ラットに対する長期アルコール投与の影響

原 著

〔書騰樽28第稀62嶽骨〕

岡本糸枝賞受賞論文

ラットに対する長期アルコール投与の影響

東京女子医科大学 生化学教室（主任：降矢 焚教授） アラキ キミコ シノザキリ エ コ マエザワ

荒木 仁子・篠崎理恵子・前沢まゆみ

（受付 昭和62年2月4日）

Effects of Long・Term Ethanol Administration in Rats Kimiko ARAKII， Rieko SHINOZAK：I and Mayumi MAEZAWA

Department of Biochemistry（Director：Prof． Kei FURIYA） Tokyo Women’s Medical College

The effects of chronic ethanol−feeding for a period of 7 months on the red blood cells and liver of male Wister rats have been investigated． Thirty five％of total carolies of a nutritionally adequate fluid diet was replaced by ethanol and the experimental animals were fed by drinking bottle．

Echinocytes were observed with the increase in free cholesterol content， free cholesterol／phos− pholipid ratio and phosphatidylcholine／sphingomyelin ratio in the rat erythrocyte membranes． These findings were almost the same as those found in patients with alcoholic liver cirrhosis．

緒 言 近年日本でもアルコールの飲用が増加するにつ れ，重度のアルコール性肝障害を起こす症例が増 加しつつあり，社会的にも大きな関心をよんでい る．従ってアルコール性肝障害の成因，代謝異常， 治療法などの研究はわれわれにとって大きな課題 の一つである1）耐．しかしこの際，ヒトを対象とす ることは困難が多く，生体モデルとしてサル，イ ヌ，ラットなど種々の動物が使われてきた．この うちラットは価格を含めて日常の扱い易さの点で 勝れているが，寿命が短く，高度なアルコール性 肝障害を呈するまでアルコールを長期に大量投与 することは困難であるとされてきた4）．今般著者 らは，比較的長期間ラットをアルコール含有食で 飼養する機会を得，赤血球の形態変化を中心に， いささかの知見を得たので報告する． 動物および実験方法 1．動物および飼養方法 4ないし5週齢のウイスター系雄ラットを購入 し，1群10ないし12匹を2分し，対照およびアル コール投与群とした．山群とも最初2日∼10日間 は対照飼料（アルコールを含まない液体食）を飲 料水用容器で与え，摂取量が一定したところで実 験論にはアルコール含有液体食を投与した．アル コール濃度は当初！％から段階的に濃度を上げ， 最終的には5％（w／w）を継続した．飼料の組成 を表1に示すが，Lieberの処方を準用し自家調合 した．当初の実験では食餌は1匹あたり1日200 m1（200kca1）を原則として午前中に投与した．液 体食以外は水分その他一切与えなかった．アル コール投与群で時に飼料を飲み残す傾向がみられ たが，対照群との間で投与量の調節はしなかった． 5％アルコール食での飼養期間は20∼30週（4 ∼7カ，月）である． 2．実験方法 ラットは屠殺当日まで餌を与え，実験に際し， 撲殺またはエーテル麻酔下に開腹し，腹部動脈か らヘパリン採血を行った．ついで臓器を取り出し

表1 液体食組成（100m1あたり） 対 照 アルコール群 カービイン 4，14g 4．14 チスチン 0．05 0．05 メチオニン 0．03 0．03 、 一 不フル 2．0 2．0 ビタミン剤 0．5 0．5 紅花油 1．0 1．0 オリーブ油 2．86 2．86 デキストリン 15．1 5．0 カラゲナン 0．24 024 セルロース 0．5 0．5 無水アルコール 0 6．0 熱 量 111Kca1 113Kcal 分析に供した．血液は3，000rpm 10分遠心し血漿 を分取，1血球部分は生理的食塩水または等張リン 酸緩衝液で3回洗浄後リン酸緩衝液に浮遊させ， 赤血球浮遊液とした． a）赤血球形態の観察 赤血球浮遊液約3滴を1％グルタルアルデヒド （0．1Mリン酸緩衝液pH 7．4）中に滴下し，室温で 20分間放置して固定する．固定後40×g，10分間遠 心し血球を集め，緩衝液で洗浄を繰返す．あらか じめポリカチオン溶液で処理したスライドガラス 上に浮遊液を載せ，エタノールで脱水後臨界点乾 燥し，さらに金蒸着の後日立HHS−2R型走査電子 顕微鏡により形態を観察した． b）赤血球膜脂質の分析 赤血球膜脂質は柴田らの方法5）に準じてイアト ロスキャンTH−10水素炎イオン化検出装置（株式 会社ヤトロン製）で分析した．すなわち赤血球浮 遊液を等張のリン酸緩衝液（pH 7，4）で3回洗浄

