優良盲導犬の育成に関する生殖工学的研究代表者 : 鈴木宏志 ( 帯広畜産大学原虫病研究センター ) 責任機関 : 帯広畜産大学 I. 研究の全体計画 1. 研究の趣旨視覚障害者の生活の向上に資するために, 生殖工学によるイヌの人工繁殖技術の開発とその応用によって, 我が国における盲導犬の質の改善を

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優良盲導犬の育成に関する生殖工学的研究

代表者：鈴木　宏志（帯広畜産大学原虫病研究センター）責任機関：帯広畜産大学

I. 研究の全体計画

1. 研究の趣旨視覚障害者の生活の向上に資するために，生殖工学によるイヌの人工繁殖技術の開発とその応用によって，我が国における盲導犬の質の改善を図ろうとするものである。より具体的には，精子の凍結保存法と人工授精法の確立による海外からの遺伝子資源の導入と確保，および胚の凍結保存法の確立による育種の促進を図り，優良盲導犬の効率的な確保を推進する計画である。我が国に導入された盲導犬の汎用犬種であるラブラドールレトリバーでは，補助犬としては不適格な股関節形成不全症や進行性網膜委縮などの重篤な遺伝性疾患のキャリアーが高頻度で存在することが明らかとなってきており，緊急な対処が必要である。また，我が国のイヌの人工繁殖技術は欧米のみならず，近隣国と比べても立遅れており，視覚障害者に優秀な盲導犬を提供するためには，早急なキャッチアップが求められる。そこで本研究では，精子の凍結保存技術と人工授精技術を確立するとともに，海外からの遺伝子資源の導入を図り，遺伝子バンクを設立する。また，胚の凍結保存技術と受精卵移植技術の開発によって，雌側からの優良盲導犬の育種スピードの促進をも図る。本研究は動物の遺伝子資源の確保と流通の促進を図る生殖生理学的，生殖工学的研究と，この成果を盲導犬の育成，実用過程で検証する二つの過程から構成され，単独府省では対処が難しいかと思われる。また，これらの二つの構成要素について，生殖工学研究に精通している研究機関と，この成果を検証，実用化する機関の双方が一体となって推進することが必要であると考える。 2. 研究の概要 a. イヌ精子の超急速凍結保存法の開発に関する研究フィールドでの精子の凍結を可能とする簡便な凍結保存法を開発する。これまでの精子の凍結保存は，煩雑な操作を要するので，実用性に難点がある。16 ～ 17 年度においては，帯広畜産大学にて糖類を凍結保護剤とした凍結保存液を開発し，簡便で実用性の高いイヌ精子の凍結保存法を開発する。 (1) 糖類を凍結保存液としたイヌ精子の耐凍能に関する研究マウス精子の超急速凍結保存法に用いられている凍結保護剤の組成を改良し，イヌ精子の凍結保存に適した凍結保存液を開発する。 (2) 凍結融解精子の評価法に関する研究凍結融解後のイヌ精子のin vitroにおける正常性の評価を可能とするために，先体膜の安定性や受精能に着目したアッセイ系を開発する。 b. イヌの人工授精法の開発に関する研究イヌの生殖器は解剖学的に特徴的であるために，精子の生殖道内への注入が容易ではなく，さらに大型犬であるラブラドールレトリバー種では，一般的な内視鏡の使用は困難である。そこで，大型犬の人工授精法を確立するために，ヒト用膀胱鏡を用いた人工授精術を開発する。北海道盲導犬協会において，16 年度は人工授精術の開発，17 年度では海外からの凍結精子を導入して盲導犬の繁殖に応用し， 18 年度には産仔の能力検定を実施する。また，人工繁殖においては親子鑑定が必須となることから，帯広畜産大学では，17 年度に親子鑑別法を開発する。 (1) ヒト用膀胱鏡の応用による大型犬の人工授精法の開発大型犬における再現性の高い人工授精法を開発するために，ヒト用膀胱鏡を応用して，新鮮精液および凍結精子を用いた人工授精を行い，超音波診断装置による妊娠診断によって受胎率を判定する。 (a) ヒト用膀胱鏡の応用による大型犬の人工授精法の開発北海道盲導犬協会では，ヒト用膀胱鏡を応用して大型犬における再現性の高い人工授精技術を確立し，国内外の優秀な雄犬の精液を使用することで，優良盲導犬の育成を図る。 (b) ヒト用膀胱鏡の応用による人工授精法の開発およびこれを支援する新規技術の開発ヒト用膀胱鏡を用いた人工授精法の確立と盲導犬への応用を果たす。帯広畜産大学では，主に精巣上体精子の凍結融解精子による人工授精と凍結融解精子の授精能力を検定する。これに加え，卵巣の凍結保存および卵巣移植技術の開発も実施する。 (2) 授精適期の判別法の開発に関する研究イヌの排卵時期の適切な把握は，現在でも困難であるが，加齢性の変化への対応は全くなされておらず，人工繁殖の再現性の確保には重要な課題である。そこで，ホルモンレベルと内視鏡検査像を指標とした加齢に伴う授精適期の判定法を開発する。

