Bacillus subtilis IK-1080 によるイネいもち病の生物防除

Title

Bacillus subtilis IK-1080 によるイネいもち病の生物防除( 本

_{文(Fulltext) )}

Author(s)

田口, 義弘; 百町, 満朗; 堀之内, 勇人; 川根, 太

Citation

[日本植物病理學會報] vol.[69] no.[2] p.[85]-[93]

Issue Date

2003-05-25

Rights

The Phytopathological Society of Japan (日本植物病理学会)

Version

出版社版(publisher version)postprint

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/29660

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

日植 病 報69: 85-93 (2003)

Jpn. J. Phytopathol. 69: 85-93 (2003)

Bacillus subtilis IK-1080に

よ る イ ネ い も ち 病 の 生 物 防 除

田 口 義 広1＊ ・百 町 満 朗2・ 堀 之 内 勇 人1・ 川 根 太3

ABSTRACT

TAGUCHI, Y.1*, HYAKUMACHI, M.2, HORINOUCHI, H.1 and KAWANE, F.3 (2003). Biological control of rice blast dis-ease by Bacillus subtilis IK-1080. Jpn. J. Phytopathol. 69: 85-93.

Bacillus subtilis strain IK-1080 was tested for practical use as a biological control agent against rice blast disease. When the anatagonist B. subtilis IK-1080 was cultured with the rice blast fungus on potato sucrose agar plates, hyphal growth was greatly suppressed. Blast fungal spores (103 spores/ml) were added to suspension solutions of B. subtilis IK-1080 at 1.0•~106, 5.0•~ 107, 1.0•~108 and 5.0•~108 cfu/ml and left to germinate on cellophane on a water agar plate. The rate of both germination and appressorial formation began to be suppressed at 1.0•~108 and 5.0•~107 cfu/ml of B. subtilis, respectively. At 5.0•~108 cfu/ml

of B. subtilis, germination and appressorial formation (62.3% and 11.2%, respectively) were much lower than those of the controls (96.3% and 56.4%, respectively). When 5-ml suspensions of B. subtilis IK-1080 at the same concentrations as those stated earlier were sprayed on plants at the 4.5-leaf stage of rice cultivar Koshihikari followed by spray inoculation with a sus-pension of blast spores (1.0•~104 spores/ml), leaf blast was significantly suppressed by the antagonist at 5.0•~107 cfu/ml or higher. The reduction in disease severity was strongly correlated with the suppression of appressorial formation (r=0.9374, p <0.01). When a suspension of B. subtilis IK-1080 was applied to blast disease lesions that had formed on the leaves 14 days after the inoculation with fungal spores, the mean length of the lesions at 7 days after application of the bacteria (13mm) did not differ from that of lesions on control plants without bacteria. However, two applications of a suspension IK-1080 on leaves, before inoculation with fungal spores and 14 days later, greatly reducted mean lesion length (6mm). In a paddy field experi-ment with yearly outbreaks of blast disease in 2000, a suspension 1.0•~108 cfu/ml of IK-1080 was sprayed on leaves of rice plants just before heading and again 9 and 18 days after heading. Disease severity was suppressed by more than half. Good results were also obtained (in 2001) in the same paddy field with a suspension of 1.0•~108 and 5.0•~108 cfu/ml of B. subtilis IK-1080 sprayed on leaves of plants just before heading and at 13 days and 23 days after heading. B. subtilis IK-1080 at 1.0•~108 and 5.0•~108 cfu/ml reduced disease seventies to 13.8 and 7.7, respectively, with high protective values of 52.5 and 73.5, respectively.

(Received June 18, 2002; Accepted October 16, 2002)

Key words: antagonistic microorganism, Bacillus subtilis IK-1080, biological control, rice blast disease.

緒 言 Pyricularia grisea22)に よ る イネ い もち病 は,稲 作 を 行 う 上 で 最 も被 害 の 大 きい 病 害 で あ る20).近 年,消 費 者 の 良 質 米 志 向 か ら,い もち病 に対 して 感 受 性 が 高 い コ シ ヒ カ リや あ き た こま ち 等 の 品種 の 栽 培 面 積 が 多 くな り,本 病 を 防 除 し な い で栽 培 す る こ とは 極 め て 難 し い状 況 に あ る.い もち 病 の 防 除 に は 様 々な 方 法 が 行 わ れ て い るが,中 で も化 学 農 薬 に 頼 る と こ ろ が 最 も大 きい3,7,18,29,30). しか し,一 方 で は 食 品 の 安 全 性,環 境 へ の 化 学 汚 染 等 の 懸 念 か ら化 学 農 薬 の 使 用 量 を減 ら した環 境 保 全 型 の 防 除 技 術 が 求 め られ て い る.こ の た め 本 病 害 に対 し て も多 系 品 種 利 用11)や 施 肥 方 法 の 改 善26,28)な ど,様 々 な 技 術 が 開 発 さ れ て い る.

1岐 阜 県 農 業 技 術 研 究 所(〒501-1152岐 阜 市 又 丸729)Gifu Research Institute for Agricultural Sciences

, 729 Matamaru, Gifu 501-1152, Japan.

2岐 阜 大 学(〒501-1193岐 阜 市 柳 戸1-1) Faculty of Agriculture

, Gifu University, 1-1 Yanagido, Gifu 501-1193, Japan.

3出 光 興 産(株)(〒107-0064東 京 都 港 区 北 青 山1-3-6) Idemitsu Kousan Co _{. L, T, D 1-3-6 Kita-aoyama, Minatoku, Tokyo,} 107-0064, Japan.

