土壌から分離された日本未報告のPythium属菌3種について

北極産Trichodermaが産生する

褐色雪腐病菌抑制物質

大阪府立大学大学院 生命環境科学研究科

植物バイオサイエンス分野

北極産Trichodermaが産生する

褐色雪腐病菌抑制物質



研究の背景



北極産

Trichoderma

とは？



褐色雪腐病菌とは？



病原菌抑制物質の探索



技術の特徴・従来技術との比較



今後の展開

研究の背景



Trichoderma は世界中の陸地に広く分布する

糸状菌で，植物病原菌に対して拮抗性を持ち，

生物農薬として利用されているものや，工業用

酵素源としても知られる



褐色雪腐病は，積雪地域のコムギや芝草の重

要病害



積雪地域や寒地のTrichoderma についての情

報は少なく，褐色雪腐病への抑止性は不明で

あった



最近，北極のコケからTrichodermaを発見し，

褐色雪腐病菌抑制物質を産生することを明ら

かにした

北極産Trichoderma とは？

North pole United Kingdom Ireland Russia Norway 40 ° E 0 ° ° E 80 ° E 20

スバールバル諸島

(74˚-81˚N,

10˚- 30˚E)



スバールバル諸島の

永久凍土上のコケか

ら分離

T. polysporum

と同定



低温性病原菌に対し

て培地上で拮抗性を

示す



温帯産の

Trichoderma

よりも低温で活性化す

るポリガラクチュロナ

ーゼ（ペクチナーゼの

一つ）を産生

TpA

_TpA

TpA

_TpA

TpA

TpG

TpJ

TpG

_TpG

_TpG

TpG

TpJ

TpJ

_TpJ

TpJ

Pi

Pi

Pi

Sn

Sn

Sn

Tin

Tin

Tin

Tis

Tis

Tis

A

A

A

_Mn

Mn

Mn

TpA

TpG

TpJ

TpA: 北極産

T. polysporum

, TpG: ドイツ産

T. polysporum

, TpJ: 日本産

T. polysporum

A:

Athelia

sp., Mn:

Microdochium nivale

, Pi:

Pythium iwayamai

Sn:

Sclerotinia nivale

, Tin:

Typhula incarnata

, Tis:

Typhula ishikarienshis

Photo by Takuma Shigyo, Bayer CropScience

10 µm

10 µm

褐色雪腐病菌 (Pythium iwayamai) とは？

Masumoto S, Tojo M and Shigyo T (2009) Journal of Japanese Society of Turfgrass Science 38: 33-36



積雪地域のコムギや芝草の最重要病

害の一つ



積雪が数か月以上続く地域で発生



積雪下で発生するために防除が困難



現在の登録農薬はクロロネブ剤のみ

病原菌抑制物質の探索（目的）

褐色雪腐病菌に対する環境保全型農薬の開発を目指し、

北極産Trichoderma から成長抑制物質を分離し、その

構造を明らかにする

北極産

Trichoderma

褐色雪腐病菌

成長抑制物質

HPLC分析

成長抑制試験へ

本体：JASCO社製 MD-2010 Plus

カラム： ODS-P （10 i.d. ×250 mm）

カラム温度： 40℃

流速： 2mL/min（定流量モード）

溶離液： Gradient 20-100％ MeCN(0-40min)

100％ MeCN(40-60min)

検出器： Photo Diode Array（200～400 nm）

《 HPLC/PDA 分析》

《 P.iwayamai の成長抑制試験》

●培養条件

PYG培地を3mLずつ試験管に分注し、試験

菌 P.iwayamai を一定量植菌後、20℃に

て振とう培養する。

1日ごとに吸光度を測定することにより成長抑

制作用を確認。

●測定条件

前処理：培養液が均一になるように攪拌

ブランク：精製水

ポジティブコントロール：クロロネブ（n=3）

測定機器

機器名：Bact-500

測定温度：20℃

測定波長：600 nm

Barentsburg

OPU 1567

OPU 1568

OPU 1569

Longyearbyen

OPU 1570

OPU 1571

OPU 1572

●分析条件

A c O E t E x t . R i c e m e d i u m e x t r a c t e d w i t h M e O H M e O H E x t .

T

.

p

o

l

y

s

p

o

r

u

m

p a r t i t i o n e d b e t w e e n H 2 O - A c O E t

病原菌抑制物質の探索（方法）

H2O AcOEt Ext.

Rice medium, 20oC, 53days

　MeOH

(211mg) partitioned with AcOEt - H2O

partitioned with Hex.-Ben.-CHCl3-MeOH MeOH Ext.

