香川大学農学部学術報告 第32巻 第2号111”119，1981
カラスノエンドウ種子の遊離糖類と青酸配糖体ビンアニンについて
ⅠⅠ．ビシアニンおよびビシアノ、−スの単経とその性質，ならびに粗製ビンアナ・−ゼ 笠井 忠，岸本 雅夫＊，川村信一・郎＊＊
ON THE FREE SUGARS AND CYANOGENIC GLYCOSIDEIN THE SEED
OFlm A〃Gこ塔m VAR．．5EGEmエエS
II．，Isolationandpropertiesofvicianinandvicianosewith
SOme Observations on crude vicianase
TadasiKASAI，Masao KISIMOTO and Sin，itir・O KAWAMURA
ThemainpurposeofthisstudywastoexamincthccharacteristicbehaviorofvicianinandvicianoseisolatedfkOm
Vi‘iaangu5tifbliavar”5qetali5byrecentanalyticalmethods，becauscalmostnoreportshavebeenmadesinceBERIFAND etall（1906−10）h Vicianin，a CyanOgenic glycoside，WaSisolated and crystallized．Vicianose wasisolated fi・Om
vicianinbyuseofcrudevicianasesolutionBothvicianinandvicianosewerecharacterizedbythinlayerchroma−
tography）gaSliquidchromatographyandinfiaredandultravioletspectraThecrudeenzymesolutionobtainedby
aqueousextractionofpowderedseedsfbllowed bydialysiscontainednotonlyvicianasebutvicianosidase（orβ−L− aIabinosidase）Inthefirststageofincubation，vicianaseactivitywashigherthanvicianosidaieaCtivityTheoptimal pHand temperatureofvicianaseweIefound to be4・Oand45−500C・AmygdalinwasisolatedfiOmO
j＊onicaandwasusedinsomeexperimentsofvicianinasareftrenceglycoside カラスノエンドウ種子からビシアニンを単離結晶化し，融点，比旋光度とともに，ビワ種子から単離したアミグダ リンと対比してTLC，GLC，IR，UVをどから同定した カラスノエンドウ種子抽出粗酵素液のビシアナ・−・ゼを用いて，ビシアニンからビシアノ1−・スを単離し上記同様これ を同定した． この種子抽出粗酵素披にはビシアノシダ・−ゼも含まれるが反応の初期2時間までは主としてビシアナーゼ作用のみ が認められた。 ここで得たビシアニンを基質としたこの粗酵素液のビシアナ・−ゼ活性はpH40，温度45−500Cで政商であった。 緒 カラスノエンドウ（Ⅵcよα即妙邪吋誠厄L．vaIい喝地必虻och）の青酸配糖体については古くから知られており（1）ビ シアニンと呼ばれている．郎）このビシアニン（Vin）のアグリコンはマンデルニトリル，糖部はビシアノ・−ス（Vic） でD−グルコ1−ス（GIc）のC6にエーアラビノ、−ス（Ara）がグルコシド結合（β位）した還元性の二糖類である。（4・5） アンズ（動・〟乃比ざα乃ざ〟），モモ（乃・〟乃比ざクe′：5よcα），（8）ビワ（E7ゐ如′ツαノ呼0乃fcα）（‖の種子にはこのVinと構造のよく 似た青酸配糖体アミグダリン（Amy）がある．これは糖部がゲンチビオースでVicのAraがGIcに変ったものであ る．Vicはゲイン（刷やビオルチン（8）の構成糖として知られている，．カラスノエンドウの種子が傷ついたとき，Vin が酵素によりVieを遊離するとともに青酸とベンズアルデヒドが揮発してくる‖（1）Vicはその後化学的合成や且coガ ＊現在勤務先：岡輝中学校（岡山市岡町） ＊＊現在勤務先：香川県明馨短期大学（高校市亀岡町）
