Title
Identification of Minimal Promoter and Genetic Variants of
Kruppel-like Factor 11 Gene and Association Analysis with Type
2 Diabetes in Japanese( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
黒田, 英嗣
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第793号
Issue Date
2009-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/25303
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与要件 学位論文題目 審 査 委 員 黒 田 英 嗣 (愛知県) 博 士(医学) 甲第 793 号 平成 21年 3 月 25 日 学位規則第4条第1項該当
Identification of Minimal Promoter and Genetjc Variants of KruppeトIike FactorllGene and Association AnalysIS With Type2 DiabetesinJapanese. (主査)教授 石 塚 達 夫 (副査)教授 園 貞 隆 弘 教授 中 川 敏 幸 論文内容の要旨 【目的】 北ヨーロッパ人を用いた此〃ノの遺伝子解析により,ミスセンス変異(A347S,T220M)が若年糖尿 病(MODY)で報告されると共に,Q62Rと2型糖尿病との関連が報告された｡野生型KLFllはインス リン分泌細胞株(β-TC3)でインスリンプロモーターに結合し発現を増大させるが,上記変異は転 写活性を阻害すること,そして正常耐糖能のR62保因者はやせ型で,経口ブドウ糖負荷試験で60 分,120分においてインスリン低値を示すことも報告された｡肥満,インスリン抵抗性が密接に関 連する欧米人に対し,日本人2型糖尿病は膵β細胞のインスリン分泌不全が特徴的である｡従って 瓜〃ノは日本人2型糖尿病の感受性遺伝子の有力候補と考えられ,発現調節する最小プロモーター 領域と疾患の感受性に関連する変異の同定を試みた｡ 【対象と方法】 単一塩基多型(SNP)を網羅するため,健常者12人において此Fll全領域をPCRで増幅し,直接 シークエンス法で変異スクリーニングを行った｡次に全エクソン領域とプロモーター領域を若年糖 尿病182人(MODYを半数含む),2型糖尿病96人,正常96人において変異検索した｡ミスセンス変 異については2型糖尿病患者553人と対照563人を用いて追加解析を行った｡変異蛋白の機能解析 には,此〃ノcDNAを鋳型として発現ベクターを作成し,此〃ノの標的遺伝子であるインスリン, ゐねノ∂∫eノ,肋♂7プロモーター活性への影響をレポーターアッセイによりMIN6-m9細胞で解析した｡ 一方,此〃ノの5'側近接領域のプロモーター活性を検討するために,3種類の異なる長さの領域 (-1389-+162bp,-896-+162bp,一250-+162bp)をレポーターベクターに挿入し,5'側deletionstudy をMIN6-m9細胞,HepG2細胞で施行した｡2型糖尿病群と対照群のアリル頻度の統計学的差異はx2 検定あるいはロジスティック検定にて行った｡臨床データの差異はと一検定にて解析した｡ハプロタ イプ頻度の2型糖尿病群とコントロール群の比較には,permutation testを実施した｡ 【結果】 新規ミスセンス変異(R29Q,S124F)を含む6個の新規SNPを含む計19個の遺伝子多型をmFll領 域に同定した｡このうち頻度が10%以上である16個のSⅣPを用い,ハプロタイプを構築し連鎖不平 衡分布を評価したところ,本領域は1つの連鎖不平衡ブロックにあり,主たる4種類のハプロタイ プの組み合わせで約95%の遺伝子多型が説明できることが明らかとなった｡R29Q(2型糖尿病3人, 若年糖尿病2人,対照1人),S124F(若年糖尿病1人)と,プロモーター領域に4個の新規多型を 認めたが,全てのSNP,ハプロタイプともに2型糖尿病発症と有意な関連を示さなかった｡次に機 能解析を施行したところ,標的遺伝子であるインスリン,ぬねノ∂∫eノ,5加d7プロモーターに対し, 野生型KLFllは0.5倍の抑制効果を示した｡R29Q変異はCbtalaselプロモーターで,S124F変異は インスリン,砧と∂ノ∂∫eノプロモーターで,野生型と比較して転写活性抑制に有意差を示した｡5'側
