ウメおよびカキ果実の栽培から一次加工における微生物制御に関する研究

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(1)ウメおよびカキ果実の栽培から一次加工における微生物制御に関する研究. 博士学位論文. ウメおよびカキ果実の栽培から一次加工における微生物制御に関する研究. 村. 近. 畿. 大. 学. 大. 学. 院. 上ゆ. 生物理工学研究科生物工学専攻. かり. 村上ゆかり.

(2) 博士学位論文. ウメおよびカキ果実の栽培から一次加工における微生物制御に関する研究. 平成 24 年 6 月 30 日. 近. 畿. 大. 学. 大. 学. 院. 生物理工学研究科生物工学専攻. 村上ゆかり.

(3) 目次. 序論. １. 第１章ウメ果実第１節ウメ果実の栽培から収穫における微生物制御１．材料および方法２．結果および考察. ５ 13. 第２節ウメ果実の収穫後から一次加工における微生物制御１．材料および方法. 23. ２．結果および考察. 28. 第３節総合考察. 44. 第４節摘要. 48. 第２章カキ果実第１節カキ果実の栽培から収穫における微生物制御１．材料および方法. 50. ２．結果および考察. 54. 第２節カキ果実の一次加工における微生物制御１．材料および方法. 65. ２．結果および考察. 69. 第３節カットカキの貯蔵・流通中における微生物制御１．材料および方法. 81. ２．結果および考察. 86. 第４節総合考察. 103. 第５節摘要. 108. 総括. 111. 文献. 115. 謝辞.

(4) 序論. 果実は、微生物の侵入を防ぐ果皮の存在や可食部の pH の低さから、交差汚染による微生物の増殖は少ないと考えられてきた。従来、果実に付着する微生物数は野菜に比べて少なく、検出される細菌、酵母、糸状菌も植物病原菌や腐敗原因菌が中心である１）。植物病原菌や腐敗原因菌は、ヒトには直接疾病を引き起こさないが、果実収穫後、貯蔵、輸送および市場で発生する病害（ポストハーベスト病害）を引き起こし、腐敗果が発生して、経済的損失が生じることが知られている２）。さらに、近年では果実および一次加工果実が原因の食性疾患が増加し、米国では 1990 年から 2009 年の間に果実が原因とされる食性疾患は 167 件起こり、9601 人が発症したと報告されている３）。発症例としては、1995 年の非殺菌のオレンジジュースのサルモネラ症４）、1996 年の非殺菌のアップルジュースの Escherichia coli O157:H7４）、1998 年のフルーツサラダの E. coli O157:H7３）の食性疾患がある。このような報告を受け、果実を対象とした微生物汚染の研究が行われるようになった。リンゴ果実では、E. coli O157:H7 を含んだ１％ペプトン水に果実を浸漬したとき、外芯部からの細菌の侵入が最も高かったことが報告されている５）。また、サルモネラ、E. coli O157:H7 または Listeria. innocua をカットリンゴに接種して様々な温度で培養すると、サルモネラおよび E. coli O157:H7 は 20 および 25℃、L. innocua は 10℃下での顕著な増殖が確認されたことが報告され６）、原料果実から加工果実までの微生物的安全性の確立が重要となっている。米国では、青果物の衛生管理法として 1998 年に USDA（米国農務省）、CDC（米国疾病予防管理センター）および FDA（食品医薬品局）が GAP（適正農業規範）４）を発表し、幾つかの農場で実施されている。その後、日本でも農林水産省が 2005 年に「『食品安全のための GAP』策定・普及マニュアル（初版）」７）、2007 年に「基礎 GAP」８）、2008 年に「GAP 手法導入マニュアル」９）、2010 年に食品安全に加え、環境保全や労働安全などの幅広い分野を対象とし、高度な取組内容を含む「農業生産工程管理（GAP）の共通基盤に関するガイドライン」10）が策定され、果樹についてのガイドラインも策定されている。しかし、これらのガイドラインは、栽培から出荷、貯蔵までの全農業工程を対象としているが、果樹の種類別における衛生管理法について 1.

(5) は特記されていない。また、その後の加工までのプロセスを含めた加工果実に対する衛生管理法にも言及されていない。果樹栽培の盛んな和歌山県では、ウメの生産量が全国の 61％を占め. 11）、栽培から. 加工までの一貫した産地を形成している。最も生産量が大きい加工品は梅干で、一次加工として塩蔵処理が行われる。梅漬けや梅干しなどの梅加工品は、高食塩濃度で塩蔵を行うため、水分活性や pH の低下により、微生物汚染が生じにくいと考えられてきた 12）。しかし、近年、消費者の減塩嗜好に伴い、梅加工品は低塩および低酸の傾向を示し 13）、塩蔵工程および製品において微生物汚染が生じ易くなっている 14）。Ozaki ら 15）は、塩漬け梅または調味漬け梅から Candida 属や Pichia 属を分離し、それらの酵母が製造ラインからも検出されたことを報告した。酵母は多くが腐敗原因菌であり、耐酸性・耐塩性の特徴をもち、塩蔵中にも生存が可能で、梅加工品の品質を低下させることが危惧される。恩田ら 16）は、Pichia anomala は培養３日後から皮膜を形成し、その後、梅酢液中の有機酸が急激に減少し始め、20 日後には有機酸はほとんど消滅し、それに伴い pH が 5.9 まで上昇して梅酢液の色調が薄い紅色から茶褐色に変化したことを報告した。このように、梅酢液中の pH が上昇すると、品質低下だけではなく、病原性細菌が増殖しやすい環境になる可能性もある。Conner ら 17）は、E. coli O157:H7 は酸性条件下で 56 日間以上生存したことを報告している。前述のように、加工前の果実は、病原性細菌の内在化が認められていることから、これらの細菌が付着したまま加工されると、加工中も生存し、生の果実からだけではなく、加工後の果実からの食性疾患が発生する可能性も十分に考えられる。一方、和歌山県の特産果樹の一つであるカキの生産量は、全国の 23％である 11）が、近年の消費者の果物離れの影響から消費が低迷している。欧米に比べて低い果実の消費量を上げるためには、果実加工品として需要が増加しているカット果実への利用が期待される。カット果実を製造する上で、剥皮は不可欠な工程である。化学的および機械的剥皮技術が青果物の剥皮に用いられているが、これらの方法は果肉および果汁の損失を引き起こす可能性がある。また、Ukuku ら 18）は、切断処理に用いた器具を介して Salmonella で汚染したカンタロープの果皮からカットカンタロープの果肉に. Salmonella が移行したことを報告し、刃物を介した果皮から果肉への微生物汚染も懸念される。このような問題を解決するために、Bruemmer ら 2. 19）は、果皮に切れ目を.

(6) 付けたグレープフルーツを酵素液に浸漬し、減圧することで剥皮を行う酵素剥皮技術を開発した。この報告を受け、カンキツ果実では、最適な酵素濃度、反応時間、反応温度などを決定するための実験が多数行われている 20）～22）。日本においても、尾崎ら 23）がカキ果実におけるペクチン分解酵素液を用いた酵素剥皮技術で特許取得をした. が、酵素剥皮工程中の果実の微生物叢については調べられていない。また、カット果実は、一般に剥皮・切断することで細胞や組織が傷つけられ、それによって生化学的変化や微生物増殖による品質劣化が起こりやすく 24）、品質を維持することが困難である。このため、カット果実の鮮度保持技術として、Modified atmosphere packaging （MAP）が用いられる。カット果実を最適なガス透過性のフィルムで密封包装すると、フィルム内のガス組成はカット果実の呼吸により低 O2、高 CO2 状態となって平衡となり、カット果実の貯蔵に適した Controlled atmosphere（CA）条件をつくることができる 25）。Poubol ら 26）は、２種類のカットマンゴー‘Carabao’と‘Nam Dokmai’ を空気または３、５および 10％CO2 を通気し、５または 13℃下で CA 貯蔵を行った。その結果、13℃下で貯蔵した‘Carabao’および‘Nam Dokmai’マンゴーの一般生菌数は、貯蔵最終日に空気通気区ではそれぞれ 3.2 および 6.5 log CFU/g であったのに対して、10％CO2 通気区では、それぞれ検出限界値以下または 3.7 log CFU/g となり、カットマンゴーにおける高 CO2 による静菌効果を確認している。また、Bai ら 27）は、カットカンタロープをフィルム（空気充填区および４％O2+10％CO2 充填区）および 1.5mm の小孔を 10 個開けたフィルムで５℃で 12 日間または 2.5℃で２日間+ ５℃で 10 日間の貯蔵を行ったところ、空気充填区では５℃で９日間品質を維持し、４％O2+10％CO2 充填区では、空気充填区よりも明度および彩度が増加し、果肉の透明性、呼吸量および微生物数が低下してさらに高い品質を維持したことを報告した。このように、種々のカット果実における CA/MAP による微生物制御および品質保持の結果が報告されているので、酵素剥皮技術を用いて作製したカット果実の鮮度保持にも MAP 貯蔵が有効であると推定される。そこで本研究では、和歌山特産果樹であるウメおよびカキ果実を対象として、原料果実栽培中の微生物汚染とその制御、並びに一次加工果実の製造中と流通中の微生物汚染とその制御について検討を行った。Izumi ら. 28）29）は、栽培から収穫にかけての. 和歌山県下のカキおよびウンシュウミカン圃場の環境接触物の微生物汚染度を調査し、 3.