香川大学虚学部学術報告 第32巻 第2号（1981） 112 β−ガテクトシダ・−‥ゼの転移作用を利用した酵素的合成が報告されている．（9￣12） このようにVicは自然界で限られた稀な存在であり前報（14〉のように，カラスノエンドウ種子の少糖類が他の多く の豆科植物のそれと異なっていることとともに特異的である カラスノエンドウからのVinやVieについてはBERTRANDらの報告のみである、ので，この研究では段近の種々 のクロマトグラフィー，分光分析など機器分析上の明確なデ1一夕を得ることを目的とし，同私 構造の確認などビワ 種子から単離したAmyとの対比で機器分析からも行をった小 実 験 方 法 カラスノエンドウ（Ⅵcよαα7堵び∼￡ゆゐαL．vaI＼5曙ぬ或仁Koch）種子は本学部周辺で黒く熟したものを1974年5月下 旬から6月上旬に採集し風乾したものを用いた ビシアニン（Vin）はBERTRAND ら（1）に従い80％エタノー・ルで10分間還流し厚子中の酵素を失宿させてから抽出 した．．失活種子を32メッシュ．に粉砕し，この500gを乃OmJのベンゼンの還流抽出で脱脂してから，糾％エタノー ル1Jで3回避流して抽出した‖ この抽出液を1／5に汲縮し，酢酸鉛で除タンパクし，硫化水素により脱鉛し，さらに エ・−テルで集線束などを抽出除去した後漉縮し，40Cに保って結晶化させたこの粗結晶はさらに水またはエタノー ルで2匝l再結晶させた． アミグダリン（Amy）はVinと同じ方法で市販ビワ（Eγ・よ0あ0かγαメ呼0乃まcα）の種子から単離結晶化したい（7） Vin，Amyの検出には試料の−・部に5％塩酸を加えて加熱し生成する青酸をピクリン酸ナ斗リウム試験紙の赤変す ることで行ない，（6）操作中のVinをどを確認した 薄屑クロマトグラ・7イーI（TLC）Vin，Vicその他糖類の横臥Vicの単離精製にワコーザルB−10を使用した．（展 開溶媒，発色剤については実験結果の項参照） ガスクロマトグラフイ・−（GLC）によってVin，Vicその他糖類の定性確認を行なった．これらはすべてBROBST ら（18）の方法によりTMS化しGLCに供したGLC装置は日立K23型，FID，カラム：SE−30，ChromosorbWAW， 80−100メッシュ，3mmβ×1m，1700−3000C昇温または3000C定温によった． 吸収スペクトルおよび旋光度測定 Vin，Amyの結晶については赤外線吸収スペクトル（IR）と紫外線吸収スペクト ル（UV）を，VicについてはIRを測定した小IRは日立EPl−G2型回折格子赤外分光光度計，UVは日立139塾分 光光電光度計によったい また施光度測定は柳本OR−10型を使用した． ビシアナーゼとその活性測定前報（14）と同様に生種子を32メッシュ．に粉砕し，7倍盈の水を加えてホモジナイザ・− で強く教伴し，その遠心分離（15，600×G）の上滑を水に対して40C2日間透析して粗野紫波とした．．基質として先 占と単離したVinを用い，分離生成した還元糖をSoMOGYI法で測定し，GIc盈としてビシアナ1−・ゼ活性を表わした． この活性測定については反応液のpH，温度，反応時間などを検討した．．（実験結果の項参照） 実 験 結 果 1小 ビシアニンの単離とその性質 カラスノエンドウの風乾種子500gから粗結晶1．4gのVinを得た＝ これを再結晶して水からは3−5mm長の針 状結晶，エタノールからは微針状結晶を得た‖ これらの再結晶化は比戟的容易であった． a．融点および比施光度．得られたVinの結晶についての測定結果を文献億とともにTablelに示す
rablel．Themcltingpolntandspecificrotationofvicianin
Found Literature mpり Recrystal1izedfkOmWater 1460C 147−8◇Cl） RecIγStalli2：edfiomethanol1680C 174−50CIS） ［α】DRecrystallizedfkOmethanol−18い50 −20．701），−20．，0015）笠井 忠，岸本雅夫，川村信一郎：ビシアニンとビシアノ・−スの性質 113 b‖ 呈色反応，溶解性．Vinの結晶に濃硫酸を加えて放置すると赤桃色を呈する．加熱によりこの呈色は早くなる・ Vinを希塩酸とともに加熱するとピクリン酸ナトリウム試験紙を赤変させる．・7ェノ・−ル硫酸法（1ので橙色を呈し， アントロン硫酸法（17）で糖色を呈する．遼元性はないり ビリジン，熱水に容易，水には約1％溶ける（200C），エタ ノールには難溶，エ・−テル，クロロホルム，ニ硫化炭素，酢酸エチルにはほとんど溶けをい． c… TLC．ワコ1−ゲルB−10の薄層に5種類の展開溶媒で展開したときのRf備を比較のためのGIcとAraのそれ とともにTable2に示す。このTLCの発色には硫酸を用いたが−・般糖類の発色剤ジフ．‡．・＝Iルアミンア＝・リン試 軋（18）アニリン水素フクレーl、試薬（19）をどでは発色しない．♪・−アニシジン塩酸塩試薬（紬ではわずかに紫色のス ポットを与える． Table2RfvaluesofvicianinonTLCchomatograms
ニ＝