した後packed cell O，9mlに対し蒸留水1．Omlを 加え混和溶血させる．さらにイソプロパノール11 mlを加え混和後室温に1時間静置する．次にクロ マトグラム用クロロホルム7mlを加え混和し1時 間放置する．これに生理的食塩水4mlを加え緩や かに混和した後4℃に一夜静置する．上層の水層 は吸引によって除いた後イソプロパノール・クロ で ロホルム混液層を脂取する．濾液を減圧乾固した 後，クロロホルム：メタノール内液（2：1）の 0．4mlに溶解する．この2μ1をクロマロッド下端3

cmに塗布し，クロロホルム：メタノール：水

（70：35：3，5v／v％）で18℃，20分間展開する．こ れを水素＝炎イオン化検出装置にかけ，同様に処理 した標準液と対比し，各脂質画分を同定，測定し た． c）肝脂質露分の分析6） 肝脂質は肝500mgをガラス製ホモゲナイザー にとり，メタノール3．5mlを加えてホモゲナイズ する．次にクロロホルムを10mlの画線まで加え， 十分混和する．25℃に4時間静置した後東洋濾紙 No．6で濾過し濾液をとる．残渣はクロロホル ム：メタノール血液（2：1）で再抽出し，濾液 は先の濾液とあわせる．これをクロロホルム：メ タノール混液（2：1）で総量10mlとした後生理 的食塩水0．2mlを加え，軽く混和して4℃に一夜 静置する．3，800rpm 15分遠心の後，上相の水相を 吸引除去し，クロロホルム・メタノール相をコレ ステロール（Choと略）およびトリアシルグリセ ロール（TGと略）の分析にあてた． ChoはZak− Henly法に準じて測定し7）， TGは酵素法で測定し た8）． d）その他の分析法 血液ヘモグロビン濃度は松原らのシアンメトヘ モグロビン法9），血中アルコール濃：度はBucherら の方法10），血漿ChoはZak−Henly法， TGはやト ロン社製ニュータリンテックを用い，グリセロー

ル消去一酵素法で測定した．Aspartate

aminotransferase（GOTと略する）および

Alanine aminotransferase（GPTと略する）は

Karmenらの方法に準じ340nmの吸光度変化か

ら測定した11）．レシチン・コレステロールアシルト ランスフェラーゼ（LCATと略）は長崎・赤沼ら の方法に従った12）．アミノ酸分析は血漿の5％ス ルポサリチル酸除タンパク液をpH 2．2とし，日立 アミノ酸分析機を用い，ワンカラム法で分析した． 肝の病理組織標本は常法に従って作製した． 測定結果は平均値±標準偏差で示し，Student のt検定に従って有意差を検定した． 結 果 1．体重および組織重量について ラヅトをアルコール食で20∼30週飼育した場合

表2 各群別 体重，肝重量，肝重量／体重比 アルコール投与 ■ jcal／日 週数 種別 例数 _{体重（9）} ｽ均値±SD 肝重量（9） ｽ均値±SD 肝重量／体重×100 @平均値±SD 30 CA 56 566±27．9 S25±27．6 16．71±1．07 P3．77±1．48 2．96±0．22 R．24±0．33 200 25 CA 54 553±38．2 S15±45．1 16．47±1．38 P3，00±1．04 2．98±0．22 R．17±0．54 20 CA 56 421±27。0 R38±29．0 12．64±2．13 P0．35±0．93 2．99±0．39 R．06±0．28 80 13 CA 45 290±14．2 Q86±19．9 1LO2±1．33 P1．65±0，85 3．76±0．51 S．09±0，27 C：対照群 A：アルコール飲用群 body weight 600 500 400 300 200 100 嚢● 1壼 篭 工 ！ 1 1 1 1 工

i i エ エ

●control Oalcoholic i 717 31 47 61 77 109 140 171 201 231 days after feeding day

図1 Effect of ethanol feeding on body weight

の体重の変動を図1に示す．飼養日数の増加とと もに体重も増加するが，対照群での体重増加が顕 著で，20∼30週後には対照群ではことに腹腔，皮 下への脂肪沈着が著しかった，投与食餌は両群と も1日1回200m1，200kca1を与えたが，対照群で は翌朝には給餌瓶が全く空になっていたのに対 し，アルコール摂取群ではときに飼料を飲み残す ことがあり，この差を招いたものと思われる．表 2に各群の体重，肝重量，肝重量／体重比を示すが， 1日200kcal投与群では体重，肝重量とも1％水 準で対照群が有意に高かった．しかし肝重量／体重 比はアルコール群の方が高値を示したが有意差は 認められなかった． 2．赤血球および肝組織の形態学的変化 赤血球の走査電子顕微鏡像について代表例を図 2に示す．本例は30週間アルコール含有食を与え