(7) 果実栽培時に使用した農業用水および農薬からサルモネラまたは腸管出血性大腸菌が検出されたことを報告している。この報告から、特に果実栽培から一次加工中の食性病原菌による果実の微生物汚染とその制御技術を中心に取り組んだ。第１章ではウメ果実を対象に、ウメ果実の栽培から収穫・選果、収穫後から一次加工（塩蔵）における微生物制御の検討を行い、第２章では、カキ果実を対象に、カキ果実の栽培から収穫、一次加工（カット果実）、貯蔵・流通中における微生物制御の検討を行った。. 4.

(8) 第１章ウメ果実. 第１節. ウメ果実の栽培から収穫における微生物制御. １．材料および方法. １）分析用サンプル、サンプル採取および測定部位（１）栽培時和歌山県田辺市のウメ果実圃場を研究対象とし、圃場を二分して、慣行的に農薬散布を行った対照区と、塩素水を用いて希釈した農薬を散布した塩素水区を設けた。塩素水は、農業用水を有効塩素濃度約 10ppm になるようにケミクロン G（次亜塩素酸カルシウム製剤）（日本曹達株式会社製）を用いて塩素殺菌した水とした。分析用サンプルとしてウメ果実‘南高’ 、栽培中の環境接触物の農業用水、塩素水、農業用水または塩素水を希釈水として作製した農薬（殺菌剤のアミスター10 フロアブル）、農薬散布後の各処理区の土壌、草および収穫用ネットを平成 21 年６月５日に微生物分析に供した。果実は、実験樹（３本）の南側の目線の高さにある果実をサンプルとして採取し、種子を除いた果皮部および果肉部を分析に用いた。圃場で使用した農業用水（河川水）、塩素水、農業用水および塩素水でそれぞれ溶解・希釈した農薬は、それぞれ滅菌済みの 100ml 容のネジ口瓶にヘッドスペースがない程度まで採取し、サンプリングバッグに入れた。土壌は、実験樹の南側の樹冠下の地表部から約 50ｇ採取し、篩にかけて滅菌済みのサンプリングバッグに入れた。この際使用した器具類（篩、受け皿およびスコップ）はすべて滅菌して使用した。草も同様に、70％エタノールを噴霧したハサミを用いて、実験樹の南側の樹冠下の地表面から約 30ｇ採取し、滅菌済みのサンプリングバッグに入れた。各実験樹の下に敷いた収穫用ネットは、表面の微生物サンプリングのため、それぞれのサンプリング箇所を特定し、圃場にて微生物サンプリングを実施した。（２）収穫時栽培時に研究対象とした対照区圃場および塩素水区圃場から収穫した果実を分析サ 5.

(9) ンプルとした。果実サンプルに加えて、収穫時の環境接触物として、各処理区の土壌、草および収穫用ネットを平成 21 年６月 24 日に微生物分析に供した。収穫時の果実は、栽培時と同じ各実験樹の下に敷いた収穫用ネット上に落下した果実をサンプルとして採取し、果皮部および果肉部に分けて分析した。土壌、草および収穫用ネットは、栽培時と同様にサンプリングを行った。２）測定項目および方法（１）pH 農業用水、塩素水および農薬はカスタニーLAB pH メーター（株式会社堀場製作所製：F-22）を用いて測定した。土壌は、土壌１ｇに pH７に調整した１N KCl と 0.1N KOH の混合液 2.5ml を加え、混釈した後１時間放置し、サンプルシートにつけて Twin pH メーター（株式会社堀場製作所製：B-211）で測定した。草は、脱塩水を加えて磨砕してサンプルシートにつけ、果皮については脱塩水に浸したサンプルシートを果皮部に直接つけて 30 秒間放置した後に、また果肉は、サンプルシートを直接果肉部につけた後に、それぞれのサンプルシートを Twin pH メーターで測定した。（２）水分活性土壌、草および果実の水分活性の測定には、水分活性測定システム Aw-パーム（ロトロニック社製）を使用した。付属のサンプルカップにサンプルが約半分（約５ｇ）になるように入れて測定し、各サンプル中の自由水の純水に対する比（Aw）で表した。なお、サンプルはいずれも約 25℃の条件下で測定した。（３）微生物 ⅰ）細菌数および真菌数の測定農業用水、塩素水および農薬１ml をクリーンベンチ内で１枚のシャーレに出現するコロニー数が 30 から 300 になるように滅菌滅菌生理食塩水（NaCl 0.85％）９ml を用いて 10 倍ずつ希釈した。各シャーレに菌液を１ml ずつ加え、一般生菌数の測定には標準寒天培地（日水製薬株式会社製）、大腸菌群数の測定にはデゾキシコレート培地（日水製薬株式会社製）を約 20ml ずつ分注し、混釈して凝固させた。大腸菌群数の培養は通性嫌気性条件下にするため、一度凝固したシャーレに約５ml のデゾキシコレート培地を重層した。真菌数の測定には、ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬株式会社製）にクロラムフェニコール（ナカライテスク株式会社製）を 100mg/l 加え 6.

(10) た培地を用いた。この培地をシャーレに約 20ml 分注して凝固させた後、１枚のシャーレに出現するコロニー数が 10 から 100 になるように滅菌生理食塩水を用いて 10 倍希釈した菌液を 0.1ml ずつ加え、コンラージ棒を用いて培地表面に塗布した。シャーレをパラフィルムでシーリングした後、標準寒天培地は 37℃で 48±３時間、デゾキシコレート培地は 37℃で 20±２時間、ポテトデキストロース寒天培地は 26℃で 72 ±３時間インキュベーター内で培養した。培養後に出現したそれぞれのコロニーをコロニーカウンター（柴田科学株式会社製）でカウントし、農業用水、塩素水および農薬１ml 当たりのコロニー数を対数値で表した。土壌はクリーンベンチ内で 30g 秤量し、滅菌水 270ml を加え、マグネチックスターラー（東京理化器械株式会社製：RCN-3）を用いて 10 分間攪拌し、懸濁液とした。草についてはクリーンベンチ内で 10g 秤量し、滅菌生理食塩水 90ml と共に 190mm ×300mm のストマフィルター（栄研化学株式会社製）に入れ、ストマッカー（ELMEX 社製：Pro media SH-001）で４分間磨砕して懸濁液とした。果実は、１反復につきウメ果実５個を使用した。クリーンベンチ内でメスを使用して果皮部と果肉部とに分け、サンプルとした。それぞれ 10g ずつ秤量し、90ml の滅菌生理食塩水と共にストマフィルターに入れ、ストマッカーを用いて４分間磨砕し、懸濁液を作成した。各シャーレに出現するコロニー数が標準寒天培地およびデゾキシコレート培地で 30～300、ポテトデキストロース寒天培地では 10～100 になるように滅菌水を用いて 10 倍ずつ希釈した。上記と同様に一般生菌数の測定には標準寒天培地、大腸菌群数の測定にはデゾキシコレート培地、真菌数の測定にはポテトデキストロース寒天培地にクロラムフェニコールを加えた培地を使用し、培養後、出現したコロニー数をカウントして土壌、草、果皮または果肉１g 当たりのコロニー数を対数値で表した。収穫用ネットの付着菌数はフードスタンプ（日水製薬株式会社製）を用い、３箇所測定した。一般生菌数は生菌数用・標準寒天、大腸菌群数は大腸菌群用･デゾキシコレート寒天、真菌数は食品真菌用･CP 加ポテトデキストロース寒天のフードスタンプを使用した。測定部位に培地面を 30 秒間押し付け、生菌数用・標準寒天は 37℃で２日間、大腸菌群用･デゾキシコレート寒天は 37℃で１日間、食品真菌用･CP 加ポテトデキストロース寒天は 26℃で３日間培養し、収穫用ネット 100 ㎝２当たりのコロニー数を対数値で表した。 7.