a 、 b c d e 051 0．58 0．56 巾4∫7 45 65 ．38 43 55 1 0 4 ︻J 6 6 ∩“ Vicianin Oう8 Arabinose ．45 Glucosc ．38 ＊a：Ethylacetate，Pyridine，Aceticacid，Water（30‥11：1‥6） b：Ethylacetate，Methanol，Aceticacid，Water（60：15：15＝10） c‥ ChloIOform，Methanol（6：4） d：n−Butanol，Aceticacid，WateI（4：1：2） e：n−Butanbl，Pyridine，Ben2：ene，Water（5：3：3：1） Stainingreagent‥Sulfuricacid・21） dい GLC、TMS化Vinはカラム温度3000Cで保持時間10分に鈍くピークを生じた（Fig．1）同じくSac，Vin，Amy の等モル混合物ではFig．2に示すようにそれぞれ3，10，15分の保持時間であった むSuOdおトレ名JOUむ出 翳已Ods巴h名JOUむ出 20 10 Retention time（min） 10 Retention time（min） Fig。2．Gas−1iquidchromatogramofTMSderivatives Of−saccharose，vicianin，andamygdalin（1：1： Figl1r Gas−1iquidchromatogramof．TMSderivative ofvicianin Column：10％SE−30ChomosorbWAW，3mmxlm， 1）mixture・ stainlesssteel，COlumntemperature：3000C e．IRおよびUV．無水Vin，同Amyの結晶をKBI錠剤として4，000T400cm−1の赤外吸収スペクトルをFig”3， 4に示す． Vin2．118mgを水5mlに溶解し，光路1cm，水を対照として200−340nmの紫外部吸収を，同様のAmyととも に測定した結果をFigい5に示す．．この両物質とも262nmに吸収がみられた．香川大学農学部学術報告 第32巻 第2号（19飢） 114 2，0001，8001，6001，4001，2001，000 800 600 400 Wave number（cm￣1） 4，000 3，000 Fig…3…Infiaredspectrumofvicianin（KBr）・ Fig4．Infiaredspectrunofamygdalin（KBr）・ 220 260 300 Wavelength（nm） Fig．51、Ultravi01etspectraofvicianinandamygdalin・ 2．ビシアノースの単離とその性質 Vin3mgを0．1，1い0，5．0％の塩酸それぞれ5mlとともに封管，沸騰湯浴中で30分間加熱した加水分解物をTLC， GLCで調べた．この結果をFig．6，7に示す．5％塩酸で完全に加水分解されAra，GIcのみが，0．1，1L0％塩酸で はこの他に未分解のVinとプルナシンと思われるスポットやピークが確認された． 前報（14〉のようにこ．のカラスノエンドウ種子抽出粗酵素液によって種子中の糖類がVicやさらにGle，AI・aに分解
笠井 息，岸本雅夫，川村信一郎‥ビシアニンとビシアノ・一・スの性質 115
⑳⑳
0
く尋診⊂） ◎ （盛診 ◎ 0−−01−O a b C Rf O 2 4 6 ・8 1lO Figl6r ThinlayerchromatogramofhydrolyzatesfkOmvicianinbyacid Vicianinwasheatcdinboilingwater with01（a），1l0（b），Or510（c）％HClfbr 30min．Solvent system：Ethylacetate，Methanol，Acetic acid，Water（60‥15： 15：10），aSCendingmethod，Stainingreagent：SulfhricacidむS已Ods巴一名LOUU出
20 Retention time（min）
10
Fig・7lGas−1iquid chomatograms ofTMS derivatives ofhydrolyzates丘Om Vicianin with1．0（a），0。l（b），and5”0（c）％HCl
ColumnisthesameasshowninFig‖1exceptfortemperaturewhichisraised
fkom170OCto3000CbylOOC／min
されることから，VinからVicへの酵素反応の最適条件を検討した．（3．．ビシアナ・−ゼの項参照）Vin結晶の1％ 溶液に粗酵素を加え300Cで0．5，1，2，4，8，12時間インキュベー・ トしてその変化をGLCで調べた．その結果Vic