*Corresponding author _{(E -mail: yos_taguchi@ybb}

86 日本植物 病理 学会 報 第69巻 第2号 平成15年5月 化 学 農 薬 を 使 用 し な い 防 除 法 の 一 つ と し て,稲 作 に お い て も 拮 抗 微 生 物 を 用 い た 生 物 防 除 の 研 究 が 行 わ れ て き た13-16,21).例 え ば,Pseudomonas plantariiに よ る イ ネ 苗 立 枯 細 菌 病 に 対 し てBurkuholderia gladioliを 用 い た 防 除 の 研 究 が 行 わ れ,実 際 に 種 子 消 毒 に 用 い ら れ て い る19).ま た,い もち 病 に 対 す る 拮 抗 微 生 物 と してTrichoderma roseum,

T. harzianum, Chaetomium globosum, Micromonospora sp.

等8種 類 の 糸 状 菌27)やPseudomonas fluorescens, Bacillus

spP.等 の 細 菌 が 知 ら れ て い る12-17,24,27).さ ら に,P. fluorescensを 種 子 に 処 理 し て 播 種 す る と,い も ち 病 や 紋 枯 病 の 発 病 が 抑 制 さ れ る 例 や2,21,32),葉 へ の 処 理 に よ っ て い も ち 病 に 対 し 抵 抗 性 が 誘 導 さ れ る と の 報 告 も あ る25).し か し,こ れ ら の 報 告 の 多 く は,実 験 室 レ ベ ル で の い も ち 病 菌 に 対 す る 拮 抗 作 用,胞 子 の 発 芽 阻 害 あ る い は 幼 苗 や 施 設 内 で の 発 病 抑 制 効 果 に つ い て 述 べ た も の で,一 般 圃 場 を 用 い て の 葉 い も ち お よ び 穂 い も ち の 発 病 抑 制 に 関 し た も の で は な い. そ こ で,筆 者 ら はB. subtilisが い も ち 病 菌 に 対 し て 高 い 抗 菌 活 性 を 有 す る23)こ と に 着 目 し,ト マ ト,イ チ ゴ お よ び ナ ス の 灰 色 か び 病 や う ど ん こ病 に 対 し て 農 薬 登 録 さ れ て い るB. subtilis IK-1080株8)の い も ち 病 に 対 す る 発 病 抑 制 効 果 を 調 べ た.本 研 究 で は い も ち 病 菌 の 感 染 や 増 殖 を 抑 制 す る 重 要 な 要 因 で あ る 胞 子 の 発 芽,付 着 器 の 形 成 お よ び 菌 叢 の 生 育 に 対 す る 影 響,さ ら に は 葉 い も ち 病 斑 の 拡 大 と胞 子 形 成 に 与 え る 影 響 を 調 べ,B. subtilis IK-1080に よ る 圃 場 レ ベ ル で の 葉 い も ち お よ び 穂 い も ち の 生 物 防 除 エ ー ジ ェ ン ト と し て の 可 能 性 を 検 討 し た. 実 験 材 料 お よ び 方 法 供 試 微 生 物 お よ び イ ネ 品 種 本 試 験 で は,拮 抗 微 生 物 と し てB. subtilis IK-1080製 剤(ボ トキ ラ ー 水 和 剤(R),以 下

IK-1080と い う)を 供 試 し た.ま た,イ ネ(Oryza sativa

L.)品 種 は 実 験 室 レ ベ ル で は コ シ ヒ カ リ を,圃 場 試 験 で は

キ ヌ ヒ カ リ お よ び あ き た こ ま ち を 用 い た.

い も ち 病 菌 の 菌 叢 の 生 育 抑 制 供 試 い も ち 病 菌 を ジ ャ ガ

イ モ ・シ ュ ク ロ ー ス 寒 天(Potato sucrose agar: PSA)平

板 上 で8日 間 培 養 し 形 成 し た 菌 叢 を 直 径3mmの コ ル ク ボ ー ラ ー で 打 ち 抜 い て 菌 叢 片 と し,直 径9cmの ペ ト リ 皿 に 作 成 し たPSA平 板 の 中 央 に 置 床 し た.同 時 にIK-1080 を 滅 菌 水 に 懸 濁 し て 菌 濃 度1.0×108 cfu/mlと し た 懸 濁 液 を,白 金 耳 で 移 植 菌 叢 片 を は さ ん で2cm離 し た 位 置 に 平 行 に2本,長 さ4cmに 線 画 し た.こ れ を25℃ の 恒 温 室 で 培 養 し,2, 4, 6, 9お よ び11日 後 に 菌 叢 の 幅(半 径) を 測 定 し,IK-1080に よ る い も ち 病 菌 の 菌 叢 の 伸 長 抑 制 効 果 を調 べ た. い も ち病 菌 胞 子 の 発 芽 お よび 付 着 器 形 成 抑 制 い もち 病 菌 を9cmの ペ ト リ皿 に作 成 し た オ ー トミー ル 平 板 に 移 植 して25℃ で10日 間 培 養 し た.こ の培 地 の 表 面 に滅 菌 水 を 入 れ て 菌 叢 表 面 に形 成 さ れ た 菌 糸 を毛 筆 で 洗 い 落 と し,こ れ をBL-Bラ ン プ(National FL 15BL-B)照 射 下 に2日 間 置 い て胞 子 を 形 成 さ せ た.次 に,上 記 のIK-1080を 滅 菌 水 に懸 濁 して 菌 濃 度1.0×106 cfu/ml, 5.0×107 cfu/ml, 1.0