(11) ⅱ）細菌の同定（ⅰ）細菌の培養一般生菌用として標準寒天培地をシャーレに約 20ml ずつ分注して凝固させ、細菌測定時と同様に、凝固した培地上に１枚のシャーレに出現するコロニー数が 10～100 になるように 10 倍ずつ希釈した菌懸濁液を 0.1ml ずつ分注し、コンラージ棒を用いて培地表面に塗布した。シャーレをパラフィルムでシーリングし、37℃のインキュベーター内で 48±３時間培養した。（ⅱ）細菌の分離培養後、培地表面に出現したコロニーを目視で観察し、形状の異なるコロニーをイノキュレーティングループ（Thermo Fisher Scientific 社製：INO-LOOP Inoculating Loops L200-２）を用いて釣菌し、標準寒天培地上に画線塗抹して 37℃のインキュベーター内で培養した。培養後に形成したシングルコロニーをイノキュレーティングループを用いて再度釣菌し、標準寒天培地上に画線塗抹して、確認培養した。栽培から収穫におけるすべてのサンプルから合計 413 菌株の細菌を単離した。菌株を保存する際には５℃のインキュベーターを使用した。（ⅲ）ゲノムＤＮＡの抽出 PrepManTMUltra（Applied Biosystems 社製）を用いて、クリーンベンチ内で分離したシングルコロニーからイノキュレーティングループ（Thermo Fisher Scientific 社製： INO-LOOP Inoculating Loops L200- １）を用いて１菌株取り、 Sample Preparation Reagent 30µl に混釈し、100℃10 分、20℃２分間の熱をかけた後、20℃ 下で 16000×ｇ、３分間、遠心分離（株式会社トミー精工製：MX-205）を行ってゲノム DNA を抽出した。（ⅳ）16S rDNA 領域のＰＣＲ増幅バクテリアの 16S rDNA 領域の増幅にはユニバーサルプライマー（0005F,0531R）を用いた。反応は、１µl 鋳型 DNA、0.25µl 0005F プライマー（４pmol/µl）、0.25µl 0531R プライマー（４pmol/µl）、0.625µl dNTPMixture（タカラバイオ株式会社製:2.5mM each）、0.1µl SpeedSTARTMHS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製 : ５ units/µl ）、 0.625µl 10×Fast Buffer Ⅰ （タカラバイオ株式会社製 :30mM Mg2+plus）、4.15µl 滅菌超純水を混合し、合計７µl で反応させた。反応条件は、サー 8.

(12) マルサイクラー（エムジェイジャパン株式会社製：PTC-100™または Applied Biosystems 社製：2720）を使用して、94℃１分、95℃５秒および 65℃20 秒を 30 サイクルの反応を行い、 16S rDNA の約 1500bp のうちの上流約 500bp を増幅した。 PCR 後の増幅サンプルは、泳動装置（TOYOBO 社製:GelMete2000）を用いて、0.8％アガロースゲル（株式会社ニッポンジーン製）で 100Ｖ、20 分間泳動させた。また、マーカーとしてサイズマーカーλ・HindⅢdigest マーカー（タカラバイオ株式会社製）を使用した。泳動後は、エチジウムブロマイド（ナカライテスク株式会社製）により約 30 分間染色し、増幅の確認を行った。（ⅴ）塩基配列の決定 PCR による増幅後、ExoSAP-IT（USB 社製）を用いて 37℃15 分、80℃15 分の反応をさせてプライマーの除去を行い、DNA を精製した。その後、Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits（Applied Biosystems 社製）を使用して、96℃ 10 秒、50℃５秒、60℃４分の 25 サイクルの反応によりシークエンス反応を行った。反応後、エタノール沈殿により DNA を精製し、20µl の Hi-DiTMFormamide（Applied Biosystems 社製）を用いてサンプルを溶解し、サーマルサイクラーを用いて 95℃２分間の反応を行い、シークエンサー（Applied Biosystems 社製：ABI PRISM 310 Genetic Analyzer）により塩基配列を決定した。（ⅵ）ホモロジー検索による同定 MicroSeq システム（Applied Biosystems 社製：MicroSeq®ID Analysis v2.0）を利用して、システムに含まれるデータベースとの相同性検定により、サンプルから分離された細菌の同定を行った。本実験では相同率が 80％以上の結果を同定菌とした。 ⅲ）真菌の同定（ⅰ）糸状菌および酵母の分離真菌数を測定した培地を同定にも用いた。ポテトデキストロース寒天培地を培養後、培地表面に出現したコロニーを目視で観察し、形状の異なるコロニーを白金耳を用いて釣菌し、ポテトデキストロース寒天培地上に接種して 26℃のインキュベーター内で培養した。栽培および収穫およびにおけるすべてのサンプルから糸状菌は合計 311 菌株、酵母は合計 89 菌株を単離した。菌株を保存する際には７℃のインキュベーターを使用した。 9.

(13) （ⅱ）ゲノムＤＮＡの抽出細菌の場合と同様に、クリーンベンチ内で分離したシングルコロニーから白金耳を用いて１菌株取り、PrepManTMUltra Sample Preparation Reagent100µl に混釈し、 20℃下で 16000×ｇ、３分間、遠心分離を行い、上澄みを８連チューブ（Quality Scientific Plactics 社製）に移した。その後、100℃10 分、20℃２分間の熱をかけた後、20℃下で 16000×ｇ、３分間、遠心分離を行いゲノム DNA を抽出した。（ⅲ）D2 LSU rDNA 領域の PCR 増幅最初に１µl 鋳型 DNA を 0.5µl RNAse と 49µl 滅菌超純水の混合液で希釈し、37℃ で 30 分間反応させた。真菌の LSU rDNA D2 ドメイン領域の増幅には、ユニバーサルプライマー（0308F,630R）を用いた。反応は、１µl 鋳型 DNA、0.25µl 0308F プライマー（４pmol/µl）、0.25µl 630R プライマー（４pmol/µl）、0.625µl dNTPMixture、 0.1µl SpeedSTARTMHS DNA Polymerase、0.625µl 10×Fast BufferⅠ、4.15µl 滅菌超純水を混合し、合計７µl で反応させた。反応条件は、サーマルサイクラーを使用して、94℃１分、95℃５秒および 65℃20 秒を 30 サイクルの反応させた後、細菌と同様に泳動装置を用いて 1.0％アガロースゲルで 100Ｖ、約 20 分間泳動を行った。泳動後は、エチジウムブロマイドにより染色し、増幅の確認を行った。（ⅳ）塩基配列の決定 PCR による増幅後、ExoSAP-IT を用いて 37℃15 分、80℃15 分の反応をさせてプライマーの除去を行い、DNA を精製した。その後、D2 LSU rDNA Fungal Sequencing Kits（Applied Biosystems 社製）を使用して、96℃10 秒、50℃５秒、60℃4 分間の 25 サイクルによりサイクルシークエンス反応させた。反応後、エタノール沈殿により DNA を精製し、20µl の Hi-DiTMFormamide でサンプルを溶解し、サーマルサイクラーを用いて 95℃２分間の反応を行い、シークエンサーにより塩基配列を決定した。（ⅴ）ホモロジー検索による真菌同定 MicroSeq システムを利用して、システムに含まれるデータベースとの相同性検定により、サンプルから分離された糸状菌および酵母の同定を行った。本実験では細菌の場合と同様に相同率が 80％以上の結果を同定菌とした。（４）食性病原菌の検出 ⅰ）サルモネラ 10.

(14) 農業用水、塩素水、農薬、土壌、草、果皮および果肉をサンプルとし、LoopampⓇ サルモネラ検出試薬キット（栄研化学株式会社製）を使用して LAMP 法 30）により検査を行った。農業用水、塩素水および農薬はサンプル 10ml とサルモネラ増菌前培養用緩衝ペプトン水（日水製薬株式会社製）90ml を混釈した。土壌は、微生物測定の際に作成した 10 倍希釈の菌懸濁液 10ml とサルモネラ増菌前培養用緩衝ペプトン水 90ml を混釈した。草、果皮および果肉は、サンプル 10g とサルモネラ増菌前培養用緩衝ペプトン水 90ml をストマフィルターに入れてストマッカーで４分間磨砕し、前培養液とした。それぞれの前培養液を 37℃下で 20～24 時間培養し、増菌培養液とした。 LoopampⓇサルモネラ検出試薬キット中の Extraction Solution for Foods 50µl にサンプルの増菌培養液をそれぞれ 50µl 加え、サーマルサイクラーを用いて、95℃下で５分間の反応を行い、これをサンプル溶液とした。Bst DNA Polymerase １µl および Reaction Mix Sal 20µl がそれぞれ入った Loopamp 反応チューブ（栄研化学株式会社製）に陽性コントロールとして Control DNA Sal を、陰性コントロールとして Extraction Solution for Foods を用い、サンプルを５µl それぞれ入れ、Loopamp リアルタイム濁度測定装置（テラメックス株式会社製：LA-200F）にセットして、約１時間一定温度（65℃付近）で保温することによって遺伝子増幅反応を行った。増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウム（白色沈殿物質）の濁度の変化により、サルモネラの標的遺伝子（侵入性関連遺伝子 invA ）の有無を判定した。 ⅱ）腸管出血性大腸菌上記のサルモネラの有無の検査の場合と同様に、サンプルとパールコアⓇノボビオシン加 mEC 培地（栄研化学株式会社製）を用いて前培養液を作成し、42℃下で 18 ～24 時間培養して増菌培養液とした。LoopampⓇ腸管出血性大腸菌検出試薬キット（栄研化学株式会社製）を用いて、上記のようにサンプルを調整した。 Bst DNA Polymerase １µl および Reaction mix VT 20µl がそれぞれ入った Loopamp 反応チューブに陽性コントロールとして Control DNA VT、陰性コントロールとして Extraction Solution for Foods を使用し、サンプル溶液５µl をそれぞれ入れ、Loopamp リアルタイム濁度測定装置にセットして、65℃で約１時間反応させた。サルモネラの場合と同様に、腸管出血性大腸菌の標的遺伝子（ベロ毒素遺伝子）の有無を判定した。 11.