Alcohol Control

図2 Scanning electron micrograph of rat eryth・ rocytes たもので，対照では変形した赤血球はほとんど認 められなかったのに対し，アルコール摂取群では ヒトのアルコール性肝硬変の場合に似た有棘赤血 球が多数出現した．アルコール投与期間が20週以 下の場合にはこのような変形は認められなかっ た， この間，肝組織の光学顕微鏡像はアルコール飲 用ラット群の方が禰漫言の脂肪沈着が強いように 見受けられたが対照群にもかなりの脂肪肝を呈す るものもあり，必ずしも差は判然としなかった（写 真a，b）． 3．血液および肝の化学成分ならびに酵素活性 の変動 1）血漿および肝のトリグリセリドならびにコ レステロール二

図3に血漿および肝のTGとCho値の分布と

平均値±標準偏差を示す．両成分とも個体差ある いは週齢によるバラツキがみられるが，：血漿では TG， Choともアルコール摂取群の方が低値を示 したが有意差はなかった．肝では逆にアルコール 摂取群で高値の傾向を示し，Choは5％水準で有 意、差を認めた． 2）血漿の酵素活性 GOTはアルコール群（n＝5）で74．6±11．8 mU／ml，対照群（n＝5）で63．5±21，0mU／ml， GPTはアルコール群は21．3±5．2，対照群は 21．1±3．2mU／ml， LCATはアルコール群71．6± 35，4，対照群99．3±80，4㎜01e／ml／h．となり， GOT， GPTはアルコール摂取群で高値の傾向を 示し，LCATは逆にアルコール群で低値の傾向を 示したが，対照群との間に有意差は認められな かった． 3）血漿のアミノ酸組成 20週間アルコール含有液体食で飼養したラット の血漿アミノ酸組成を測定した．そのうち分枝鎖 アミノ酸（BCAAと略）および芳香族アミノ酸に ついての結果を図4に示す．チロシン，α・アミノ

酪酸（AAAと略）およびBCAA／AAA比がアル

コール摂取群で有意に高かった． TG mg／g tissue 28！ 20 10． ●

坐

● ●● Liver Ch・lester・l mg／g tissue

⊥・／28

土

2010 10 5

受醗

・♂9

串

● ●● 10 5 Corltrol Alcoholic l1．54＝ヒ4．19 ／2．79±5．41 3． Plasma mg／dl TG mg／d1 2（）0 ユ00 Control AlcohQlic 145，7」二77，〔） 10／，Q＝ヒ56．6 2GO ユ00 Contro／ Alcoholic 44±0．53 4．16＝ヒ1．13 ● ● ・㌔ o Cholestero1 ● ● ●・ ●●

志

● ● 図3 Effect of chronic

major lipids of rats

Control． Al￠ohQlic 15Q．2土55．Q 119．O±44．6 ethano1−feeding on the 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 nτno1／1 悔1

?n

一暴

一瓢

BCAA

・鷹．匿副・＊

［コC・nt・・1 匿遡AICQholic Contro1 Alcoholic

・㎞・一

nyp心

BCAA／AAA EAA／nonEAA 1．83＝ヒ0．21 1．51＝ヒO，06＊ 0，53±0．03 0．49＝ヒ0．OI

AAA

f・・

＊P〈0，10 ＊＊P〈0．05 ＊＊＊P〈0．025

荒木論文付図

a）アルコール飲用ラット 200kcal／日 20× b） コントロール 200kca1／日 20×

c）アルコール飲用ラット 80kcal／日 4× d）コントロール 80kca1／日 4×

アルコール飲用群はa），c）ともカロリーの35％をアルコールで投与．

写真肝組織像

ズダンlll染色

表3 Lipid composition of erythrocyte mem−

branes of ethanol・treated and control rats

Control％ Alcoholic％ FC 28．37±1．81 32．18±1．58ホ＊ PE 21．37±0．99 22．33±1．84 PS 7．07±2．01 6．70±1．00 PC 36．81±2．01 33．41±1．42率

SM

6．39±0．97 5，43±0．81 FC／PL 0．392±0．032 0．469±0．0042寧事 PC／SM 5．84±0．95 6．26±0．88 癖噛_{垂ｭ0．005 率pく0．025}