×108 cfu/ml, 5 .0×108 cfu/mlお よび1.0×109 cfu/mlに

調 整 し た懸 濁 液 を 作 成 し た.そ れ ぞ れ の濃 度 の 懸 濁 液 に, い もち 病 菌 の 胞 子 濃 度 を1.0×105個/mlと な る よ う に 混 濁 させ,2ml採 取 して 直 径9cmの 素 寒 天(WA)平 板 上 に 敷 い た セ ロ フ ァ ン 上 に 薄 く広 げ た.25℃ の恒 温 室 に8時 間静 置 した後,顕 微 鏡 下 で胞 子 の 発 芽 率 と付 着 器 の 形 成 率 を調 べ た. 次 に,上 記 と同様 に し てIK-1080の 菌 濃 度5.0×107 cfu/ mlお よび1.0×108 cfu/mlの 懸 濁 液 を作 成 直後 お よ び24時 間 後 に,い もち 病 菌 胞 子 を 混 濁 さ せ た.こ の 混 濁 液2ml を採 取 し上 記 と同 様 に セ ロ フ ァン 上 で発 芽 さ せ,8時 間 後 の胞 子 の 発 芽 率 と付 着 器 の 形 成 率 を調 べ た. 葉 い も ち の 発 病 抑 制 15cmの ポ ッ トで 育 苗 し4.5葉 期 とな っ た イネ 株 に,菌 濃 度1.0×108 cfu/mlのIK-1080の 懸 濁 液 を 株 当 た り5mlハ ン ドス プ レ ー を 用 い て 散 布 し た.処 理 区 は 以下 の4区 を設 定 し た.(1)散 布2時 間 後 に, 前 記 と同様 に濃 度1.0×104個/mlと な る よ うに 調 整 し た い もち 病 菌 胞 子 の 懸 濁 液 を 株 当 た り3mlハ ン ドス プ レ ー を 用 い て 噴 霧 接 種 した 区,(2)上 記 の い もち病 菌 胞 子 の 懸 濁 液 にIK-1080が1.0×108 cfu/mlと な る よ う調 整 した 液 を イ ネ 株 に噴 霧 接 種 し た 区(同 時 接 種 区),(3)蒸 留 水 の み を 株 当 た り5ml散 布 し て か らい もち 病 菌 胞 子 を 噴 霧 接 種 し た 区(無 処 理 区),お よび(4) IK-1080も い もち 病 菌 も接 種 し な い 区(無 接 種 区)を 設 置 した.こ れ らの イネ 株 は い も ち 病 菌 接 種 後,25℃ の 湿 室 に22時 間 静 置 し た 後 に 取 り 出 し,野 外 か らの飛 散 胞 子 に よ る感 染 を 防 止 す るた めハ ウ ス 内(温 度20-28℃)で 管 理 した.接 種8日 後 に 上 位 展 開 第 2, 3葉 の 進 展 型 病 斑 数 を調 べ,14日 後 に は葉 い も ち の 発 病 度 を 調 べ た.な お,発 病 度 はTable 1に 示 す 基 準 に よ っ て 階 級 値 化 し,平 均 値 を 求 め た.各 区 の供 試 株 数 は8株 と し,3反 復 で 試 験 を行 った. 次 に,菌 濃 度 が 葉 い もち の発 病 に及 ぼ す影 響 を調 べ た. 菌 濃 度 を1.0×106, 5.0×107, 1.0×108, 5.0×108お よ び 1.0×109 cfu/mlに 調 整 したIK-1080の 懸 濁 液 を200ml作 成 し,各 濃 度 の 懸 濁 液 を イ ネ1株 当 た り5mlハ ン ドス プ レ ー を用 い て 散 布 し た.こ れ ら の イネ 株 に,1.0×104個/

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Table 1. Criteria for index of disease severity of rice leaf blasta)

a) Disease severity index was calculated from the disease condition of the rice plants in hills and percent-age of area of the lesions.

mlの 濃 度 に調 整 し た い もち 病 菌 の胞 子 懸 濁 液 を株 当 た り 3ml噴 霧 接 種 し た.い も ち 病 菌 胞 子 の 接 種14日 後 に,葉 い もち の発 病 度 を 調 べ た.な お,対 照 と してIK-1080の 懸 濁 液 を散 布 しな い 無 処 理 区 を設 置 した.各 区 の 供 試 株 数 は 4株 で3反 復 行 った. 葉 い もち に 対 す る発 病 抑 制 効 果 の 持 続 日数 を 調 べ る た め,い もち 病 菌 胞 子 の 噴 霧 接 種 を 行 う1, 3, 5お よび7 日前 に1.0×108 cfu/mlに 調 整 し たIK-1080の 懸 濁 液 を株 当 た り5ml散 布 し た.ま た,無 処 理 区 は 蒸 留 水 の み を 株 当 た り5ml散 布 し た.こ れ らの イ ネ 株 に い もち 病 菌 胞 子 懸 濁 液 を 株 当 た り3ml噴 霧 接 種 し,14日 後 に 葉 い も ち の 発 病 度 を調 べ た.各 区 の 供 試 株 数 は4株 と し3反 復 行 っ た. 葉 身 上 の病 斑 の 拡 大 と 胞 子 形 成 に 及 ぼ す 影 響 4.5葉 期 の イネ 株 に,あ ら か じめ 菌 濃 度1.0×108 cfu/mlのIK-1080 の懸 濁 液 を 散 布 した 区 と無 散 布 区 を設 置 し,そ れ ぞ れ36株 を供 試 した.こ れ らの 株 に い もち 病 菌 胞 子 を1.0×104個/ mlに 調 整 した 懸 濁 液 を3ml噴 霧 接 種 し,葉 い もち の 病 斑 を形 成 させ た.葉 身 上 の 病 斑 が 明 瞭 とな っ た14日 後 に 同 じ 菌 濃 度 のIK-1080の 懸 濁 液 を,株 当 た り8mlハ ン ドス プ レー を 用 い て 散 布 し た 区 を設 置 した.ま た,対 照 と して 水 の み を 散 布 した 無 処 理 区 を設 置 し た.IK-1080の 散 布 後7 お よ び14日 目に病 斑 の長 さ を測 定 し,病 斑 の伸 長 に お よ ぼ す 影 響 を 調 べ た.供 試 葉 数 は10葉 とし3反 復 行 っ た. 次 に,6葉 期 の イ ネ の 葉 に形 成 され た 葉 い もち の病 斑 上 に,菌 濃 度 を1.0×108 cfu/mlに 調 整 し たIK-1080の 懸 濁 液 を株 当 た り8ml散 布 した.散 布3時 間後,25℃ の 湿 室 に20時 間静 置 し て 胞 子 を 形 成 さ せ た.対 照 と して 水 の み を 噴 霧 した 無 処 理 区 を 設 置 し た.胞 子 を 形 成 した 病 斑10片 を 切 り取 り4mlの 水 の 中 に 浸 漬 し,超 音 波 洗 浄 機 で15分 間 処 理 し,胞 子 を 病 斑 か ら 離 脱 さ せ た.こ の 胞 子 懸 濁 液 1.5mlを 採 取 し マ イ ク ロ ス ラ イ ドグ ラ ス を 用 い て胞 子 を 数 え,病 斑 面 積100mm2当 た りの 形 成 胞 子 数 に 換 算 し, 無 処 理 区 と比 較 した.試 験 は3反 復 行 い 平 均 値 を 求 め た. 本 田 に お け る 穂 い も ち の 発 病 抑 制 効 果 2000年 の5月 ∼ 9月 に 岐 阜 県 白川 町 の 山 間 地 域 の い もち 病 が 常 発 す る水 田 に お い て,穂 い もち に対 す るIK-1080の 発 病 抑 制 効 果 を 調 べ た.品 種 は キ ヌ ヒ カ リを 供 試 し,播 種 後45日 の 苗 を 用 い,栽 植 密 度 を30cm×18cmと して5月24日 に機 械 田植 え した.出 穂 日は8月9日,収 穫 日は9月11日 で あ った. 施 肥 量 は 窒 素,燐 酸 お よ び カ リ を 成 分 で10a当 た りそ れ ぞれ8, 8お よび10kgと した. IK-1080の 散 布 回数 と穂 い も ち の 発 病 抑 制 効 果 との 関 係 を 明 らか に す るた め,散 布 回数 を1回 の み の 区 と2お よび 3回 行 った 区 を設 け た.1回 散 布 区 は8,月16日 に,2回 散 布 区 は8月5日(出 穂 前4日)と16日 に,3回 散 布 区 は8 月5, 16お よび25日 に行 っ た.対 照 区 としてIK-1080を 散 布 しな い 無 処 理 区 を 設 け た.各 区 の 供 試 面 積 は10aで, い ず れ の 区 も 田植 え か ら収 穫 ま で 殺 菌 剤 は 使 用 し な か っ た.な お,IK-1080は い ず れ も菌 濃 度1.0×108 cfu/mlの 懸 濁 液 を10a当 た り各 々2001散 布 した.収 穫 直 前 の9月 7日 に 各 区 の発 病 穂 率 と発 病 度 を 調 べ た.穂 い もち の 発 病 率 は 各 区 内 の3ヵ 所 か ら1ヵ 所 当 た り20株(400穂)を, 発 病 度 は 各 区 内 の3ヵ 所 か ら1ヵ 所 当 た り150穂 を 無 作 為 に抽 出 し て,そ の うち の400穂 を 調 べ,算 出 し た.発 病 度 の 算 出 は 次 式 に よ っ た.発 病 度=((0×a+1×b+2×c+3 ×d+4×e)/4× 全 調 査 穂 数)×100.こ こ でaは 無 発 病 穂 数,bは1/3以 下 の 発 病 穂 数,cは1/3∼2/3ま で の 発 病 穂 数,dは2/3以 上 の 発 病 穂 数,eは 穂 首 い も ち発 病 穂 数 を 示 す. 2001年 の5月 ∼8月 に,2000年 と同 じ水 田 にお いてIK-1080 の 懸 濁 液 の 菌 濃 度 と穂 い もち の発 病 抑 制 効 果 との 関 係 を 調 べ た.イ ネ 品 種 は あ き た こ ま ち を 供 試 し,田 植 え は5月13 日に行 っ た.出 穂 日は7月20日 で,収 穫 日は8月29日 で あ った.こ の 試 験 で は 播 種 後21日 の 苗 を移 植 し,栽 植 密 度 と 施 肥 量 は2000年 と同 じ に し た.IK-1080の 懸 濁 液 の 菌 濃 度

