
23)
Lakowicz, J.R., Gryczynski, I., Cheung, H.C.,
Chien-Kao,
W.,
Jhonson, M.L.,
Joshi, N.:
Biochemistry,
27, 9149-9160 (1988)
24)
Favro, L.D.:
in Fluctuation
Phenomena
in
Solids (ed. Burgess, R.E.),
p. 79, Academic
Press, New York (1958)
25)
Chang, C.C., Hayashi, K.: Biochem. Biophys.
Res. Commun., 37, 841-845 (1969)
26)
Low, B.W., Preston, H.S., Sato, A., Rosen, L.
S., Searl, J.E.,
Rudko, A.D.,
Richardson, J.
A.: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 73,
2991-2994 (1976)
27)
Tanaka, F., Kaneda, N., Mataga, N., Tamai, N.,
Yamazaki, I., Hayashi, K.: J. Phys.
Chem.,
91, 6344-6346 (1987)
28)
Munro, I., Pecht, I., Stryer, L.: Proc.
Natl.
Acad. Sci. USA, 76, 56-60 (1979)
29)
Kouyama, T.,
Kinoshita,
K.,
Ikegami, A.:
Eur.
J. Biochem., 182, 517-521 (1989)
30)
Ross, J.B.,
Rousslang, K.W.,
Brand, L.: Bio
chemistry,20,
4361-4369 (1981)
31)
Grinvald,
A., Steinberg, I.Z.:
Biochim. Bio
phys.Acta,
427, 663-678 (1976)
32)
Van Hoek, A., Vervoort, J., Visser, A.J.W.
G.: J. Biochem. Biophys.
Methods, 7,
243-254 (1983)
33)
Jonas, A., Privat, J., Wahl, P., Osborne, J.C.
Jr.: Biochemistry,
21, 6205-6211 (1982)
34)
Petrich, J.W.,
Longworth, J.W.,
Fleming, G.
R.: Biochemistry,
26, 2711-2722 (1987)
35)
Chen, L.X.-Q.,
Longworth, J.W.,
Fleming,
G.R.: Biophys.
J., 51, 865-873 (1987)
36)
Ferreira, S.T.: Biocheimstry,
28, 10066-10072
(1989)
37)
Vincent, M., Brochon, J-C., Merola, F., Jordi,
W., Gallay, J.: Biochemistry,
27, 8752-8761
(1988)
38)
Datema, K.P.,
Visser, A.J.W.G.,
van Hoek,
A., Wolfs, C.J.A.M.,
Spruijt,
R.B.,
Hem
minga,M.A.:
Biochemistry,
26, 6145-6152
(1987)
39)
Kulinski,
T., Visser, A.J.W.G.:
Biochemis
try,26,
540-549 (1987)
40)
Lee, J., O'Kane, D.J.,
Gibson, B.G.:
Bioche
mistry,27,
4862-4870 (1988)
41)
Yamanaka, T., Kijimoto, S., Okunuki, K.: J.
Biochem, 53, 256-259 (1963)
42)
Adman, E.T.,
Jensen, L.H.:
Isr.
J. Chem.,
トリプ トフ ァ ンの超 高 速 時 間 分 解 分 光 と蛋 白 質 構 造 の ダ イ ナ ミク ス 61
21, 8-18 (1981)
43)
Norris, G.E., Anderson, B.F., Baker, E.N.: J.
Mol. Biol., 165, 501-521 (1983)
44)
Hutnik,
C.M.,
Szabo, A.G.:
Biochemistry,
28, 3935-3939 (1989)
45)
Lin, X.-Q.,
Engh, R.A.,
Briinger,
A.T.,
Nguyen, D.T.,
Karplus, M., Fleming, G.R.:
Biochemistry,
27, 6908-6921 (1988)
46)
Sato, A., Egami, F.: J. Biochem, 44, 753-767
(1957)
47)
Heinemann,
U., Saenger, W.: Nature,
299,
27-31 (1982)
48)
MacKerell, A.D.,
Jr., Nilsson, L., Rigler, R.:
Biochemistry,
27, 4547-4556 (1988)
49)
Axelsen, P.H.,
Prendergast,
F.G.:
Biophys.