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(3) 親子鑑別法の開発雄の後代検定を効率的に実施するためには，1 頭の雌に複数の雄由来の精子を注入して産仔を得て，それらの産仔の能力検定を実施することが望ましい。これを可能とするために，サテライトマーカーを用いた DNA 診断による親子鑑別法を開発する。 (a) 親子鑑別法と産仔の能力検定法の開発雄犬の後代検定には，1 頭の雌犬に複数の雄由来の精子を注入して産仔を得て，それらの産仔の能力検定を実施するのが効率的である。また，人工繁殖においては，親子関係の保証が必要である。帯広畜産大学では，産仔の能力検定の一環として，サテライトマーカーによる親子鑑別法の開発・実用化を図る。また，疾患・性格関連遺伝子のジェノタイピングを実施して，優良盲導犬の選抜に寄与する。 (b) 産仔の能力検定のための比較ゲノム解析遺伝子解析により優良犬を選別し，盲導犬に適した子犬を育成することによって，盲導犬合格率を向上させるとともに，イヌの性格の理解を強力に押し進めるためには，ゲノム情報の取得が必要不可欠である。理化学研究所では，ラブラドールレトリバーのゲノム BAC ラブラリーの構築および BAC クローン整列によるゲノム地図を作成することにより，遺伝性疾患の回避および性格関連遺伝子の同定のためのゲノム基盤情報を提供する。 (4) 海外からの凍結精子の導入と人工繁殖の実用化優良な盲導犬の遺伝子資源の確保を目的として，海外の先進施設からの遺伝的背景が明確な凍結精子を導入して人工授精による繁殖の実用化を図るとともに，得られた産仔の盲導犬としての能力検定を実施する。 (a) 海外からの凍結精子の導入と人工繁殖の実用化北海道盲導犬協会では，優良な盲導犬の遺伝子資源の確保を目的として，海外の先進施設からの遺伝的背景が明確な凍結精子を導入して人工授精による繁殖の実用化を図るとともに，得られた産仔の稟性，健康面の能力検定を実施する。 (b) 海外からの凍結精子の導入と人工繁殖の実用化および SP の設定と検査系の開発帯広畜産大学では，北海道盲導犬協会と協力して，海外からの凍結精子の導入と人工授精によって優良な盲導犬の増産を図るとともに，得られた産仔の能力検定を実施する。また，エンドユーザーに安全で安心な盲導犬を供給するために，特に，人獣共通感染症に着目した盲導犬の Specific Pathogen の設定と検査系の開発を実施する。 c. イヌ胚の凍結保存法および胚移植法の開発に関する研究盲導犬では，訓練開始に先立って避妊手術を施すために，優秀なイヌであっても次世代を残すことができない。そこで，避妊手術前に人工授精を施して胚を回収し，これを凍結保存しておけば，能力検定後に優秀な雌の次世代を確保することが可能となる。17 ～ 18 年度においては，帯広畜産大学にて胚の超急速保存法を開発し，バンキングを開始する。 (1) ヒト用膀胱鏡を用いた胚の回収方法の開発ヒト用膀胱鏡とバルーンカテーテルを用いた子宮角からの桑実胚および胚盤胞の回収法を開発する。 (a) ヒト用膀胱鏡を用いた胚の回収方法の開発北海道盲導犬協会では，ヒト用膀胱鏡を用いて胚の回収を行い，胚の凍結保存技術と受精卵移植技術の開発によって，雌側からの優良盲導犬の育種スピードの促進をも図る。 (b) ヒト用膀胱鏡を用いた胚の回収方法の開発および未成熟卵子の人為的成熟法の開発帯広畜産大学では，北海道盲導犬協会と協力して，ヒト用膀胱鏡を用いた胚の回収方法を開発する。卵巣摘出前に人工授精を施し，受精卵子を回収することによって，遺伝子資源を確保，有効利用するシステムを開発する。特に，摘出された卵巣の有効利用を図るべく，未成熟卵子の人為的成熟方法の開発を行い，遺伝子資源の一層の有効利用を目指す。 (2) イヌ胚の超急速凍結保存法の開発マウス胚の凍結保存液である DAP213 を基本としたイヌ胚用の保存液を開発して，イヌ胚の超急速凍結融解法を確立する。 (a) イヌ胚の超急速凍結保存法の開発人工授精後に子宮から回収された胚，および未成熟卵子の人為的成熟後に精子を注入して受精させた卵子をバンキングするためには，胚の凍結保存法の確立が必須である。帯広畜産大学では，イヌ胚の超急速凍結保存法の開発を行う。 (b) イヌ胚の超急速凍結保存法の開発，特に受精卵の発育に及ぼす要因の解析岐阜大学では，雌犬の内分泌状態をモニターして精査し，人工授精後における受精卵の発育との関連性を検討する。 (3) イヌ胚の子宮内移植法の開発ヒト用膀胱鏡を用いた胚の子宮内移植法を開発する。 d. 優良盲導犬の遺伝子バンクの構築 18 年度には，帯広畜産大学において，海外から導入した精子および本研究で開発された凍結保存法による精子，胚のバンキングを行うことによって，国内外の遺伝子資源の需要に対応する体制を構築する。また，海外の研究機関も含めた遺伝子資源データベースの構築を実施する。 (1) 優良盲導犬の精子，胚の凍結保存による遺伝子のバンキング実用化凍結精子および胚の情報を広く公開して，内外の優良盲導犬の需要に対応する体制を構築するとともに，世界の主要機関のデータベースを構築して情報の収集，提供を図る。 (a) 優良盲導犬の精子，胚の凍結保存による遺伝子のバンキ