88 日本植 物病理 学会 報 第69巻 第2号 平成15年5月 は1.0×108 cfu/mlお よ び5.0×108 cfu/mlの2濃 度 と し,10a当 た り2001を 散 布 し た.散 布 は7月16日,8月 3お よ び13日 に 行 っ た.対 照 区 と し て 化 学 農 薬 を 散 布 し た 慣 行 防 除 区 と 農 薬 を 散 布 し な い 無 防 除 区 を 設 け た.慣 行 防 除 区 は,育 苗 箱 で 育 て た 苗 に プ ロ ベ ナ ゾ ー ル 箱 粒 剤 を 509/箱 施 し,本 田 に は7月10日 に ピ ロ キ ロ ン 粒 剤 を,8 月5日 に カ ス ガ マ イ シ ン ・フ サ ラ イ ド粉 剤 を そ れ ぞ れ 4kg/10a散 布 し た.穂 い も ち の 発 病 は8月15, 22お よ び 29日 に 各 々 の 区 の 発 病 穂 率 と 発 病 度 を 調 べ た.発 病 度 は 2000年 と 同様 の 方 法 で 算 出 し た. 実 験 結 果 い も ち 病 菌 の 菌 叢 の 生 育 抑 制 IK-1080を 線 画 し たPSA平 板 上 で の い も ち 病 菌 の 菌 叢 の 半 径 は,培 養2日 と6日 後 に1.6mmで,11日 後 で も 3mmで あ っ た.一 方,無 処 理 区 で は 培 養2日 後 に 3.3mm, 4日 後 に9.8mm, 6日 後 に17.3mmお よ び11 日 後 に は37mmで あ っ た(Fig.1).こ の よ う にIK-1080 は い も ち 病 菌 の 菌 糸 の 生 育 を 著 し く抑 制 し た. い も ち 病 菌 胞 子 の 発 芽 お よ び 付 着 器 形 成 抑 制 効 果 IK-1080の 菌 濃 度1.0×106 cfu/mlの 懸 濁 液 に,い も ち 病 菌 胞 子 を 混 濁 さ せ た と き の 胞 子 発 芽 率 は95.2%, 5.0× 107 cfu/mlで は95.2%, 1.0×108 cfu/mlで は81.5%, 5.0 ×108 cfu/mlで _{は62 .3%お よ び1.0×109 cfu/mlで は50.6} %と な っ た(Fig. 2).ま た,付 着 器 形 成 率 は 各 々 の 濃 度 で52.6, 38.4, 18.6, 11.2お よ び5.2%で あ っ た.一 方, 無 処 理 区 の い も ち 病 菌 の 胞 子 の 発 芽 率 と付 着 器 形 成 率 は, そ れ ぞ れ96.3%と56.4%で あ っ た.こ の よ う にIK-1080の

Fig. 1. Suppression of hyphal growth of blast fungus by Bacillus subtilis IK-1080 cultured on potato sucrose agar plates. Mycelial inoculum (3-mm diameter) was placed in the center of the plate, and IK-1080 was streaked in two

parallel lines 2cm from the center of the plate. Plates were kept at 25•Ž.

Fig. 2. Effects of various concentrations of Bacillus subtilis IK-1080 on germination of blast fungal spores, appres-sorial formation and severity of leaf blast disease.