J., 56, 43-66 (1989)
50)
Mataga, N., Kubota, T.: Molecular Interaction
and Electronic Spectra,
Marcel Dekker,
New
York (1970)
51)
Mataga, N., Ottolenghi, M.: in Molecular As
sociations(ed.
Foster, R.), Vol. 2, 1, Acade
micPress,
London (1979)
52) Mataga, N.: in Molecular Interactions (eds. Ratajczak, H., Orville-Thomas, W.J.), Vol. 2, 509, John Wiley & Sons, Chichester (1981) 53) –”‰ê •¸: ‹GŠ§‰»Šw‘••à (“ú–{‰»Šw‰ï•Ò), 2,
p. 2, Šw‰ï•o”ŃZƒ“ƒ^•[, “Œ‹ž (1988)
54) Karen, A., Ikeda, N., Mataga, N., Tanaka, F.: Photochem. Photobiol., 37, 495-502 (1983) 55) Karen, A., Sawada, M.T., Tanaka, F., Mataga,
N.: Photochem. Photobiol., 45, 49-53 (1987) 56) Babu, Y.S., Sack, J.S., Greenhough, T.J.,
Bugg, C.E., Means, A.R., Cook, W.J.: Nature, 315, 37-40 (1985)
57) Malencik, D.A., Anderson, S.R.: Biochemis try,26, 695-704 (1987)
58) Small, E.W., Anderson, S.R.: Biochemistry, 27, 419-428 (1988)
59) Kilhoffer, M-C., Roberts, D.M., Adibi, A., Watterson, D.M., Haiech, J.: Biochemistry, 28, 6086-6092 (1989)
60) Chabbert, M., Kilhoffer, M-C., Watterson, D. M., Haiech, J., Lami, H.: Biochemistry, 28, 6093-6098 (1989)
【解 説1】
「
超 高 速 」 時 間 分 解 分 光 法
超 高 速 時 間 分 解 分 光法 は, 極 短 時 間 パル ス レーザ ー の 開 発 と高速 時 間分 解 測 光 技 術 の進 歩 が あ い ま っ て, こ の 20年 間 に飛 躍 的 に進 歩 した。 「超 高 速 」 とい う言 葉 は現 在 では ピコ秒 (ps; 10^<-12>秒) か ら フ ェ ム ト秒 (fs; 10^<-15>秒) の時 間領 域 の分 光 法 に対 して用 い られ る。 こ の よ うな 分 光 法 に は, 以下 に示 した2つ の方 法 が あ る。 (1) 時 間 分 解 蛍 光 法: 蛍 光 強度 や 蛍 光 ス ペ ク トル, 蛍 光 偏 光 異 方 性 な どの 時 間依 存性 を測 定 す る。 蛍 光 はそ の蛍 光 分 子 の まわ りの環 境 に 敏 感 な の で, 本 文 で述 べ た よ うに生 体 分 子 の コ ンボ メ ー シ ョン変 化 や構 造 の ダ イ ナ ミク ス につ い て研 究 す る の に適 して い る。 現 在 ピ コ秒 領 域 の パル ス レーザ ーを 用 い て,蛋 白質 中 の ト リプ トフ ァ ンや チ ロシ ン残 基 の蛍 光, フ ラ ビン蛋 白質 の 蛍 光, そ の ほか 生 体 高 分 子 の構 造 と ダ イ ナ ミク ス につ い て研 究 され て い る。 これ ま で ナ ノ秒 パ ル ス で測 定 され て い た蛍 光 寿 命 も, ピコ秒 パ ル ス レーザ ー で測 定 す る と, ず っ と短 い寿 命 成 分 が 現 わ れ る こ とが 多 い。 