(15) ⅲ）L. monocytogenes 上記のサルモネラおよび腸管出血性大腸菌の有無の検査の場合と同様に、サンプルとリステリア選択増菌培地（関東化学株式会社）を用いて前培養液を作成し、30℃下で 24 時間培養して増菌培養液とした。LoopampⓇL.monocytogenes 検出試薬キット（栄研化学株式会社製）を用いて、上記のようにサンプルを調整した。 Bst DNA Polymerase １µl および Reaction mix Lis 20µl がそれぞれ入った Loopamp 反応チューブに陽性コントロールとして Control DNA Lis、陰性コントロールとして Extraction Solution for Foods を使用し、サンプル溶液５µl をそれぞれ入れ、約１時間一定温度（ 65 ℃ 付近）で保温することによって遺伝子増幅反応を行い、 L.. monocytogenes の標的遺伝子（侵入性関連遺伝子 iap ）の有無を判定した。. 12.

(16) ２．結果および考察. １）栽培時および収穫時（１）微生物数ウメ果実の栽培から収穫までを対象に、栽培環境接触物（農業用水、塩素水、農薬、土壌、草および収穫用ネット）、収穫環境接触物（土壌、草および収穫用ネット）および果実の細菌数、真菌数、pH および水分活性の結果を表１-１に示した。対照区の農業用水の微生物数は、一般生菌数は１ml 当たりの対数値で 3.1、大腸菌群数は対数値で 1.7、真菌数は対数値で 3.1 であった。農業用水の微生物制御には、Izumi ら 31）がウンシュウミカン果実圃場およびカキ果実圃場で用いた農業用水においてケミクロン G の添加効果を確認したように、ウメ果実圃場においても農業用水にケミクロン G を添加することで、すべての微生物数が未検出となった。ケミクロン G は、有効塩素含有量 70％以上を含む次亜塩素酸カルシウムから成る塩素系消毒剤で、次亜塩素酸の強力な酸化作用によって細菌および真菌を殺菌、またはウイルスを不活化させる. 32）33）. 34）。Zhao35）らは、23℃の水中における大腸菌の塩素殺菌の効果を調査するために、. 0.25、0.5、1.0 および 2.0ppm の有効塩素濃度で、０、0.5、1.0 および 2.0 分間の処理を行った結果、0.25ppm、0.5 分間で 107 以上の大腸菌を殺菌したことを報告している。Zhao らの研究結果と比較すると、設定した有効塩素濃度が高いが、これは農業用水に含まれる有機物により有効塩素濃度が低下することを考慮したためであり、 Zhao らが報告した菌数低下に比べると、本研究の菌数低下は低かったが、ケミクロン G による殺菌効果は十分であった。一方、農業用水に溶解した農薬の一般生菌数は対数値で 2.9、大腸菌群数は対数値で 2.1、真菌数は対数値で 3.2 となり、農業用水の微生物数と差は見られなかった。塩素水に溶解した農薬の微生物数は、一般生菌数、大腸菌群数および真菌数すべて検出限界値以下または未検出となり、対照区および塩素水区の農薬の微生物数を比較すると、塩素水に溶解した農薬の方で微生物の増殖が制御された。それぞれのサンプルの pH は、対照区と塩素水区の間に差が見られ、農業用水が 7.2 であったのに対して塩素水では 8.1、農業用水で溶解した農薬は 7.3、塩素水で溶解した農薬は 7.9 で、塩素水区の方がいずれも高かった。塩素水で pH が増加したのは、次亜塩素酸カルシウムの添加により、水酸化カルシウムが生成したため 13.

(17) であり、この程度の pH の上昇は、農薬としての機能などには影響はほとんど見られない。栽培時および収穫時の土壌の微生物数は、いずれのサンプリング時期も高い値を示し、一般生菌数は１g 当たりの対数値で 5.9～6.4、大腸菌群数は対数値で 4.9～5.4、真菌数は対数値で 5.2～6.0 であった。対照区および塩素水区を比較すると、栽培時の一般生菌数および真菌数で処理区間に差が見られたが、いずれも塩素水区の方が対数値で 0.3～0.5 高い値を示した。草の微生物数も栽培時および収穫時の間に変化は見られず、一般生菌数は１g 当たりの対数値で 6.8～7.2、大腸菌群数は対数値で 5.0～6.2、真菌数は対数値で 6.0～6.9 と高い値を示した。対照区および塩素水区の草の微生物数を比較すると、栽培時の大腸菌群数が対照区の方が塩素水区よりも対数値で 1.2、収穫時の真菌数が対照区の方が塩素水区よりも対数値で 0.8 高い値を示した以外は処理区間に差は見られなかった。ウメ果実圃場の結果は、Izumi ら. 28）29）が調査したカキ. 果実圃場およびウンシュウミカン果実圃場と類似し、高い微生物数を示した。土壌および草の pH は、栽培時および収穫時の対照区および塩素水区の間に差は見られず、土壌では 4.5～6.1、草では 5.4～6.5 であった。また、土壌および草の水分活性も栽培から収穫にかけて処理区間に差は見られず、土壌は 0.962～0.960、草は 0.967～0.972 と高い値を示し、いずれのサンプルも微生物が増殖しやすい環境であった。収穫用ネットの微生物数は、栽培時、収穫時ともに一般生菌数は 100cm2 当たりの対数値で 2.7～2.9、大腸菌群数は対数値で 2.8～3.4、真菌数は対数値で 2.6～2.8 となり、土壌および草と接触していたが、土壌および草に比べて低い値を示した。対照区および塩素水区を比較しても収穫時の大腸菌群数で塩素水区の方が対照区よりも対数値で 0.4 高い値を示した以外は、処理区間に差は見られなかった。栽培時の果皮および果肉の微生物数は、果皮の真菌数が対照区は１g 当たりの対数値で 3.3、塩素水区は対数値で 3.5 であった以外はすべて検出限界値以下または未検出を示した。また、処理区間に差も見られず、農業用水の塩素殺菌による効果は、果実には直接影響しなかった。収穫時の果皮は、栽培時に比べて増加傾向にあり、一般生菌数は栽培時の検出限界値以下から対数値で 0.7 以上増加し、対照区では対数値で 3.1、塩素水区は対数値で 3.8 となり、処理区間に差は見られなかった。真菌数は、栽培時よりも対数値で 1.2 14.

(18) ～2.4 増加し、対照区および塩素水区はそれぞれ対数値で 4.5 および 5.9 を示し、塩素水区の方が高い値を示した。果肉の微生物数は、対照区では微生物数はいずれも検出限界値以下または未検出であった。しかし、塩素水区では、大腸菌群数は未検出であったが、一般生菌数は対数値で 2.6、真菌数は対数値で 3.4 を示し、いずれも対照区よりも高かった。収穫時の果実は、土壌および草の上に直接敷いた収穫用ネットの上に落下し、その果実を収穫する。栽培時の果実よりも収穫時の果実の方が高い微生物数を示したのは、栽培時に比べ、土壌や草と接触する機会が多いため微生物数が増加したと考えられる。カキ果実 28）およびウンシュウミカン果実 29）においても、栽培時に比べて収穫時の方が果皮の微生物数は高くなり、本研究と類似した結果が報告されている。果実の pH および水分活性は、それらが果実の微生物増殖に及ぼす影響を調べるために測定したが、サンプリング時期の違いによる差はなく、果皮の pH および水分活性はそれぞれ 4.3～5.5 および 0.950～0.971、果肉の pH および水分活性はそれぞれ 2.7～3.0、0.952～0.968 であった。（２）微生物種 ⅰ）環境接触物栽培時の環境接触物である農業用水、塩素水、農業用水または塩素水を希釈水として溶解した農薬から検出された細菌、糸状菌および酵母を表１-２に示した。微生物数と同様に、塩素殺菌の効果は微生物種でも顕著に見られた。農業用水からは、水由来の Aeromonas veronii や Vogesella indigofera、土壌細菌の Bacillus megaterium、動物の粘膜に存在する Neisseria canis などを含む 17 属 21 種の細菌、植物病原菌の. Phoma macrostoma や Septoria pistaciae などを含む４属４種の糸状菌が検出された。また、この農業用水を用いて希釈した農薬からは昆虫の病原菌である Bacillus. thuringiensis、緑膿菌の Psudomonas aeruginosa を含む７属９種の細菌、植物病原菌の Pythium pyrilobum を含む４属４種の糸状菌、産膜酵母の Candida. rugopelliculosa の１属１種の酵母が検出された。一方、農業用水を塩素殺菌した塩素水からは、細菌、糸状菌および酵母はいずれも未検出であった。また、塩素水を用いて溶解した農薬からも２属２種の糸状菌が検出されただけであった。栽培時の土壌、草および収穫用ネットから検出された細菌、糸状菌および酵母を表１-３に、収穫時の土壌、草および収穫用ネットから検出された細菌、糸状菌および酵 15.