Sus-pension of IK-1080 was sprayed on 4.5-leaf-stage cv. Koshihikari plants, followed by spray inoculation with a suspension of blast fungal spores. A) Cellophane was placed on a 9-cm water agar plate, and 2ml of spore suspension was poured on top of the cellophane, and the rates of germination and appressorial formation were calculated after 8hr at 25•Ž. B) Disease severity was assessed 14 days later. Different letters indicate

significant differences at p=0.05 as determined by Student's t test. 菌 濃 度 が 増 す に つ れ て 発 芽 率 と付 着 器 形 成 率 が 低 下 した が,1.0×108 cfu/ml以 上 の 濃 度 で 対 照 区 との 間 に 有 意 差 が 認 め ら れ,特 に 付 着 器 形 成 の 抑 制 が 著 し か った(Fig. 2). 次 に,24時 間 前 にIK-1080の 菌 濃 度 を5.0×107お よび 1.0×108 cfu/mlに 調 整 した 懸 濁 液 に,い もち 病 菌 胞 子 を 混 濁 さ せ た と きの8時 間 後 の 胞 子 発 芽 率 と付 着 器 形 成 率 は,そ れ ぞ れ28.0%と3.0%お よび28.9%と1.4%で あ った (Fig. 3).ま た,直 前 に 作 成 し た 懸 濁 液 中 で は,そ れ ぞ れ の 濃 度 で35.0%と6.0%お よ び39.3%と11.9%と な っ た. 一 方_{,い も ち病 菌 胞 子 を滅 菌 水 で 懸 濁 した 無 処 理 区 で は そ} れ ぞ れ38.2%, 17.9%で あ った.こ の よ う に24時 間 静 置 し て お い たIK-1080の 懸 濁 液 の 方 が,作 成 直 後 の懸 濁 液 よ り も胞 子 の 発 芽 お よび 付 着 器 の 形 成 を 顕 著 に抑 制 した. 葉 い も ち の発 病 抑 制 効 果 IK-1080の 処 理 方 法 の 違 い が 葉 い もち の 発 病 抑 制 効 果 に 及 ぼ す 影 響 を検 討 した.菌 濃 度1.0×108 cfu/mlの 懸 濁 液 を 散 布 し,2時 間 後 に い もち 病 菌 胞 子 を噴 霧 接 種 した 区 の

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Concentration of IK-1080 (cfu/ml)

Fig. 3. Effects of addition of blast fungus spores to the

sus-pension of Bacillus subtilis IK-1080 just after prepara-tion of the solution and at 24hr after preparation on

rates of germination and appressorial formation. The fungal spore suspension (2ml) was poured on top of cellophane placed on plate of water agar. Germination and appressorial formation were calculated after 8hr at 25•Ž. Different letters indicate significant differ-ences at p=0.05 as determined by Student's t test.

葉 い も ち の 進 展 型 病 斑 数 と発 病 度 は,そ れ ぞ れ14.0個 と 1.1で あ っ た(Table 2).い も ち 病 菌 胞 子 をIK-1080の 懸 濁 液 の 中 に 混 濁 さ せ て イ ネ 株 に 噴 霧 接 種 し た 区 で は,そ れ ぞ れ7.5個 と1.1と な っ た.一 方,無 処 理 区 で は そ れ ぞ れ 31.0個 と4.5で あ っ た.こ の よ う に 両 処 理 区 と も 顕 著 な 発 病 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た. 次 に,IK-1080の 菌 濃 度 が 葉 い も ち の 発 病 抑 制 に 及 ぼ す 影 響 を 調 べ た.菌 濃 度 が1.0×106 cfu/ml区 の 葉 い も ち の 発 病 度 は3.9で,無 処 理 区 と の 有 意 な 差 が な か っ た.5.0× 107 cfu/ml区 で は1.8, 1.0×108 cfu/ml区 で は1.0, 5.0×

Days after IK-1080 spray

Fig. 4. Relationship between the duration from treatment with IK-1080 suspension until inoculation with the blast spores and the suppressive effect on disease. A suspension (5ml) of 1.0•~108 cfu/ml of IK-1080 was sprayed on each 5.5-leaf-stage cv. Koshihikari plant

1 day, 3, 5 and 7 days before inoculation with blast fungus. After inoculation, plants were kept in a moist chamber for 22hr, then kept in a greenhouse. Disease severity was examined 14 days after fungal inocula-tion. Different letters indicate significant differences at p=0.05 as determined by Student's t test.

108 cfu/ml区 で は0.7お よ び1.0×109 cfu/ml区 で は0.4と な り,無 処 理 区 に お け る 発 病 度4.1と の 間 に 有 意 差 が 認 め ら れ た(Fig. 2).こ の よ う にIK-1080懸 濁 液 の 菌 濃 度 が 高 く な る ほ ど 発 病 抑 制 効 果 が 高 く な っ た. IK-1080の 懸 濁 液 を 散 布 し た 後 の 日数 と葉 い も ち の 発 病 抑 制 の 関 係 を 調 べ た.IK-1080を 散 布 し た 区 の 発 病 度 は, い も ち 病 菌 胞 子 を 接 種 す る1日 前 散 布 区 が1.5, 3日 前 散 布 区 が0.8, 5日 前 散 布 区 が0.7お よ び7日 前 散 布 区 が4.5 と な っ た(Fig. 4).一 方,無 処 理 区 に お け る 葉 い も ち の 発 病 度 は4.7で あ っ た.こ の よ う にIK-1080の 懸 濁 液 を 散

Table 2. Effect of treatment with Bacillus subtilis IK-1080 suspension before inoculation with blast

fungal spores on suppression of leaf blast diseasea)

a) Plants were kept in a moist chamber for 22hr after inoculation with pathogen, and number of lesions and disease severity were examined 8 and 14 days later, respectively.

b) Five ml of a solution containing 1.0•~108 cfu/ml of IK-1080 was sprayed on each plant of cv. Koshi-hikari at the 5.5-leaf stage 2hr before inoculation with fungal spores.

c) A mixed solution of IK-1080 and rice blast fungal spores was applied to each plant.

d) Different letters a, b, c and d indicate significant differences at p=0.05 as determined by Student's t test.