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ング実用化帯広畜産大学では，盲導犬の人工繁殖技術を確立し，海外からの遺伝子資源の導入を図るとともに，遺伝子バンクを設立する。本研究課題の成果を全国の盲導犬施設に波及させるためには，国内の遺伝子資源の需要に対応することができるような盲導犬の遺伝子バンクの構築が不可欠である。本バンキングにおいては，盲導犬種の生殖細胞のみならず，盲導犬のゲノム DNA，血清，病歴，家系などについても保存とデータベース化 (K9 バイオバンク )，優良盲導犬の育成に貢献する。 (b) 遺伝子バンクデータベースの構築とその実用化生物遺伝資源情報総合センターでは，バンクに保存している優良盲導犬の胚・精子の基本情報，および当該犬の個体情報（血統，病歴，病因遺伝子，家系など）をデータベース化し，ユーザーに対して必要な情報へのアクセスと情報の有効活用を可能とする。 3. 年次計画

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III. 研究運営委員会

IV. ミッションステートメント

我が国においても，盲導犬，聴導犬，介助犬など，いわゆる補助犬の社会生活へのアクセス保障のみならず，補助犬の育成や使用者の責務までに踏み込んだ法整備が開始された。しかしながら，生物学，獣医学的な観点から補助犬の適切な活用および育成を支えようとするアプローチはほとんど見られない。社会生活の多様化，医療の発達あるいは超高齢化社会の到来によって，補助犬の用途が細分化されてきている現状を鑑みた場合，各種補助犬に要求される能力とその適合犬種の選定のための行動学，遺伝学的研究や補助犬の社会への浸透を確保するためのイヌ由来の人畜共通感染症に関する公衆衛生学的研究を含めた，新しい視点からのいわゆる「イヌ学」を総合的に推進する必要がある。その一方で，基礎となる遺伝子資源の確保，保存，利用のための繁殖生理学，特に生殖工学的研究の立ち遅れがこれを阻んでいる。イヌの繁殖生理に関する研究は，世界的にも進んではいないが，我が国の水準も決して高いとは言えず，早急なキャッチアップが必要である。身体障害者補助犬の導入によって自立と社会参加を果たし得る障害者