(19) 母を表１-４に示した。栽培時の土壌および草の両サンプルについては、比較的高い微生物数を示したため、土壌および草から検出された微生物種数は多く、土壌からは３属 11 種～４属 12 種の細菌、９属 11 種～11 属 15 種の糸状菌および２属２種～４属４種の酵母、草からは６属 12 種～８属 16 種の細菌、５属７種～７属９種の糸状菌および１属１種～３属３種の酵母が検出された。微生物数において塩素殺菌の効果が見られなかったように、微生物種数においても処理区間に差はなかった。収穫用ネットにおいても、微生物数に差が見られなかったように、微生物種数においても対照区および塩素水区からはそれぞれ、細菌では１属３種および２属４種、糸状菌では１属２種および３属３種、酵母はいずれも未検出となり、処理区間に差は見られなかった。栽培時の土壌、草および収穫用ネットから検出された微生物種は、Bacillus 属、. Cellulomonas 属、Mucor 属、Cryptococcus 属などの土壌菌、Pantoea 属、Fusarium 属、Penicillium 属などの植物病原菌が主であった。また、対照区の土壌および収穫用ネットからは Bacillus cereus が検出された。しかし、嘔吐毒を産生する Bacillus. cereus 菌株は、一般に穀類と穀類栽培土壌に生存し 36）、青果物等の栽培土壌からはほどんど検出されないことが報告されている 37）。したがって、本研究の場合も食性病原菌としてよりも土壌からの汚染由来菌として捉え、果実への移行の指標菌と判断した。一方、収穫時の土壌および草から検出された細菌および糸状菌は、栽培時よりも微生物種数は増加し、細菌では５属 15 種～12 属 18 種、糸状菌では、９属 11 種～10 属 15 種が検出された。酵母は栽培時と同じで２属２種～３属３種であった。収穫時においても対照区と塩素水区との間に微生物種数に差はなかった。また、収穫用ネットは栽培時と同程度の微生物種数となり、細菌および糸状菌は２属２種～３属３種、酵母は未検出であった。土壌、草および収穫用ネットからは検出された微生物種は、栽培時と同様に、Bacillus 属、Paenibacillus 属、Zygorhynchus 属などの土壌菌、. Rhizobium 属、 Chaetomium 属などの植物病原菌が検出され、さらに乳酸菌の Lactococcus 属も検出された。土壌、草および収穫用ネットから検出された細菌、糸状菌および酵母は、Izumi ら. 28）29）の報告によるカキ果実圃場およびウンシュウミカ. ン果実圃場の土壌、草または落葉サンプル、Tuszyński ら 38）の報告によるプラム果樹園の土壌サンプルから検出された微生物種と類似し、土壌、水または植物などに多く存在する微生物種を示した。 16.

(20) ⅱ）果実果皮および果肉から検出された微生物（細菌、糸状菌および酵母）とそれらの推定される汚染源について、栽培時の結果を表１-５に、収穫時の結果を表１-６に示した。栽培時の対照区および塩素水区の果皮から検出された一般生菌数はいずれも検出限界値以下、真菌数は対数値で 3.3 および 3.5 を示し、処理区間に有意差は見られなかった。微生物種数は、微生物数の結果と類似して差は見られず、対照区の果皮からは３属４種の細菌、２属２種の糸状菌および２属２種の酵母、塩素水区の果皮からは３属６種の細菌、３属３種の糸状菌および１属１種の酵母が検出された。果肉においては、両処理区ともに微生物数は検出限界値以下と低く、検出された細菌、糸状菌および酵母も未検出～２属３種と少なかった。対照区の果皮から検出された Bacillus. megaterium、Cladosporium cladosporioides / herbarum または Mycosphaerella aronici は農業用水、Bacillus thuringiensis は農薬からも同一菌種が検出されており、農業用水および農薬から対照区の果皮への移行が推定された。また、対照区の果皮から検出された Bacillus megaterium、Cladosporium cladosporioides / herbarum または Mycosphaerella aronici 、 Bacillus thuringiensis 、 Zygorhynchus moelleri 、. Cryptococcus laurentii は土壌、Sporidiobolus johnsonii は土壌および草、塩素水区の果皮から検出された Bacillus megaterium 、 Acremonium stromaticum は草、. Bacillus pumilus、Bacillus thuringiensis、Sporidiobolus johnsonii は土壌および草と同一菌種が検出され、土壌および草から対照区または塩素水区の果皮への微生物の移行が推定された。栽培時と比較して、微生物数が増加した収穫時の両処理区の果皮は、検出された微生物種数も増加した。収穫時の果皮の一般生菌数は、対照区と塩素水区との間に差はなく、検出された細菌種数においても対照区、塩素水区ともに６属 10 種となり、処理区間に差は見られなかった。真菌数では塩素水区の方が対照区よりも対数値で 1.4 高い値を示したが、検出された糸状菌は対照区では 12 属 12 種、塩素水区では５属５種となり、真菌数の結果とは一致しなかった。これは、検出された真菌は酵母が大半で、検出された酵母が同一種のみであったためである。また、酵母においても対照区では２属２種、塩素水区では４属４種で、処理区間に差はなかった。果肉については、各処理区の微生物種数は微生物数の結果と一致し、微生物数が検出限界値以下の対照 17.

(21) 区では腐敗原因菌の Aspergillus aculeatus / japonicus の１属１種のみが検出されたのに対して、一般生菌数および真菌数がそれぞれ対数値で 2.6 および 3.4 を示した塩素水区では、３属３種の細菌、１属１種の糸状菌および３属３種の酵母が検出された。両区の果皮および塩素水区の果肉からは、産膜酵母である Candida 属や Pichia 属が検出されており、これらが付着した状態で塩蔵を行うと、正常の製品では帯褐紅色を示す梅干の外観が灰褐色に変化すること 39）、梅酢液の色調が紅色から茶褐色に変化すること 16）が報告されているため、これらの酵母は塩蔵前に除去しなければならない。対照区または塩素水区の果実から検出された細菌および真菌は、栽培時と同様に土壌および草からも同一菌種が検出されており、さらに対照区では Bacillus thuringiensis、塩素水区では Bacillus thuringiensis、Cladosporium cladosporioides / herbarum または Mycosphaerella aronici が収穫用ネットからも同一菌種が検出されており、収穫時には土壌および草に加えて収穫用ネットも微生物汚染源となることが推定された。 ⅳ）食性病原菌カキ果実 28）圃場およびウンシュウミカン果実 29）圃場からは、食性病原菌であるサルモネラまたは腸管出血性大腸菌が環境接触物から検出されたが、本研究では、 LAMP 法の結果、栽培時および収穫時におけるすべてのサンプル（農業用水、塩素水、農薬、土壌、草、果皮および果肉）でサルモネラ、腸管出血性大腸菌および L.. monocytogenes は陰性を示し、検出されなかった（データ省略）。本研究で調査したウメ果実圃場、Izumi らが調査したカキ果実圃場およびウンシュウミカン果実圃場とは圃場位置が異なり、さらに異なる水源を使用したために本研究では食性病原菌は陰性を示したと考えられる。以上から、ウメ果実の微生物的安全性は高いと考えられるが、収穫時の果実からは、ポストハーベストを引き起こす植物病原菌および腐敗原因菌が検出され、さらにウメ果実の一次加工から二次加工にかけて品質劣化の原因として報告されている産膜酵母が検出されているので、塩蔵前の洗浄および選果工程、塩蔵中において果実の微生物制御を行う必要がある。. 18.