90 日本 植 物病 理 学会報 第69巻 第2号 平 成15年5月 布 し た 区 で は,無 処 理 区 と比 べ 散 布5日 後 ま で の 発 病 度 は 顕 著 に低 か った が,7日 後 に は 差 が認 め られ な か っ た. 葉 身 上 の 病 斑 の 拡 大 と胞 子 形 成 に及 ぼ す 影 響 い もち 病 菌 の 接 種 前 にIK-1080の 懸 濁 液 を散 布 す る と と も に,病 斑 に もIK-1080を 散 布 した 区 の 病 斑 長 は病 原 菌 接 種7日 後 に は5.7mm, 14日 後 に は12.0mmで あ った. 一 方_{,IK-1080を 病 斑 に 散 布 しな か っ た 区 で は そ れ ぞ れ} 8.3mmと19.3mmで 処 理 間 に 有 意 差 が 認 め られ た.ま た,い もち 病 菌 の 接 種 前 にIK-1080を 散 布 せ ず に,病 斑 の み に 処 理 した 区 の7日 後 の 病 斑 長 は13.3mm, 14日 後 は 26.2mmで あ り(Fig. 5),無 処 理 区 の そ れ ぞ れ13.4mm と23.6mmと の 間 に 有 意 な 差 は な か っ た.ま た,病 斑 上 に形 成 さ れ た い もち 病 菌 の 胞 子 数 も,IK-1080散 布 区 が面 積100mm2当 た り23,300個,無 処 理 区 が17,000個 で,両 者 の 間 に 有 意 な 差 は な か っ た. 穂 い も ち の発 病 抑 制 効 果 本 田 に お け るIK-1080の 散 布 回 数 と穂 い もち の 発 病 抑 制 効 果 を2000年 と2001年 の2年 に わ た っ て 調 べ た.2000年8 月16日 に1回 の みIK-1080の 懸 濁 液 を散 布 した 区 の9月7 日の 発 病 穂 率 は40%, 8月5お よび16日 の2回 散 布 した 区 で は30.4%, 8月5, 16お よび25日 の3回 散 布 した 区 で は

Fig. 5. Suppressive effect of treatments with Bacillus subtilis

I K-1080 suspension on growth of blast lesions on

leaves of rice plants of cv. Koshihikari. Bs-Bs: IK-1080

suspension was sprayed on leaves before inoculation

with fungal spores and applied again to the blast

lesions 14 days after inoculation. Bs-Co: IK-1080

sus-pension was sprayed on leaves only before inoculation

with blast fungal spores. Co-Bs: IK-1080 suspension

was not sprayed on leaves before inoculation with blast

fungal spores but was applied to blast lesions 14 days

after inoculation. Co-Co: IK-1080 suspension was not

sprayed on leaves before inoculation of fungal spores

or on lesions after inoculation. Different letters

indi-cate significant differences at p=0.05 as determined

by Student's t test. 10.3%で あ っ た.ま た,発 病 度 は そ れ ぞ れ11.8, 9.2お よ び4.4で あ っ た(Fig. 6).一 方,無 処 理 区 に お け る 発 病 穂 率 と 発 病 度 は,そ れ ぞ れ69.0%と29.7で あ っ た(Fig. 6). こ の よ う に3回 散 布 区 で 最 も 発 病 抑 制 効 果 が 高 か っ た. 2001年 の 試 験 で,IK-1080の 菌 濃 度 を1.0×108 cfu/ml と し た 区 の8月15, 22お よ び29日 の 発 病 穂 率 は そ れ ぞ れ 11.3, 32.8お よ び85.3%で,発 病 度 は そ れ ぞ れ4.0, 13.8 お よ び39.6と な っ た(Fig. 7).菌 濃 度 を5.0×108 cfu/ml と し た 懸 濁 液 を 散 布 し た 区 の 発 病 穂 率 は そ れ ぞ れ6.6, 18.5お よ び34.0%で,発 病 度 は そ れ ぞ れ2.3, 7.7お よ び 11.9で あ っ た.慣 行 防 除 区 で は 発 病 穂 率 は そ れ ぞ れ7.8, 10.9お よ び26.8%で,発 病 度 は そ れ ぞ れ2.5, 3.3お よ び 11.4で あ っ た.一 方,無 防 除 区 で は 発 病 穂 率 は そ れ ぞ れ 25.8, 59.8お よ び93.9%,発 病 度 は そ れ ぞ れ9.9, 28.1お よ び63.3で あ っ た(Fig. 7).こ の よ う にIK-1080の 菌 濃 度 を 変 え て 処 理 し て も,穂 い も ち の 高 い 発 病 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た.ま た,菌 濃 度 が5.0×108 cfu/mlの 懸 濁 液 を 散

Fig. 6. Effect of number of treatments with Bacillus subtilis 1K-1080 suspension on rate of fungal infection and severity of panicle blast. Heading started on 7 August, and rate of infection with panicle blast (A) and disease severity (B) were surveyed on 9 September. See Table 1 for criteria for estimating disease severity. Plants were treated with IK-1080 suspension solution one (16 August), two (4 and 16 August) or three times (4, 16 and 25 August). Different letters indicate significant differences at p=0.05 as determined by Student's t test.

Jpn. J. Phytopathol. 69 (2). May, 2003 91

Fig. 7. Effect of different concentrations of Bacillus subtilis I K-1080 suspension for treatment of rice plants cv.

Akitakomachi in paddy field on fungal infection and disease severity of panicle blast. (A) effect on fungal infection and (B) effect on disease severity. Suspen-sion of either 1.0•~108 and 5.0•~108 cfu/ml of IK-1080 were sprayed on rice plants on 16 July (before head-ing) and on 3 and 13 August at 200L/1000m2. See Table 1 for criteria estimating disease severity. Differ-ent letters indicate significant differences at p=0.05 as determined by Student's t test.