T. polysporum

OPU1571

H2O

(82g) BuOH(30g)

partitioned with H20-BuOH

CHCl3 (4.3g) Insoluble (878mg) Hexane (6.1g) 5 (49mg) Benzene (1.7g) MeCN (2.6g) MPLC Ben:Ace=5:1 MPLC CHCl3:MeOH=10:1 Acetone 2 7 ₁₂ HPLC Hex:Ace=5:1 11 (5.7mg) HPLC Ben:MeOH=10:1 21-24 (86.2mg) 10-11 MPLC Ben:Ace=2:1 HPLC Hex:Ace=1:1 6 (11mg) HPLC CHCl3:MeOH=50:1 10 (10.3mg) 7 (18mg) HPLC CHCl3:MeOH=50:1 4-hydroxybutyric acid (3.9mg) MPLC CHCl3:MeOH=20:1 3 (17mg) 12 (1.7mg) insoluble 1. CHCl3 2. CHCl3:MeOH=100:1 3. CHCl3:MeOH=50:1 4. CHCl3:MeOH=20:1 5. Acetone 6. EtOH 7. MeOH partitioned with 1 _{2 3} 4 5 10 (303.1mg) HPLC Ben:MeOH=15:1 HPLC Ben:Ace=5:1 4 (183mg) MPLC Ben:Ace=100:1 27-35 ergosterol peroxide (128.2mg) _HPLC CHCl3:MeOH=10:1 8 (3.4mg) HPLC Ben:Ace=20:1 HPLC CHCl3:MeOH=30:1 9 (271mg) HPLC CHCl3:MeOH=30:1 mevalonic acid (17.0mg) MPLC CHCl3:MeOH=20:1 HPLC CHCl3:Ace=3:1 mannitol (29.9mg) 1

extracted with MeOH

(12.8g)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 化合 物名 control

クロロネブ

3

6

7

10

μｇ - 5 10 100 5 10 100 5 10 100 5 10 100 5 10 100 写真

5日間培養

[abs]

Control クロロネブ 化合物 3 化合物 6 化合物 7 化合物 10 5 10 100 5 10 100 5 10 100 5 10 100 5 10 100

褐色雪腐病菌に対する成長抑制試験

Mean ±SD ＊＊P＜0.01

**

**

**

**

**

**

**

**

v.s. Control

(ｎ=3)

[μg]

褐色雪腐病菌に対する成長抑制試験

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

7日間培養

化合 物名 cont rol

クロロネブ

3

6

7

10

μｇ - 5 10 100 5 10 100 5 10 100 5 10 100 5 10 100 写真

[abs]

5 10 100 5 10 100 5 10 100 5 10 100 5 10 100 Control クロロネブ 化合物 3 化合物 6 化合物 7 化合物 10 Mean ±SD ＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01

**

**

**

*

v.s. Control

(ｎ=3)

[μg]

褐色雪腐病菌に対する成長抑制試験

0.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 1 2 3 4 5

15日間培養

[abs]

Control クロロネブ 化合物 7 10μg 100μg 10μg 100μg 化合物名 control

_{クロロネブ}

₇

μｇ - 10 100 10 100

写真

Mean ±SD ＊P＜0.05

*

*

v.s. Control

(ｎ=3)

病原菌抑制物質の探索（結論）



北極産

Trichoderma

OPU1571 株の培養

物から単離した化合物 3, 6, 7, 10 が 褐

色雪腐病菌 に対する成長抑制作用を示

した



化合物 7 については抗菌薬クロロネブよ

り効果が持続した



化合物 ３は，(E)-3-(6-oxabicyclo [3.1.0]

hexan-1-yl)-prop-2-enoic acidのメチル

エステルと同定し，新規化合物であること

がわかった

特許出願

発明者：東條元昭・細江智夫

出願人：公立大学法人大阪府立大学・学校法人星薬科大学

発明の名称：抗ピシウム菌剤

特許出願番号：特願2013-163584

出願日：平成25年8月6日

論文

Yamazaki, Y., Tojo, M., Hoshino, T., Kida, K., Sakamoto, T.,

Ihara, H., Yumoto, I., Tronsmo, A.M., and Kanda, H. (2011)

Characterization of

Trichoderma polysporum

from

Spitsbergen, Svalbard archipelago, Norway, on species

identity, infectivity to moss, and polygalacturonase activity.

Fungal Ecology

4: 15-21.

技術の特徴・従来技術との比較



北極のコケに生息する糸状菌が産生する天然

の抗菌化合物であるため，環境保全型農業へ

の応用が期待できる。



褐色雪腐病はゴルフ場の芝に大きな被害をも

たらすため，とくに寒冷地のゴルフ場芝への応

用が期待できる



褐色雪腐病の登録農薬は現在のところクロロ

ネブ剤のみである。北極産

Trichoderma

が産生

する抗菌化合物はこれまで知られておらず，褐

色雪腐病に対する新規の農薬や資材の候補と

なる

実用化に向けた課題



北極産

Trichoderma

は穀類エキス等の一

般的な培地で容易に培養できるが，培養

コストは未算出



外国産の糸状菌であるために，生菌を直

接圃場に散布することはできない



北極産

Trichoderma

（

T. polysporum

）の人

畜への病原性や毒素産生の報告は無い

が，農薬登録基準に則った安全性評価は

行っていない

想定される用途



褐色雪腐病防除においてクロロネブを補

完する



北日本地域の他，海外では北米西岸など

の積雪量の多い地域でも褐色雪腐病が

多発している。これら広範な地域での利

用が想定される



植物病害防除以外に，低温性糸状菌が

産生する抗菌物質の特性を生かした低温

環境での防かび剤としての応用も考えら

れる

本技術に関する問い合わせ先

大阪府立大学

産学官研究連携推進センター

リエゾンオフィス

TEL： 072-254-9872

FAX：072-254-7475

E-mail：[email protected]