(22) 表1-1．ウメ果実栽培時および収穫時における環境接触物（農業用水、塩素水、農薬、土壌、草、収穫用ネット）および果実の細菌数、真菌数、pHおよび水分活性 Log CFU/ml（農業用水、塩素水、農薬）、Log CFU/g（土壌、草、果実）、 Log CFU/100ｃｍ２（収穫用ネット）. 工程（分析日）栽培時（６月５日）. 収穫時（６月24日）. サンプル農業用水/塩素水a 農薬土壌草収穫用ネット果皮果肉土壌草収穫用ネット果皮果肉. ｐH. 水分活性. 一般生菌数対照区塩素水区 3.1±0.1 ND 2.9±0.1 ND 5.9±0.1 6.2±0.1 * 7.0±0.2 7.2±0.0 2.9±0.1 2.9±0.1 ＜2.4 ＜2.4 ＜2.4 ND. 大腸菌群数対照区塩素水区 1.7±0.0 ND 2.1±0.1 ND 5.4±0.3 5.4±0.2 6.2±0.0 5.0±0.2 * 3.0±0.4 3.4±0.2 ＜2.4 ＜2.4 ND ND. 真菌数対照区塩素水区 3.1±0.0 ND 3.2±0.2 ＜2.0 5.5±0.2 6.0±0.1 * 6.9±0.2 6.8±0.1 2.7±0.2 2.6±0.2 3.3±0.3 3.5±0.0 ＜3.0 ＜3.0. 対照区 7.2±0.1 7.3±0.1 5.6±1.2 5.4±1.4 － 4.3±0.5 3.0±0.3. 塩素水区 8.1±0.1 * 7.9±0.3 * 5.8±0.3 6.0±0.9 － 5.5±1.0 3.0±0.1. 対照区－－ 0.962±0.002 0.970±0.005 － 0.950±0.008 0.958±0.001. 塩素水区－－ 0.965±0.001 0.967±0.007 － 0.953±0.004 0.960±0.007. 6.0±0.4 7.0±0.3 2.9±0.2 3.1±0.5 ND. 4.9±0.4 5.9±0.5 2.8±0.1 ＜2.4 ＜2.4. 5.2±0.3 6.8±0.2 2.7±0.1 4.5±0.3 ＜3.0. 4.5±1.5 6.2±0.2 － 5.1±1.6 2.7±0.1. 6.1±0.5 6.5±0.7 － 4.7±0.6 2.8±0.1. 0.970±0.001 0.971±0.002 － 0.955±0.008 0.952±0.009. 0.9690±0.001 0.972±0.002 － 0971±0.004 * 0.968±0003 *. 6.4±0.1 6.8±0.3 2.7±0.2 3.8±0.6 2.6±0.1. 5.3±0.0 5.9±0.0 3.2±0.0 * ＜2.4 ND. 5.6±0.3 6.0±0.3 * 2.8±0.1 5.9±0.4 * 3.4±0.0. －：未測定 ND：未検出対照区では農業用水をサンプルとし、塩素水区では塩素水をサンプルとした。＊：対照区と塩素水区との間で有意差（５％レベル）を示す a. 表1 - 2 ．ウメ果実栽培時における環境接触物(農業用水、塩素水および農薬）から検出された細菌、糸状菌および酵母細菌サンプル農業用水 /塩素水. 処理区グラム型属陽性 Bacillus 対照区（農業用水）陰性 Aeromonas. Enterobacter Flavobacterium Herbaspirillum Massilia Neisseria Novosphingobium Obesumbacterium Pantoea Pelomonas Pseudomonas Sphaerotilus Sphingobacterium Stenotrophomonas Thiobacillus Vogesella. 種. 属. 糸状菌種. megaterium veronii aerogenes cloacae cloacae pyrinus johnsoniae autotrophicum huttiense timonae canis capsulatum proteus agglomerans ananatis saccharophila fulva natans thalpophilum maltophilia aquaesulis indigofera. Cladosporium / Mycosphaerella Ganoderma Phoma Septoria. cladosporioides / herbarum aronici resinaceum macrostoma pistaciae. 属未検出. 酵母種. （4属4種）. （17属21種）塩素水区（塩素水）農薬. 対照区. 未検出. 陽性陰性. Bacillus Acidovorax Enterobacter Herbaspirillum Pelomonas Pseudomonas Serratia Stenotrophomonas. 未検出. thuringiensis delafieldii cloacae cloacae kobei / cloacae cloacae rubrisubalbicans saccharophila aeruginosa monteilii fonticola maltophilia. Botryotinia Mucor Phoma Pythium. 未検出. narcissicola / porri / hyacinthi / tulipae hiemalis macrostoma pyrilobum. Candida. （1属1種）. （4属4種）. （7属9種）塩素水区. 未検出. Acremonium Leptosphaerulina. stromaticum chartarum （2属2種）. 19. rugopelliculosa. 未検出.

(23) 表1 - 3 ．ウメ果実栽培時における環境接触物(土壌、草および収穫用ネット）から検出された細菌、糸状菌および酵母細菌サンプル土壌. 処理区対照区. グラム型属陽性 Bacillus. 陰性. Cellulomonas Raoultella. 種. 属. cereus fusiformis licheniformis megaterium pumilus silvestris simplex subtilis spizizenii thuringiensis uda ornithinolytica. Acremonium Aspergillus Cladosporium / Mycosphaerella Clonostachys Fusarium. Mortierella Mucor. （3属11種）. Myrothecium Penicillium Trichoderma Zygorhynchus. 糸状菌種. 属. stromaticum aculeatus / japonicus cladosporioides / herbarum aronici compactiuscula anthophilum / napiforme / nygamai / proliferatum oxysporum tricinctum polycephala hiemalis racemosus f. racemosus gramineum oxalicum solitum fertile / harzianum moelleri. 酵母種. Cryptococcus Hanseniaspora Malassezia Sporidiobolus. laurentii occidentalis restricta johnsonii （4属4種）. （11属15種）塩素水区陽性. 陰性. Bacillus. Cellulomonas Paenibacillus Pseudomonas. fusiformis megaterium niacini oleronius pseudomycoides pumilus simplex sphaericus thuringiensis gelida amylolyticus resinovorans. Aspergillus Chaetomium Clonostachys Fusarium. Mortierella Mucor Penicillium Phoma Trichoderma. （4属12種）. aculeatus / japonicus brasiliense compactiuscula anthophilum / napiforme / nygamai / proliferatum chlamydosporum oxysporum polycephala hiemalis solitum exigua / foveata aureoviride / harzianum / inhamatum / virens. Candida Sporidiobolus. solani johnsonii （2属2種）. （9属11種）草. 対照区. 陽性陰性. Enterococcus Acinetobacter Enterobacter. Leclercia Pseudomonas Raoultella. casseliflavus genomospecies 16 aerogenes amnigenus asburiae cancerogenus pyrinus adecarboxylata fulva oryzihabitans straminea ornithinolytica. Acremonium Alternaria Cladosporium / Mycosphaerella Colletotrichum Fusarium Mucor Stilbella. stromaticum alternata cladosporioides / herbarum aronici dematium / truncatum anthophilum / napiforme / nygamai / proliferatum tricinctum hiemalis aciculosa albocitrina. Sporidiobolus. johnsonii （1属1種）. （7属9種）. （6属12種）塩素水区陽性. 陰性. Bacillus. Paenibacillus Enterobacter Escherichia Leclercia Pantoea Pseudomonas Raoultella. megaterium pumilus simplex sphaericus thuringiensis jamilae pyrinus asburiae nimipressuralis vulneris adecarboxylata ananatis aeruginosa oryzihabitans straminea ornithinolytica. Acremonium Alternaria / Cochliobolus / Stemphylium Fusarium. Phoma Zygorhynchus. stromaticum alternata carbonum vesicarium anthophilum / napiforme / nygamai / proliferatum chlamydosporum tricinctum macrostoma moelleri. Candida Cryptococcus Sporidiobolus. （3属3種）. （5属7種）. （8属16種）収穫用ネット. 対照区. 陽性. Bacillus. cereus subtilis thuringiensis. Mucor. circinelloides lusitanicus hiemalis. 未検出. （1属2種）. （1属3種）塩素水区陽性陰性. Bacillus Enterobacter. thuringiensis amnigenus asburiae kobei. Cladosporium / Mycosphaerella Phoma Volutella. （2属4種）. cladosporioides / herbarum aronici macrostoma ciliata （3属3種）. 20. railenensis laurentii johnsonii. 未検出.

(24) 表1-4．ウメ果実収穫時における環境接触物(土壌、草および収穫用ネット）から検出された細菌、糸状菌および酵母. サンプル土壌. 処理区対照区. グラム型属陽性 Bacillus. Brevibacillus. 陰性. Cellulosimicrobium Enterococcus Lactococcus Paenibacillus Streptomyces Cupriavidus Raoultella. 細菌種. 属. azotoformans fusiformis megaterium pumilus pycnus simplex thuringiensis borstelensis choshinensis cellulans casseliflavus lactis hordniae / lactis lactis agarexedens durhamensis necator ornithinolytica （9属16種）. Aphanocladium Aspergillus Chaetomium Clonostachys / Gliocladium Fusarium Mortierella Mucor Penicillium / Talaromyces Trichoderma Zygorhynchus. 糸状菌種. 酵母. album aculeatus aculeatus / japonicus brasiliense catenulatum / rosea roseum oxysporum polycephala circinelloides lusitanicus hiemalis citrinum oxalicum rubrum flavus rubrum fertile / harzianum moelleri. 属未検出. 種. Hanseniaspora Rhodotorula Sporidiobolus. occidentalis mucilaginosa johnsonii. （10属15種）塩素水区陽性. Bacillus. Paenibacillus 陰性. Streptomyces Chryseobacterium Enterobacter. azotoformans barbaricus circulans fusiformis megaterium niacini oleronius pumilus simplex thuringiensis alvei borealis mirabilis gleum aerogenes. Acremonium Ascochyta / Mycosphaerella / Phoma Aspergillus Clonostachys Fusarium Penicillium Phacidium Phoma Trichoderma. stromaticum fabae / pisi rabiei macrostoma / sorghina aculeatus / japonicus compactiuscula oxysporum solani oxalicum coniferarum exigua / foveata macrostoma minutisporum fertile. （3属3種）. （9属12種）. （5属15種）草. 対照区. 陽性. 陰性. Cellulosimicrobium Kurthia Lactococcus Acinetobacter Brevundimonas Chryseobacterium Citrobacter Enterobacter Herbaspirillum Pantoea Rhizobium Sphingomonas Stenotrophomonas. cellulans gibsonii lactis lactis genomospecies intermedia gleum scophthalmum murliniae aerogenes pyrinus huttiense ananatis radiobacter pituitosa trueperi maltophilia. Acremonium Alternaria / Cochliobolus / Stemphylium Ascochyta / Mycosphaerella / Phoma Clonostachys Fusarium Mucor Phoma Stilbella Volutella. （13属16種）塩素水区陽性. 陰性. Bacillus Exiguobacterium Lactococcus Microbacterium Paenibacillus Achromobacter Acinetobacter Chryseobacterium Enterobacter. Escherichia Pantoea Serratia. thuringiensis acetylicum lactis lactis flavescens illinoisensis pabuli insolitus calcoaceticus gleum scophthalmum amnigenus cancerogenus hormaechei kobei pyrinus hermannii agglomerans marcescens. 対照区. 陽性陰性. Bacillus Stenotrophomonas. thuringiensis maltophilia （2属2種）. Rhodotorula Sporidiobolus. Zygorhynchus. stromaticum alternata carbonum vesicarium aculeatus / japonicus cladosporioides / herbarum aronici catenulatum / rosea roseum compactiuscula ligulicola anthophilum / napiforme / nygamai / proliferatum chlamydosporum tremellosus exigua / foveata macrostoma moelleri. Fusarium Mucor Trichoderma. oxysporum circinelloides fertile / harzianum. Merulius Phoma. 未検出. （11属13種）未検出. （3属3種）塩素水区陽性陰性. Bacillus Microbacterium Sphingobacterium. thuringiensis flavescens multivorum （3属3種）. Alternaria / Cochliobolus / Stemphylium Pestalotia. alternata carbonum vesicarium rhododendri （2属2種）. 21. graminis johnsonii （2属2種）. （9属11種）. Acremonium Alternaria / Cochliobolus / Stemphylium Aspergillus Cladosporium / Mycosphaerella Clonostachys / Gliocladium Clonostachys Didymella Fusarium. （12属18種）収穫用ネット. stromaticum alternata carbonum vesicarium fabae / pisi rabiei macrostoma / sorghina compactiuscula anthophilum / napiforme / nygamai/ proliferatum oxysporum circinelloides lusitanicus andina macrostoma aciculosa ciliata. 未検出.