布 し た 区 の 方 が1.0×108 cfu/mlの 懸 濁 液 を 散 布 し た 区 よ り も 穂 い も ち の 発 病 抑 制 効 果 は 高 く,慣 行 防 除 区 と差 が な か っ た. 考 察 B. subtilisは 多 くの 糸 状 菌 の 生 育 や 胞 子 の 発 芽 を 抑 制 す る こ と が 報 告 さ れ て い る1,2,12,19,23).本 研 究 に お い て 供 試 し たIK-1080も,正 田23)がB. subtilis NB22で 報 告 し た の と 同 様 にPSA平 板 上 で い も ち 病 菌 の 生 育 を 著 し く抑 制 し た.ま た,IK-1080の 懸 濁 液 中 で の 胞 子 の 発 芽 率 が 著 し く 低 下 し た こ と か ら,IK-1080は 抗 菌 物 質 を 産 生 す る こ と が 示 唆 さ れ た.同 時 に 付 着 器 の 形 成 も 著 し く抑 制 さ れ た こ と か ら,IK-1080の 病 原 菌 に 対 す る 発 病 抑 制 機 作 は,複 数 存 在 す る と考 え ら れ た. IK-1080の 菌 濃 度 が5.0×107 cfu/mlで い も ち 病 菌 胞 子 の 付 着 器 の 形 成 抑 制 が 認 め ら れ た が,1.0×108 cfu/ml以 上 に な る と そ の 効 果 は よ り顕 著 に 現 れ る と と も に,胞 子 の 発 芽 率 も急 激 に低 下 し た.ま た,ポ ッ ト試 験 で の 葉 い も ち に 対 す るIK-1080の 発 病 抑 制 効 果 は,懸 濁 液 の 菌 濃 度 が 5.0×107 cfu/ml以 上 で認 め られ,1.0×108 cfu/ml以 上 に な る とそ の 効 果 は よ り著 し か っ た.こ れ らの 濃 度 は分 生 胞 子 の発 芽 率 が 急 激 に 低 下 し,付 着 器 の 形 成 が 著 し く抑 制 さ れ る濃 度 と 同 じで あ った.こ れ らの こ とか ら葉 い も ち の 発 病 を抑 制 す る現 象 と発 芽 お よ び付 着 器 の形 成 を 抑 制 す る現 象 と は 密 接 に 関 係 し て い る と考 え ら れ た.ま た,IK-1080の 懸 濁 液 の 散 布 当 日 に い もち 病 菌 胞 子 を 接 種 し た イ ネ 株 よ り,3お よ び5日 を 経 過 して 接 種 した イネ株 の方 が い もち病 の 発 病 が 著 し く少 な か っ た.こ れ らの 結 果 は,正 田24)が 指 摘 し て い る よ う にIK-1080がiturin Aお よ び surfactinの よ うな い もち 病 菌 に 高 い 抗 菌 作 用 を 持 つ 物 質 を産 生 して い る こ とを 示 唆 して い る.し か し,自 然 環 境 下 に お い て,2次 代 謝 産 物 と して 産 生 され る抗 菌 物 質 等 が, い も ち病 菌 に 抗 菌 性 を 示 す の に十 分 な 量 が産 生 さ れ る とは 考 え難 く,IK-1080の 産 生 す る抗 菌 物 質 の み が い もち 病 菌 に作 用 し発 病 抑 制 効 果 を発 現 し て い るり で は な い と思 わ れ る.む しろ,葉 上 に付 着 した い もち 病 菌 胞 子 の活 性 抑 制 や イネ 体 上 で の 定 着 の 阻 害 な ど複 数 の 作 用 に よ り発 病 抑 制 効 果 が発 現 さ れ て い る もの と推 察 さ れ た8). 一 方_{,IK-1080の 懸 濁 液 を イネ 葉 に散 布 して か ら2時 間} 後 に い もち病 菌 胞 子 を 接 種 した 方 が,散 布 直 後 に接 種 す る よ り も発 病 が 抑 制 さ れ た.IK-1080は 芽 胞 の 形 態 で 散 布 さ れ る た め,効 果 を 発 揮 す る ま で ラ グ 時 間 が 発 生 し,こ の ラ グ 時 間 が 発 病 抑 制 効 果 に 重 要 な 影 響 を もた らす と思 わ れ た.本 試 験 で はIK-1080の 懸 濁 液 を散 布 した 時 に,既 に展 開 し て い る葉 で の 感 染 は 抑 制 で き た が,散 布7日 以 降 に新 た に 出 た葉 で は 発 病 を抑 制 で きな か った.イ ネ は5∼7日 で1枚 の 葉 が 出 る4,10,31)ことか ら,IK-1080は 新 葉 上 に 十 分 に移 行 しな い こ と,お よ び イネ に 全 身 的 な 抵 抗 性 を 誘 導 す る作 用 が な い こ とを 示 し て い る.す な わ ちIK-1080を 用 い て 葉 い も ち を 防 除 す るた め に は,約6日 間 隔 で 本 菌 を 散 布 す る 必要 が あ る.一 方,IK-1080の 懸 濁 液 を 感 染 前 と発 病 後 に連 続 して 散 布 す る と,葉 い もち病 斑 の 拡 大 が 顕 著 に 抑 制 さ れ胞 子 形 成 量 も少 な くな った.こ れ らの こ と は, IK-1080の 連 続 し た散 布 に よ っ て 発 病 抑 制 効 果 が 高 ま る こ とを 示 し て い る.今 後 は 散 布 時 刻,散 布 間 隔 お よび 散 布 回 数 に つ い て もさ ら に検 討 が 必 要 で あ る. 拮 抗 微 生 物 を 用 い た穂 い も ち の 防 除 に つ い て はPseudo-monas fluorescensで 報 告 さ れ て い る32)が,B. subtilisで は 見 当 た らな い.イ ネ は 出穂 か ら収 穫 す る ま で の 日数 が 約40