また, これ ま で蛍 光 を発 しな い と考 え られ て い た 生体 成 分 が フ ェ ム ト秒 領 域 で蛍 光 を 出 して い る可 能性 も あ る 。 (2) 過 渡 吸収 ス ペ ク トル 法: 励起 分 子 お よび 励 起 分 子 が ひ き起 こす, さ ま ざま な 反 応 の 中 間体 が 時 間 と と も に 変 化 して い くあ りさ ま を, そ れ ら の ピ コ秒 ・フ ェム ト秒 時 間 分 解 吸 収 ス ペ ク トル を 測 定 す る こ とに よ っ て調 べ る。 過 渡 吸 収 ス ペ ク トル 法 は, 主 と して 励 起 分 子 が 他 の分 子 と相 互 作 用 した 結 果, 新 しい 分 子 種 を 生 成 して い く過 程 を観 る の であ る。 蛍 光 をだ さな い分 子 の場 合 に は時 間 分 解 蛍 光 法 は 適 用 で きず, 過 渡 吸収 スペ ク トル 法 に よ っ て い ろ い ろ な 知 見 が 得 られ る。 現 在 ピコ秒, フ ェム ト秒 領 域 の過 渡 吸 収 スペ ク トル 法 に よ り, 光 合 成 系 や そ の ほ か の光 受 容 体, 種 々 の モ デル 系 な ど にお け る光 誘 起 電 子 移 動 の研 究 や, COヘ モ グ ロ ビン に お け るCOの 光 解 離 に伴 うヘ モ グ ロ ビ ンの構 造 変 化 な どに つ い て 研 究 され て い る。【
解 説2】
「
超 高 速 」 時 間 分 解 蛍 光 の 測 定 法
現 在 も っ と も一 般 的 に用 い られ て い る の は, CWモ ー ド同期YAGレ ー ザ ー に よ っ て 同期 励 起 され た 色 素 レー ザ ーで あ り, そ の標 準 的 な 性 能 は 以下 の よ うで あ る。 CWモ ー ド同 期YAGレ ーザ ー, 波 長1.06μm; パル ス 幅 約100ps; く り返 し82MHz) か らの 光 パ ル ス は光 フ ァ イバ ー と グ レーテ ィ ン グの ペ ア に よる パ ル ス圧 縮 器 で パ ル ス幅 が4psに な り, 波 長 変 換 器 に よる第 二 高 調 波 発 生 で1.06μmか ら半 分 の532nmに 変 換 され る。 こ の レーザ ー光 を励 起 光 と して 同期 励 起 方 式 で色 素 レーザ ー を発 振 させ る。 色 素 レー ザ ー で は用 い る 色 素 に よ って 波 長 範 囲 が異 な る が, 約660∼800nmの 間 で 可 変 で あ り, パル ス幅 も約300fsと 短 くな る。 これ に さ らに パ ル ス圧 縮 器 を用 い る と, パ ル ス 幅 は約60fsま で 圧 縮 で き る。パ ル ス光 を増 幅 して 出力 を上 げた 場 合, 最 終 的 に は パル ス幅 は約500fsに 広 が る。 ま た実 際 の 測 定 の 場 合 は, 第 二 高 調 波 を 発 生 させ, 半 分 の波 長 に した パル ス で 励 起 す る場 合 が 多 い 。 蛍 光 測 定 の時 間 分 解 能 は, 測 光 の時 間 分 解 能 に よっ て2233
62 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol. 35 No. 13 (1990) も左 右 され る。 光 検 出器 に は ス トリー ク カ メ ラ (分 解 能>5ps), 時 間 相 関 単 光 子 計 数 法 (分解 能>30ps) が あ る。 また 最 近, ピ コ秒 以下 の 時間 領 域 で の測 定 に は, 蛍 光 と超 短 レー ザ ー パル ス の光 混 合 を種 々 の遅 延 時 間 で行 な っ て蛍 光 の生 成 ・減 衰 曲線 を測 定 す る, ア ップ コ ンバ ー ジ ョン法 (分 解 能>280fs) が 開発 され て い る。