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は数多く存在しており，その普及には，社会的受け入れ体制の整備とともに，良質な補助犬の育成体制の整備が不可欠である。我が国の盲導犬は，現在，約 900 頭が実働しているが，盲導犬希望者は約 4800 人，潜在的希望者も加えるとその需要は約 7800 人と推定される。年間の盲導犬供給数は全国で 130 頭程度であり，ここ数年，横ばい状態が続いている。盲導犬の安定的，効率的繁殖は，最も重要な課題のひとつであるが，現在，全国の盲導犬訓練施設で使用されている繁殖犬はわずかに 80 頭余りで，優れた種雄，台雌の確保が困難であること，外国から導入した繁殖犬の質が不安定であること，盲導犬の合格率（適格犬数率）のばらつきが大きいなどの問題を抱えている。このため，雌雄の組み合わせを配慮した交配などによって質の良い盲導犬を供給する試みが個々になされているが，抜本的な解決策ではない。また，盲導犬は雌雄ともに避妊・去勢を受けた後に訓練を開始するために，優秀な盲導犬であってもその遺伝子を繁殖によって次世代に伝える術がない。歴史の浅い他の補助犬の育成，利用に至っては，その過程のすべてを民間ボランティアの活動に頼っており，適切な犬種の選定，繁殖システムなどについて，手探りの状態が続いている。さらに，我が国に導入されているラブラドールレトリバーについては，補助犬としては不適格な股関節形成不全症や進行性網膜萎縮などの重篤な遺伝性疾患のキャリア－が高頻度で存在し，今後の補助犬の繁殖育成を鑑みた場合，緊急に対処を要する状況にある。本研究の成果は，これらの状況を大きく改善することに寄与することを目的とし，以下の具体的達成目標を掲げる。 1. 精子，胚等の遺伝子資源を凍結保存する技術を開発するとともに，当該技術により遺伝子バンクを設立し，海外からの遺伝資源の導入・保存，国内において得られる遺伝子資源を保存する。また，遺伝子バンクに保存している遺伝子資源の情報のデータベースを構築する。このデータベースには世界の主要機関の情報も含まれる。 2. 凍結保存した精子，胚等の遺伝子資源を利用し，盲導犬の安定的・効率的な繁殖・育成を実現するため，人工授精法，胚の回収法，胚の子宮内移植法を開発する。 3. 優秀な遺伝子資源の選抜を実現するため，雄の能力の後代検定（台雌に複数の種雄候補を交配させ，その産仔の能力により種雄候補の能力を判定）に不可欠な親子鑑別法を，マイクロサテライトマーカーを用いた DNA 診断技術により開発する。また，この一環で，性格関連遺伝子の多型に基づいた盲導犬適正の分類を行うとともに，進行性網膜萎縮等の疾患関連遺伝子を特定するための基礎となるラブラドールレトリバーのゲノム地図を作成する。本研究の成果として稼働させた盲導犬の遺伝子バンクについては，遺伝的背景の明確な凍結精子の導入や人工繁殖に関するサービスの提供およびデータベースの構築を通して，帯広畜産大学と北海道盲導犬協会，岐阜大学，遺伝学研究所および理化学研究所との連携の下，アジアの拠点として育成する。さらに，行動学，公衆衛生学，育種繁殖学を含めた，新しい視点から補助犬に関する総合的な研究を推進するために，盲導犬の遺伝子バンクを基礎とした補助犬繁殖育成研究センター事業へ発展させ，盲導犬のみならず，介助犬，聴導犬を含めた補助犬の優良遺伝子の供給源として，内外への貢献を果たす。特に，補助犬の適切な養成と日常的な社会参加を充実させるための優良遺伝子の確保とその有効利用に関する研究，およびイヌ由来の人畜共通感染症の調査研究を，それらの対策を含めて推進する。帯広畜産大学は，人畜共通感染症研究に十分な実績を有するとともに，冷涼な気候とフィラリアフリーの環境にあることから，盲導犬研究に至適な条件を備えている。また，本研究の遂行は，これまでの臨床中心のライセンス教育から，実学的研究基盤に基づいた社会福祉，障害者支援に資するための獣医学教育への変革の礎となるものと考えられる。