(25) 表1 - 5 ．ウメ果実の栽培時における果皮および果肉から検出された細菌、糸状菌および酵母と推定される汚染源サンプル. 処理区. 果皮. 対照区. 細菌種. グラム型属 Bacillus 陽性. megaterium thuringiensis agarexedens epidermidis. Paenibacillus Staphylococcus. 同一菌株が検出された環境接触物農業用水、土壌農薬、土壌. 属. 糸状菌種. Cladosporium / Mycosphaerella Zygorhynchus. cladosporioides / herbarum aronici moelleri. 同一菌株が検出された環境接触物農業用水、土壌、草. 酵母種. 属. Cryptococcus Sporidiobolus. laurentii johnsonii. 土壌. 同一菌株が検出された環境接触物土壌土壌、草. （2属2種）. （2属2種）. （3属4種）塩素水区陽性. Bacillus. cereus megaterium pumilus thuringiensis parabrevis equi. Brevibacillus Rhodococcus. Acremonium Aureobasidium Cladosporium / Mycosphaerella. 草土壌、草土壌、草. stromaticum pullulans cladosporioides/herbarum aronici. 草. johnsonii. Sporidiobolus. 土壌、草. （1属1種）. （3属3種）. （3属6種）果肉. 対照区. 陽性. daejeonensis jamilae epidermidis. Paenibacillus Staphylococcus. Cryptococcus. 未検出. laurentii. 土壌. （1属1種）. （2属3種）塩素水区陽性. Bipolaris. 未検出. micropus. 未検出（1属1種）. 表1 - 6 ．ウメ果実の収穫時における果皮および果肉から検出された細菌、糸状菌および酵母と推定される汚染源サンプル. 処理区. 果皮. 対照区. グラム型属 Bacillus 陽性. Cellulosimicrobium Micrococcus Paenibacillus Sporosarcina Streptomyces. 細菌種. 同一菌株が検出された環境接触物. oleronius pumilus thuringiensis cellulans luteus agaridevorans amylolyticus globispora filamentosus griseinus （6属10種）. 糸状菌種. 属. Acremonium 土壌 Alternaria 農薬、土壌、収穫用ネット /Cochliobolus 土壌、草 /Stemphylium Ascochyta /Mycosphaerella /Phoma Cladosporium / Mycosphaerella Clonostachys Coniothyrium Diaporthe Phacidium Phaeosphaeria Phoma Stilbella Volutella. 同一菌株が検出された環境接触物. stromaticum alternata carbonum vesicarium fabae / pisi rabiei sorghina cladosporioides / herbarum aronici compactiuscula fuckelii phaseolorum coniferarum avenaria f. sp. avenaria /avenaria f. sp. triticea macrostoma aciculosa ciliata. 草草. 属. Candida Sporidiobolus. 酵母種. 同一菌株が検出された環境接触物. pignaliae johnsonii. 土壌、草. （2属2種）. 草. 農業用水、草草草. （12属12種）塩素水区陽性. Bacillus Curtobacterium Lactobacillus Microbacterium Paenibacillus Streptomyces. megaterium pumilus thuringiensis albidum / citreum pusillum plantarum liquefaciens / maritypicum / oxydans illinoisensis corchorusii / sp polychromogenes. 土壌、草土壌、草土壌、草、収穫用ネット. Ascochyta / Mycosphaerella / Phoma Cladosporium / Mycosphaerella Leptosphaerulina Phacidium Phomopsis. pisi rabiei sorghina cladosporioides / herbarum aronici chartarum coniferarum sclerotioides. 草. 草、収穫用ネット. Candida Hanseniaspora Pichia Sporidiobolus. quercitrusa occidentalis membranifaciens johnsonii. 土壌土壌、草. （4属4種）土壌. （5属5種）. （6属10種）果肉. 対照区. 未検出. Aspergillus. aculeatus / japonicus. Aureobasidium. pullulans. 土壌. 未検出. （1属1種）塩素水区陽性. Bacillus Lactobacillus Paenibacillus. thuringiensis plantarum polymyxa. 土壌、草、収穫用ネット. （1属1種）. （3属3種）. Candida Pichia Sporidiobolus. fructus / musae membranifaciens johnsonii （3属3種）. 22. 土壌、草.

(26) 第２節. ウメ果実の収穫後から一次加工における微生物制御. １．材料および方法. １）分析用サンプルウメ圃場（和歌山県田辺市）において、平成 22 年６月から９月にかけて、収穫、一次洗浄、選果、塩蔵８週間、二次洗浄、天日干し５日間および出荷工程を行い、その後、和歌山県田辺市のウメ果実加工会社（中田食品株式会社）で出荷後の実験サンプルの二次加工（調味漬け 21 日間）を実施した（図１-１）。本研究では、一次加工工程中の環境接触物の一次洗浄水、選果機洗浄水、選果後浸漬水および二次洗浄水に貯水あるいは井戸水を使用する対照区と塩素水あるいは弱酸性次亜水を使用する塩素水区を設けた。最初の収穫工程では、収穫後のウメ果実を分析サンプルとし、収穫果実 160kg を 80kg ずつ対照区および塩素水区に分けた。対照区では、慣行的に一次洗浄、選果、塩蔵、二次洗浄、天日干し、出荷の順で一次加工を行った。一次洗浄工程では、洗浄用タンク（容量３ｔ）に入った貯水を一次洗浄水とし、一次洗浄水に果実を 30 分間浸漬し、一次洗浄後果実、一次洗浄水および洗浄用タンクを分析サンプルとした。選果工程では、選果機を用いて果実 80kg を選果し、L サイズの果実約 20kg をその後の実験用サンプルとした。選果機では、果実を選果する回転ドラム部の前にシャワー部が付いており、この水を選果機洗浄水（井戸水）として分析した。続く塩蔵では、果実 20kg に対して食塩４kg をビニールの入ったタル（80L 容）の中に入れ、６月 29 日に塩蔵を開始した。その後、８月 23 日までの約２か月間塩蔵を行い、塩蔵中も果実および塩水を約２週間ごとに４回サンプリングした。塩蔵終了後、天日干し前の果実の洗浄である二次洗浄を行い、洗浄後の果実、二次洗浄水として使用した井戸水を対象サンプルとした。二次洗浄後、５日間天日干しを行い、天日干し３日目の果実をサンプリングした。８月 30 日に、天日干しのウメ果実２kg を出荷用容器（11Ｌ容）に詰め、二次加工工程のために、ウメ果実加工会社に出荷した。これに対して塩素水区では、一次洗浄工程において、貯水にケミクロン G を添加して作製した有効塩素 10ppm の塩素水を一次洗浄水とした。一次洗浄水（塩素水）、洗 23.