単 光 子 計 数 法 の時 間 分 解 能 は, コ ン ピュ ー タに よ るデ コ ンボ リ ュ ー シ ョンに よ って 約10ps以 下 に 向上 さ せ る こ とが で き る。 時 間 分解 蛍 光 偏 光 異 方 性 の 測 定 は, 発 光 側 に偏 光 子 を 設 置 して測 定 す る。 励 起 パ ル ス レーザ ー はす で に偏 光 し て い るの で, 偏 光 子 を 回 転 させ て, この 偏 光 面 に平 行 な 蛍 光 強 度 I_<￨￨>(t) と垂 直 な 蛍 光 強 度I⊥(t) を一 定 時 間 ご とに交 互 に積 算 して 測 定 す る。 偏 光 子 の 回転 は コ ン ピ ュ ー タで 制 御 す るか, あ る い は一 定 時 間 積 算 す る と測 定 が 自動的 に とま る よ うに してお い て, 偏 光 子 を 手 で回 転 さ せ て も よい。I_<￨￨>(t) とI⊥(t) か ら本 文 の式 (3) に よ っ て偏 光 異 方 性r(t) が 得 られ る。 偏 光 異 方 性 の 測 定 に は分 光 器 の前 に散 乱 板 を 置 い て, 偏 光 を 完 全 に解 消 さ せ て か ら強 度 を 測 定 す る こ とが大 切 で あ る。 ピ コ秒 ・フ ェ ム ト秒 時 間 分解 分 光法 のす ぐれ た解 説 書 が Fleming に よ って 著わ され て い る^<1)>。
1)
Fleming, G.: Chemical Applications
of Ultra
fastSpectroscopy,
Oxford University
Press,
New York (1985)
【
解 説3】
時 間 分 解 蛍 光 偏 光 異 方 性
蛍 光 偏 光 異 方 性 の 理 論 や 測 定 法 お よび 生体 系 へ の応 用 に つ い て は, 主 と して Weber^<1)>によ り開 発 され て きた 。 蛍 光 偏 光 異 方 性 の 測 定 法 や解 析法 に つ い て は, 本 誌 の別 冊 号^<2)>や木 下 ・御 橋 の 著 書^<3)>に詳 し く 述 べ られ て い る の で, こ こ で は原 理 的 な解 説 に止 め てお く。 分 子 の電 子状 態 問 で遷 移 が起 こるた め に は, 分 子 は有 限 の遷 移 モ ー メ ン トを も っ て い な くて はな らな い。 遷 移 モ ー メ ン トは ベ ク トル な の で 固 有 の 方 向性 を も って い る。 した が っ て, 試 料 に あ る特 定 の偏 光 面 を もつ 光 を 照 射 す る と, 遷 移 モ ー メ ン トが こ の偏 光 面 と同 じ方 向 に あ る分 子 だ け が 励 起 され る。 また 蛍 光 も個 々 の分 子 は そ の 遷 移 モ ー メ ン トの方 向 の偏 光 を発 す る。 偏 光 異 方 性 は こ の両 方 向 の 差 に依 存 す る。 も しラ ン ダ ムに 配 向 して い る 全 分 子 が, 吸 収 時 点 と発 光 時 点 でそ れ らの 遷 移 モ ー メ ン トを 変 え な けれ ば, 偏 光 異方 性 は0.4で あ る。遷 移 モ ー メ ン トの方 向 を変 え る 原 因 に は つ ぎの よ うな もの が あ る。 (1) 励 起 状 態 で の 電 子状 態 の 変化: 各 電 子 状 態 に は 固 有 の遷 移 モ ー メ ン トが あ る の で, 励 起 の瞬 間 か ら発 光 の 瞬 間 ま で の あ いだ に電 子 状 態 が 変 化 す る と, 時 間 に依 存 して偏 光 異 方 性 が 減 少 す る。 こ の場 合 は, 全 分 子 が 蛍 光 寿 命 のあ いだ に固 定 され て い て も偏 光 解 消 が 起 こ る。 た とえ ば, 励 起 エ ネル ギ ー移 動 や 電 子 エネ ル ギ ー緩 和 な ど で あ る。 (2) 分 子 の運 動: 吸収 と発 光 の遷 移 モ ー メ ン トが 同 じ で も, そ れ を 担 っ て い る分 子 が 回 転 や 横 揺 れ運 動 を す る と遷 移 モ ー メ ン トの方 向が 変 わ り, 時 間 に 依 存 しで偏 光 異 方 性 が 減 少 す う。 