-53-deletion studyにおいては-250-+162bpの領域でプロモーター活性を示すことがMIN6-m9細胞, HepG2細胞において認められた｡-896bpまでと-1389bpまでの領域を含むプロモーター領域はHepG2 細胞においてより強い活性を示し,-896bp--250bpの間に組織特異的エンハンサーの存在が示唆さ れた｡また同領域はSpl配列が主体であり,転写開始点から上流6番目に位置するSpl結合配列は 遺伝子多型により欠失することが判明した｡しかし,プロモーター活性の比較解析や2型糖尿病群 と対照群との出現頻度の検討において,本ハプロタイプに起因する有意差は認められなかった｡ 【考察】 本研究では新規ミスセンス変異R29Q,S124Fを同定したが,北ヨーロッパ人で同定されたA347S, T220M,Q62R,プロモーター領域の-1659G〉C多型は認められず,人種差が存在した｡また此Fll領 域の連鎖不平衡ブロックに含まれない21Kb上流にあるrs4073397多型は日本人2型糖尿病と弱い関 連が報告されていたが,本研究では有意の関連は認められなかった｡ 本研究は-250-十162bpの領域にSpl結合配列を主体とした最小プロモーター領域を同定した｡ KLFllは,インスリンプロモーター活性の克進と抑制の両報告がされているが,MIN6-m9細胞を用 いた本研究では,転写活性の抑制作用を示した｡多様な成績は異なる細胞条件に起因する可能性が 示唆される｡一方,酸化ストレスが膵β細胞機能低下を惹起する可能性が考えられている｡抗酸化 作用を有する砧ねノ∂∫eノがKLFllの標的遺伝子であることから,同発現レベルの低下が糖尿病発症 に関わる可能性が考えられる｡そこで,変異蛋白による転写制御を解析した結果,R29QとS124Fの 両変異共に砧f∂ノ∂∫eノ発現において野生型と有意差を認めるも,ほぼ同程度の転写活性を示した｡ 以上から,関連解析の成績と総合して,日本人ではこれらの変異が糖尿病発症の主たる因子である 可能性は低いと結論される｡ 今後,R29Q,S124Fの2型糖尿病発症あるいは病態における意義を明らかにするには,詳細な臨 床所見を有した大規模解析が必要である｡本研究ではELFllのβ細胞機能に焦点を当てたが,脂肪 組織に発現するCaveolin-1はコレステロール存在下でKLFllにその発現を抑制されている｡ Cave｡1in-1がインスリンシグナル伝達に重要であることから,KLFllのインスリン作用への重要な 関与も示唆されるので今後の解析が待たれる｡ 【結論】 此Fll領域に2個のミスセンス変異(R29Q,S124F)を含む6個の新規SNPを含む19個の遺伝子多 型と最小プロモーター領域を同定した｡日本人では多型と糖尿病発症との有意な関連は認められず, 疾患発症の遺伝素因に民族差が存在することが示唆された｡本研究での且Z〃ノの最小プロモーター 領域の同定とSNPの網羅は,KLFllの転写制御メカニズムの膵β細胞機能における役割解明や2型 糖尿病のサブ表現型の遺伝学的解析に有用と考えられた｡ 論文審査の結果の要旨
申請者
黒田英嗣は,KLFllのコード遺伝子の全域スクリーニングを行い,多くの多型を同定す
ると共にハプロタイプを構築した｡これらの多型は日本人の2型糖尿病発症と有意の関連は示さな かったが,多型情報の集積は病態に関する種々の表現型との関連解析に有用である｡また申請者は, 同遺伝子の最小プロモーター領域を同定し,配列の多様性が転写効率に関連することを明らかにし た｡以上の知見は,糖尿病発症機構の解明のみならず,疾患感受性の人種差を理解する上で重要で あり,糖尿病学の進歩に対して少なからず寄与するものと認める｡ [主論文公表誌]Kuroda E,HorikawaY,Enya M,OdaN,SuzukiE,IizukaK,and TakedaJ
Identification ofminimalpromoter and genetic variants of Kruppel-1ike factorllgene and association analysis with type2 diabetesinJapanese.
EndocrineJourna156,275-286(2009).