(27) 浄後の果実および洗浄用タンクをサンプルとした。選果工程では、選果を行う前に選果機を有効塩素 50ppm の弱酸性次亜水（：次亜水）（株式会社タクミナ製：弱酸性次亜水生成装置サラファイン S タイプ）を用いて洗浄し、さらに選果機洗浄水にも次亜水を用いた。対照区と同様に、洗浄後の選果機で果実 80kg を選果し、L サイズの果実約 20kg をサンプリングした。洗浄後選果機および選果機洗浄水（次亜水）についても分析サンプルとした。選果後、塩蔵を行う前にウメ果実 20kg をタル（80Ｌ容）に入れ、ウメ果実が浸るまで次亜水を入れ、５分間浸漬した。この際、選果後浸漬した果実についても分析を行った。対照区と同様に、塩分濃度 20％で塩蔵を２か月間行い、塩蔵中の果実および塩水について約２週間ごとに４回サンプリングした。塩蔵終了後、二次洗浄水（次亜水）で果実を洗浄し、二次洗浄水および洗浄後果実を分析した。その後の天日干しおよび出荷は対照区と同様に行った。一次洗浄水、選果機洗浄水、塩水および二次洗浄水は、それぞれ 100ml 容の滅菌済みネジ口瓶にヘッドスペースがない程度まで採取し、滅菌済みのサンプリングバッグに入れた。果実サンプルについては、以下のように採取した。収穫時の果実は、コンテナ内から 10 個採取した。一次洗浄工程では洗浄後の果実、選果工程では選果後の果実、塩素水区における選果後浸漬工程では、浸漬後の果実を１反復につき 10 個採取した。塩蔵中は、塩蔵用タルの表面の果実を１反復につき５個採取した。二次洗浄工程では洗浄後の果実、天日干し工程では天日干し用のネット上にある果実、出荷工程では出荷用容器から果実をそれぞれ５個採取した。果実は、収穫から塩蔵０日目までは果皮部および果肉部に分けて分析し、塩蔵２週目以降は種子を除いた果皮部および果肉部を分析した。洗浄用タンクおよび選果機は、表面の微生物サンプリングのため、それぞれのサンプリング箇所を特定した。サンプリング箇所は、洗浄用タンクは、果実と接触する内側の部分を分析対象とした。選果機は、果実を移動させるコンベア部、選果する回転ドラム部、果実の出口のスロープ部の微生物をサンプリングした。出荷後の対照区および塩素水区のウメ果実は、ウメ果実加工場内で慣行通りに二次加工を行った。ウメ果実は、洗浄後、調味液（原材料：食塩、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、酒精、グルタミン酸 Na、醸造酢、りんご酢、赤キャベツ色素およびビタミン B1）で 21 日間調味漬込みを行い、梅干し（対照区：塩度 9.82g/100g、酸度（クエン酸換算）3.16g/100g、pH 2.57 および Brix 27.0％、塩素水区：塩度 9.78g/100g、酸度（ク 24.

(28) エン酸換算）3.16g/100g、pH 2.59 および Brix 27.2%）に加工した。２）測定項目および方法（１）pH 一次洗浄水、選果機洗浄水、塩水および二次洗浄水は、カスタニーLAB pH メーターを用い、果実は Twin pH メーターを用いて測定した。（２）水分活性果実の水分活性の測定にはロトロニック水分活性システム Aw-パームを使用し、各サンプル中の自由水の純水に対する比（Aw）で表した。（３）微生物 ⅰ）細菌数および真菌数の測定一次洗浄水、選果機洗浄水、塩水および二次洗浄水の微生物数の測定は、第１節と同様に寒天平板法で行い、一般生菌数の測定には標準寒天培地、大腸菌群数の測定にはデゾキシコレート培地、真菌数の測定には、一次洗浄水、選果機洗浄水および二次洗浄水では 100mg/l クロラムフェニコールを加えたポテトデキストロース寒天培地を用い、塩水ではポテトデキストロース寒天培地に塩化ナトリウム（ナカライテスク株式会社製）濃度が５％となるように添加した培地を用いた。標準寒天培地は 37℃で 48±３時間、デゾキシコレート培地は 37℃で 20±２時間、ポテトデキストロース寒天培地は 26℃で 72±３時間インキュベーター内で培養した。培養後に出現したそれぞれのコロニーをコロニーカウンターでカウントし、一次洗浄水、選果機洗浄水、塩水および二次洗浄水１ml 当たりのコロニー数を対数値で表した。果実については、クリーンベンチ内でメスを使用して収穫期から塩蔵０日目までは果皮部と果肉部に分け、それぞれ果皮サンプルおよび果肉サンプルとし、塩蔵２週目以降は種子を除く果皮部および果肉部を果実サンプルとした。果皮および果肉は、それぞれ 10g ずつ秤量し、滅菌生理食塩水 90ml と共にストマフィルターに入れて磨砕し、磨砕後、適宜希釈した。上記のように、一般生菌数、大腸菌群数、真菌数の測定にはそれぞれ標準寒天培地、デゾキシコレート培地、クロラムフェニコール加ポテトデキストロース寒天培地（収穫～選果工程）、５％塩化ナトリウム加ポテトデキストロース寒天培地（塩蔵０日目以降）を使用した。洗浄用タンクおよび選果機の果実との接触面の付着菌数は、フードスタンプを用いて測定した。選果機については、コンベ 25.

(29) ア部、回転ドラム部およびスロープ部をそれぞれ１反復ずつ測定したので、３箇所の平均値を選果機の菌数とした。 ⅱ）細菌の同定第１節と同様の MicroSeq 法で、（ⅰ）細菌の培養（ⅱ）細菌の分離（合計 176 菌株）（ⅲ）ゲノム DNA の抽出（ⅳ）16S rDNA 領域の PCR 増幅（ⅴ）塩基配列の決定（ⅵ）ホモロジー検索による同定を行なった。 ⅲ）真菌の同定第１節と同様の MicroSeq 法で、（ⅰ）糸状菌および酵母の分離（それぞれ合計 82 菌株および 90 菌株）（ⅱ）ゲノム DNA の抽出（ⅲ）D2 LSU rDNA 領域の PCR 増幅（ⅳ）塩基配列の決定（ⅴ）ホモロジー検索による同定を行なった。（４）食性病原菌の検出 ⅰ）サルモネラ果皮および果肉（収穫から塩蔵０日目）、果実（塩蔵 20 日目以降）、一次洗浄水、選果機洗浄水、塩水および二次洗浄水をサンプルとし、第１節と同様に、LoopampⓇ サルモネラ検出試薬キットを使用して LAMP 法により存在の確認を行った。 ⅱ）腸管出血性大腸菌上記のサルモネラの有無の検査の場合と同様に、LAMP 法により LoopampⓇ腸管出血性大腸菌検出試薬キットを用いて存在の確認を行なった。 ⅲ）L. monocytogenes 上記のサルモネラおよび腸管出血性大腸菌の有無の検査の場合と同様に、Loopamp. L. monocytogenes 検出試薬キットを用いて LAMP 法により存在の確認を行なった。. Ⓡ. 26.

(30) 対照区. ウメ果実. 塩素水区一次洗浄（塩素水）. 一次洗浄. 選果（塩素水）. 選果（塩蔵０日目）. 選果後浸漬（塩素水）（塩蔵０日目）塩蔵約２ヶ月の間に４回サンプリング. 塩蔵約２ヶ月の間に４回サンプリング. 二次洗浄. 二次洗浄（塩素水）. 天日干し. 天日干し. 出荷. 出荷. 二次加工. 二次加工. 図１-１．ウメ果実の収穫から二次加工までの工程. 27.

(31) ２．結果および考察. １）微生物数（１）環境接触物一次洗浄、選果、選果後浸漬（塩蔵０日目）、塩蔵２、４、６、８週目および二次洗浄工程において、各工程の環境接触物の細菌数、真菌数および pH を表１-７に示した。一次洗浄工程では、対照区の洗浄水（貯水）の微生物数は、一般生菌数が１ml 当たりの対数値で 4.1、大腸菌群数が対数値で 2.6、真菌数が対数値で 3.0 を示したのに対して、塩素水区の洗浄水（塩素水）の微生物数は、いずれも検出限界値以下または未検出となり、第１節の農業用水と同様に、塩素殺菌の効果が確認された。貯水および塩素水の pH も農業用水と同様に、貯水の 7.2 よりも塩素水の 7.6 の方が高い値を示した。洗浄水を貯めた洗浄用タンク表面内側では、貯水の塩素殺菌による効果は影響せず、対照区および塩素水区の一般生菌数は 100cm2 当たりの対数値でそれぞれ 2.1 および 1.9、大腸菌群数は両区ともに未検出、真菌数は、それぞれ対数値で 2.5 および 2.3 であった。選果工程では、対照区では井戸水、塩素水区では次亜水を用いた選果機洗浄水、選果機を環境接触物とした。井戸水（pH7.2）の微生物数は、一般生菌数、大腸菌群数および真菌数は、１ml 当たりの対数値でそれぞれ 3.2、未検出および検出限界値以下を示した。次亜水（pH6.0）では、すべての微生物数が未検出であった。次亜水で洗浄前の選果機は、一般生菌数、大腸菌群数および真菌数は、100cm2 当たりの対数値でそれぞれ 2.6、0.5 および 2.7 を示した。洗浄後の選果機では、大腸菌群数が対照区よりも塩素水区の方が対数値で 1.3 高くなった以外は、一般生菌数および真菌数では処理区間に差は見られず、次亜水による洗浄効果は確認されなかった。次亜塩素酸ナトリウムの殺菌力は有機物に影響される。有機物汚れに対する洗浄力は OCl-の濃度に強く依存することが知られている. 40）。本研究で用いた次亜水は、弱酸性であるので. OCl-濃度は低く、選果機に対する金属腐食性の影響を考慮して洗浄時間を短くしたために、次亜水による殺菌効果が十分に得られなかったと考えられる。選果後浸漬工程の浸漬水として用いた次亜水（pH6.0）は、選果時と同様にいずれの微生物数も未検出であった。その後の塩蔵中は、塩水を２週間ごとに４回サンプリ 28.