回 転 運 動 の場 合, 偏 光 異方 性 が 減 少 す る速 さ は 分 子 の 回 転 運 動 の拡 散 定 数 に よ って きま る。 も し分 子 が球 状 で あ れ ば, 拡 散 定数 は1種 類 で あ り, 偏 光 異方 性 は 指 数 関 数 的 に 減 衰 す る。 回転 楕 円体 で あれ ば, 拡 散定 数 は2種 類 で, 偏 光 異方 性 の減 衰 は3つの 指 数関数の 和 で表 わ きれ る。 ま た 完全 に非対 称 な分 子 で は 3種 類 の拡 散 定 数が あ り, 5つ の指 数 関数 の和 で減 衰 す る。偏光解消が (2)
の原 因で起 こる とき, 偏光異方性 の時間
依 存性 を表 わ す 理 論 式 を得 るた め に は, 分 子 の拡 散 方 程 式 を解 か な くて は な らな い。 また, 蛋 白質 の よ うな球 状 分 子 に トリプ トフ ァ ン残 基 や 蛍 光 標 識 色 素 が 結 合 してい る場 合 に は, 偏 光 異 方 性 は 近 似 的 に 二 指 数 関 数 的 に 減 衰 し, 小 分 子 の分 子 内運 動 の回 転 拡 散 係 数 と蛋 白 質 全 体 の 拡 散 係 数 が 求 め られ る。 木 下 ら は生 体 膜 の脂 質 層 に 棒 状 の 蛍 光 色 素1,6-ジ フ ェニル ヘ キ サ トリエ ン (DPH) を標 識 し, これ が あ る角 度 の 円錐 内 で首 ふ り運 動 を す る場 合 (本 文 図1) の偏 光 異 方 性 の理 論 式 を 導 き, 生 体膜 の 流 動 性 に つ い て 解 析 し て い る (本 文 の文 献11)。 木 下 らの用 い たDPHは, 分 子 軸 と遷 移 モ ー メ ン トの 方 向 が一 致 して い るの で, 得 ら れ た 式 は 比 較 的 簡 単 で あ った。 蛋 白 質 中 の トリプ トフ ァ ン残 基 は 分 子 が 完 全 に 非 対 称 で あ るの と, 共 有結 合に よ り束 縛 され て い る ので, 問題 が も っ と複 雑 で あ る。 これ ら の理 論 式 は, い ず れ も蛍 光 強度 が指 数 関数 的 に 減 衰 す る こ とが 前 提 に な って い る。 す な わ ち, 蛍 光 消 光 定数 が 分 子 の回 転 運 動 に よ って変 化 しな い と仮 定 して い る の で あ る。 しか し 蛋 白質 中 の ト リプ トフ ァ ン 残 基 で は, 蛍 光 が あ る 特定 の他 の ア ミノ酸 残 基 に よっ て消 光 さ れ る の で, 蛍 光 消光 定 数 は回 転 角 に よ っ て変 化 す る はず で あ る。 この よ うに消 光 定 数 の分 子 内回 転 角 依 存 性 を 考 慮 す る と, これ ま で得 られ て いた 偏 光 異 方 性 の理 論 式 と 事情 が か な り異 な っ て くる。 蛍 光 強 度 の減 衰 と, 偏 光 異 方 性 の減 衰 が 互 い に相 関 して く る よ うに な る。1) Weber, G.: Polarization of the Fluorescence of Solution, in Fluorescence and Phosphores cenceAnalysis (ed. Hercules, D.M.), pp. 217-240, Interscience, New York (1966)
2) 金 岡 祐 一 ・柴 田和 雄 ・関 根 隆 光 ・高 木 俊 夫 編: 「蛍 光 測 定 の 原 理 と 生体 系 へ の 応用 」, 本誌 別 冊 (1974)
3)木 下 一 彦 ・御 橋 廣 眞 編: 蛍 光測 定 一 生 物-学 へ の応 用, 学 会 出 版 セ ンタ ー (1983)
ト リプ トフ ァ ン の超 高 速 時 間 分 解 分 光 と蛋 白質 構 造 の ダ イ ナ ミ クス 63