日間 で あ る.い もち 病 菌 の 感 染 が 収 穫量 に 直 接 影 響 す る期

92 日本植物 病理学 会報 第69巻 第2号 平成15年5月 菌 の 感 染 を抑 制 す れ ば 被 害 を抑 制 で き る と考 え ら れ た.本 試 験 で は,葉 い もち で 発 病 抑 制 効 果 が 認 め られ たIK-1080 の 菌 濃 度1.0×108 cfu/mlの 懸 濁 液 を,出 穂 期 か ら10日 間 隔 で3回 散 布 す る と穂 い も ち で も著 しい発 病 抑 制 効 果 が 認 め られ た.ま た,菌 濃 度 を5倍 の5.0×108 cfu/mlと す る とさ ら に効 果 が 高 ま り,慣 行 防 除 区 と差 が な か った.こ れ らの 結 果 は,IK-1080を 連 続 して 散 布 す る こ とに よ っ て 発 病 抑 制 効 果 が 維 持 さ れ る こ とを 示 して い る. 拮 抗 微 生 物 を イ ネ 株 に 処 理 す る方 法 と し て,(1)種 子 粉 衣,(2)浸 漬 処 理 お よ び(3)直 接 散 布 が 報 告 さ れ て い る2,15,17,24,32).P. fluorescensを 種 子 に 処 理 して 播 種 す る と イ ネ に抵 抗 性 が 誘 導 さ れ る25).ま た,P. fluorescensは イ ネ の種 子 に 処理 あ るい は 葉 面 散 布 され る と,イ ネ 体 上 で増 殖 して顕 著 な発 病 抑 制 効 果 を 示 す32).Mewら17)は い も ち 病 菌 に抗 菌 作 用 を 有 す る2種 類 のBacillus属 菌 を種 子 に処 理 して 播 種 し,110日 後 も葉 面 か ら高 率 に 分 離 され た と して い る.今 後,IK-1080を 種 子 処 理 や 葉 面 散 布 し た と き に 本 菌 が イ ネ株 上 に お い て ど の よ うに 生 存 し て い る か を 明 らか に す る必 要 が あ る.さ らに,い もち病 菌 の 感 染 は 葉 上 の 結 露 時 間 に も左 右 さ れ る た め5,31),葉 上 の 結 露 中 に お け る IK-1080の 挙 動 に つ い て も詳 細 な 解 明 が 必 要 と考 え ら れ た.ま た,IK-1080を 散 布 し た 水 田 でCladosporium属 菌 が 多 発 生 し,籾 の表 面 が 煤 状 に な った 穂 も認 め られ た(田 口 ら,未 発 表).今 後 は,IK-1080処 理 が 他 の 糸 状 菌 の 発 生 に どの よ うに 影 響 を 与 え る か も検 討 が 必 要 で あ る.そ の ほ かIK-1080が 産 生 す る抗 菌 物 質 の 同 定,お よび散 布 後 の 葉 上 に お け る菌 密 度 の 推 移 や 抗 菌 物 質 の 存 在 な ど も 明 らか にす る必 要 が あ る. 摘 要

イ ネ い もち 病 に 対 す るBacillus subtilis IK-1080の 生 物 防

除 エ ー ジ ェン ト と し て の 実 用 性 を 明 ら か に す る た め,本 試 験 を 行 っ た.い も ち 病 菌 を 拮 抗 微 生 物B. subtilis IK-1080株 とPSA平 板 上 で 対 峙 培 養 す る と,菌 糸 の 生 育 を 著 し く抑 制 し た.菌 濃 度1.0×106, 5.0×107, 1.0×108, 5.0 ×108お よ び1.0×109 cfu/mlのIK-1080懸 濁 液 に い も ち 病 菌 胞 子 を1.0×103個/mlに な る よ う に 混 濁 さ せ て セ ロ フ ァ ン 上 で 発 芽 さ せ る と5.0×107 cfu/mlで 胞 子 の 付 着 器 形 成 が,ま た,1.0×108 cfu/mlで 発 芽 率 が 抑 制 さ れ 始 め た.5.0×108 cfu/mlで は 付 着 器 形 成 率 と発 芽 率 は そ れ ぞ れ11.2お よ び62.3%と 対 照 の56.4, 96.3%に 比 べ 著 し く低 下 し た.前 述 と 同 じ 菌 濃 度 の 懸 濁 液5mlを4.5葉 期 の 品 種 コ シ ヒ カ リ の 葉 に 散 布 し た 後,1.0×104個/mlに 調 整 し た い もち 病 菌 の 胞 子 懸 濁 液 を 噴 霧 接 種 す る と菌 濃 度 が5.0× 107 cfu/ml以 上 で 葉 い もち に 対 す る有 意 な発 病 抑 制 効 果 が 認 め られ た.ま た,発 病 度 の 抑 制 割 合 と付 着 器 形 成 の抑 制 率 との 間 に は 高 い 相 関 関 係(r=0.9374, p<0.01)が 認 め ら れ た.い もち 病 菌 胞 子 の 接 種14日 後 に形 成 され た 葉 い も ち 病 斑 にIK-1080を 散 布 す る と7日 後 の病 斑 長 は13mm でB. subtilisを散 布 し な か っ た 対 照 区 と差 が な か っ た.一 方,い もち病 菌 の 接 種 前 と接 種14日 後 に2回 散 布 す る と病 斑 長 は6mmと な り,病 斑 の 伸 長 が顕 著 に 抑 制 され た.こ れ らの こ とか ら,IK-1080を 利 用 して 葉 い もち を 防 除 す る た め に は,病 原 菌 が 侵 入 す る 前 に処 理 す る必 要 が あ っ た. 2000年 に,山 間 地 域 の い もち 病 常 発 水 田 に お い て,1.0× 108 cfu/mlに 調 整 し たIK-1080の 懸 濁 液 を 出穂 直 前,出 穂 9日 お よび18日 後 に散 布 し た と こ ろ,対 照 の 無 処 理 区 の 穂 い も ち の発 病 度 が29.7に 対 して,処 理 区 で は10.3と な り, 防 除 価 も65.3と 高 い 発 病 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た.ま た, 2001年 に 同 じ水 田 で1.0×108 cfu/mlと5.0×108 cfu/ml のIK-1080懸 濁 液 を 出穂 直 前,出 穂13お よび23日 後 の3回 散 布 し た と こ ろ,穂 い も ち の 発 病 度 は 対 照 の 無 処 理 区 が 29.1に 対 し,そ れ ぞ れ の 処 理 濃 度 で13.8, 7.7と な り,防 除 価 も52.5, 73.5と 高 く,い ず れ も発 病 抑 制 効 果 を 示 し た. 謝 辞 本 研 究 を 進 め る に 当 た り,貴 重 な ご 助 言 を い た だ い た (独)農 業 技 研 究 機 構 東 北 農 業 研 究 セ ン ター 小 泉 信 三 博 士 に 深 甚 な る感 謝 の 意 を表 す る. 引 用 文 献

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