香川大学農学部学術報告 第32巻 第2号（1981） 116 と思われる二糖顆のピー・クが，インキュベ・−ト2時間まではその時間とともに増加し，その後は減少したい またGk やAI・aが認められるほどのピ・−クを生ずるのは4時間以上のインキエペ・−トであったu このことからこの粗酵素液 を用い，1時間のインキュ．ベ・−トでVinからVicを遊離させることとした・ Vicの単離はBERTRANDらの方法も参考にしてFig．8のように，Vinl％溶液40mlに同盈の粗酵素液を加え 300C，1時間インキエペ1−・卜してVicを遊離させ，TLCで精製した．得られた糖は1％塩酸で加水分解してGLCで GIcとAraからなる二糖類であることを確認した．（FigL．9） 1％Vicianin（40mJ） Ol・’14’（40ml） Inc。bati。 L Heating（inboilingwaterfbr2min）
『 ＝（5，000×G，10min）
Ppt，・ Sup 1 Puri丘cation（TLC）＊ ！ Vicianose ＊PreparativeTLC，plate：WakogelB−10（Ol25×200×200mm），SOIventsystem：Ethyl acetate，Pyridine，Aceticacid，Water（30‥11：1：6） Fig．8．Isolationofvicianosef王omvicianin 霊UOdおhhむpレOUU出 20 Retentiontime（min） 10 Figr9r Gas−1iquidchromatogramofTMSderivativesofhydrolyzatefk・Omtheisolatedvicianose ColumnisthesameasshowninFig．1exceptfbrtemperature（1700C）Table3。Rf values of vicianose on TLC cho−
matogramS Vicの性質 得られた二糖類Vicは比旋光度〔α〕♪＋32．50（H20） であり，種々の溶媒による展開のTLCRf偲はTable 3に示したようにSacよりやや小さい値であった． Fig．1と同条件のGLCでVicのピ1−クは保持時 間3分に，同じくカラム温度2700Cとした場合8分 にピークを示した．Vic をKBr・錠剤としたIR を Fig．10に示すい Solvents＊ a b c e Vicianose O，20 0，．42 0‥25 0。24 Saccharose 25 ．52 ．28 ．28
＊SoIvent systems are the same as shownin Table2．
3．ビシアナ・−ゼ
VinからVicを得るため種子抽出粗酵素液をそのまま用いた場合によっては生成したVicも分解する（14〉ので最 適条件を検索した．（Vic単離の項参照）0…05M酢酸緩衝液0．4ml，25mMVinO．4ml，粗酵素液の80倍稀釈液0・2ml
笠井 忠，岸本雅夫，川村信一・郎；ビシアニンとビシアノースの性質 117 2，0001，8001，6001，4001，2001，000 800 600 400 Wavenumber・（Cm￣l） Fig，10．．Infkaredspectrumofvicianose（KBr）… 0 ︵Otじの再一2＼ちuヱ念欄AH︸Uく ′ ○ノ〉 ○一 し√ t1 ‘ ■ 0 20 40 60 Tirne ofincubation（min）
Fig 11 Reaction time vs activity curve
Thereactionmixture（1Oml）containingO…05Macetatebu庁h（pH4l0），25mMvicianinand
extractcdenzymewasincubatedfbrOto60minat300Candthercducingsugarwasdetermined
bySomogyi’smethodasglucosc 0 ︵U−じSd叫∈＼ち∈ヱ念︻ムー︶U＜ 5 7 9 0 ︵U︼US両石−＼ち∈ヱ舎雇︶U4 20 30 40 50 60 Temperatureofreaction（’C） 70 30 5O pIi Fig．12Efftctoftemperatureonenzymeactivlty Fig・13lEfrtctofさHonenzymeactivlty Theen2：ymeaSSayWaSperfbrmedasshowninFig TheenzymeassaywasperfbrmedasshowninFig11 11exceptft＞rtemPeratureSat20to60OCfbr30min“ exceptforpH3・Oto7・Oandincubationtimefbr30min の混合物を反応液として，pH4．0，温度300C，0−60分間インキ．ユ．ベ・−卜したときの活性をFig・11に，同じく反応液 をpH4，．0，温度20−600Cで30分間インキエペー卜したときの活性をFig叫12に示す．また同じく反応液をpH3・ト0−8・0， 温度300C，30分間インキエペ・N−卜したときの活性をFigい13に示す．Vicの代りにAmgを用い同様300C，6時間イ ンキエペートしたが全く分解されをかった 考 察 この研究で得られたVinの結晶はTablelに示したように融点が，水からの結晶ではほぼ文献俺と−・致したが他香川大学農学部学術報告 第32巻 第2号（1981） 118 はやや低めである… しかしIRスペクトルの2250cm￣1の吸収からニトリル，750，700cm￣1から芳香核などが，ま たUVスペクトルでベンゼン骨核に起因すると考えられる262ヱ1mの吸収がみられること，ピクリン酸ナトリウム試 験紙に対して陽性であることなどAmgと同様であるu 加水分解でAI・a，GIcやこれからなる二糖類を生成すること などVinであることが確認できるh Vinの加水分解物のGLCでGIcより少し遅れて，未分解のVinよりも早くに 小さいピpクがみられる，（Fig．7）これはVinからAra残基のみとれたプルナシであると考えられる小 TLCではVinは一・般糖類に比較して大きをRf借を示し，糖発色剤で発色しないかあるいば非常に発色が弱い，． このことばRfがAraのようをベントースよりやや大きいので，Vinが共存する場合，このような糖スポットは重な り妨零されることも考えられる． Table4”Melting polnt and speci6c rotation of
dciano5einユitefatuヱe5 Vinから種子抽出酵素によって得た糖は盈的にも少 ないこともあって結晶化できなかった，TLCで椅恕， アルコール沈殿として白色粉末を得たもので明確を融 点を示さず，比旋光度もTable4に示すような文献値 よりやや低い借となり純度は高くないと思われた．し かし加水分解によってGIc，AIaが等モル比で得られ たこと（GIc，Ara棟品の等モル混合物のGLCピ−ク 比がFig9 と同じである），保持時間がSacより長 Authors m．p‖（OC） ［α】D（0） Bertrandetal．豆） 210 ＋39．72 Heris5eyetal4） 205−2ユ0 ＋38．98 Helfヒrichetal10） 210 ＋395 Ⅵ7allenfもIsetal小12） 210 ＋37．2 いこと，主ピーークの前に小ピ・−クがみられアノマ一興牲体が存在すること，またWAllENFヱ上Sら（12）のVic合成の ときAra，GIcからなる他の二糖類については比旋光度が大きく異なるのでその区別が容易であることなどからVic と同定できる． Vinの酸加水分解ではVicを遊離しない一 VinよりもVicの方が分解されやすいためと考えられる∫したがって ここでは種子抽出酵素を利用した．この粗酵素液には種々の少糖類分解酵素が含まれており，Vic分解酵素ピシアノ シダー・ゼ（β1−いarabinosidase，EC3．2…1．88）の存在も考えられる（14）がビシー7ナーゼ活性がこれを上まわり，短時 間の処理でVicを得ることができたいP昌ENAR ら（22）はダイコンソウの−・種（Gβ〟∽〟γろα乃α∽）に存在するゲインに 特異的なゲアーゼについて報貸している．これによればゲアーゼはゲインをVic とオイゲノー・ルに分解するがVic は分解されないとある．またⅥ最α偶の植物から得た酵素では最初短時間の内にゲインをVic とオイゲノ・−ルに分 解するが，しばらぐするとVicはGIcとAraに分解されるとしている． カラスノエンドウ種子には青酸配糖体Vinが含まれるとともにこれの分解酵素ピシアナ‥−・ゼがある∩ この酵素は EC3′′2ノ′1に属するがまだよく研究されていをいものである，（Z8）種子が傷つくをどによりビシアナーゼ作用でVicを 遊敢すると同時に青酸を発生することになる．このようなことば審虫などに対する防衛という意味があると考えられ る．この抽出粗酵素液がAmyを全く分解しないので，同様な配糖体合着の種子であってもその糖構造の相違と同様 に，その代謝系酵素についても異なり特異的をものであると考えられる… 謝 辞 この研究を行なうにあたり蟄重なご助言をいただきました香川大学教授鈴木裕先生に感謝いたします この研究の大要は日本虚芸化学会関西・中部支部合同大会（昭和50年10月11勘 奈良）において発表した． 引 用 文 献 （1925） （5）HERISSEY，HandCHEYMOL，，．：Ibir4，，183，1307 （1926） （6）岡本敏彦，村上孝夫：天顔物化学，84，東京，鹿 川番店（1970）． （7）小幡弥太郎：農化，10，1224（1921） （8）PICARD，D‖：Cb呼乙Re乃dl．月bあd．励αW￠ざAcαd （1）BERTRAND，G。and MAqUENNE，L“：Co呼t Rg乃d．月盲あd．滋α乃C郎Acαd．＆よ1143，832（1906） （2）BERTRAND，G．andWEISWEILLER，G．：1bidい147， 252（1908） （3）BERTRAN工），Gい，and WEISWE工LLER，G．and MAqUENNE，L．：乃よd．，150，180（1910） （4）HERISSEY，H“and CHEYMOL，J．：Ibid”，18l，565
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