Values represent means±S．D． Control n＝5， Alcoholic n＝6 4）赤血球膜脂質組成 表3に20∼21週間5％アルコール食で飼養した ラットの赤血球膜脂質組成を重量比で示す．遊離 コレステロール（FCと略），ホスファチジルコリ ン（PCと略）および遊離コレステロール／リン脂 質（Pしと略）比が対照とアルコール摂取群の間で 有意差を認めた．25週および30週アルコールで飼 養した場合も脂質組成の変化は20∼21週の場合と 同様の傾向を示した． 考 察 大量のアルコールを長期間投与した場合，ヒト を含めて動物で脂肪肝を起こすことはよく知られ ている．ヒトでは飲酒を続けることにより究極的 には肝硬変を起こし死亡する者もある．このアル コール性肝硬変の発生機序は未だ不明の点が多い が，その条件の一つとして“長期，大量摂取”が あげられている．従ってラットのような小動物で “アルコール性肝障害”を再現しようとする場合， その寿命の点から“アルコール性肝硬変”を起こ すほど長期間ラットを高アルコール食で飼養する ことは困難であるとされてきた．著者らは市販ウ イスター系雄ラットを離乳後間もなくから高アル コール食（カロリーの35％をアルコールから摂取） で30週にわたり飼育し，赤血球の走査電顕像を観 察したところ，図2に示すように多数の有棘赤血 球を認めた．このような赤血球の出現は成人では 腎障害を別にすれぽアルコール性肝硬変特有の所 見とされている．ラットを20週ないし25週高アル コール食で飼養した場合は対照との間で赤血球像 に差がなかった．今回の実験ではアルコールによ らない腎障害を起こしていたとは考えにくく，ま た標本作製時の人工的な産物とも考えられない． 従って有棘赤血球の出現はアルコール飲用による ことを示唆するものと思われた，この間，赤血球 膜の脂質組成は表3に示すようにアルコール摂取 群ではFC， PCは対照より高く，スフィンゴミエ リソ（SMと略）は逆に低値を示し， PC／SM比も 対照より高い傾向を示した．これらの変化はヒト のアルコール性肝硬変患者の赤血球膜脂質組成と 同一方向の変化であり13），ラットの場合もヒトと 同様の機作により赤血球の形態変化を起こしたも のであろう．ヒトではアルコール性肝障害が肝硬 変に進展すれぽ，病変は赤血球の形態変化にとど まらず，肝自体の病理組織学的変化，血清理化学 成分の変化など病変は多岐にわたる．今般の5％ アルコール投与ラットについての実験では，肝の 組織像は禰漫性の脂肪沈着を認めたにすぎず，ま たChoは有意差を示したが，肝TG含量は30週ア ルコール投与群で高値の傾向を示したにすぎな かった．血漿のTG， Cho濃度も対照とアルコール 飲用群で有意差の認め難かったことをあわせ考え るとき，これら両群の間で脂質代謝に関し差の判 然とし難かった原因の一つはカロリーの過剰投与 が考えられる．ラットのエネルギー必要量は雄で は53日齢で最大となり，1日84kcal，成熟期では 76kca1とされているのに対し，当初の実験ではア ルコール投与群，対照群とも1日200kcalを投与 しており，これが対照群においても脂肪沈着を認 める一因となったのであろう．因みに投与カロ リーを！日80kca1に制限した場合，体重，無重量 とも表乞のごとく両群で差がないにもかかわら ず，アルコール投与群では肝組織への脂肪沈着は 著しく，対照群との差は著明であった（写真。，d）． またアルコール濃度が1∼2％と低い場合，脂肪 肝は認め難かった． 以上高カロリー食を投与した場合，肝組織所見 や，血清酵素活性は対照群とアルコール投与群で 有意差を認め難かったにもかかわらず，アルコー ルの長期投与で赤血球の形態やその脂質構成は対 照との間に差が認められた．この事実は赤血球が

アルコールに対し，より感受性が高いために両群 の間に差を生じたとも考えられる．いずれにせよ 動物の飼育条件は結果に大きな影響を及ぼすが， 個体差によっても成績は左右される．ヒトで同じ ような飲酒歴でありながら肝硬変を起してくる人 とそうでない人があり，このような差の原因とし て免疫機能の差が問題になってきている．免疫異 常がアルコール性肝障害の成因として作用してい るか否か，未だ定説はないが，示唆に富んだ実験 結果が得られつつあり，今後の発展が待たれてい る14）15）．著者らも胸腺細胞についていささかの知 見を得ており，さらにこの分野での研究を続けて 行きたい． 結 語 5適齢の市販ウイスター系ラットに7ヵ月間 5％．アルコール含有液体食の投与を続けたとこ ろ，末梢血にヒトのアルコール性肝硬変時に見ら れるのと同様な有棘赤血球が多数出現した．赤血 球膜の脂質組成もヒトのアルコール性肝硬変患者 の赤血球膜脂質組成と同一方向の変化を示してお り，極めて長期間アルコールを大量投与すれぽ ラットもアルコール性肝硬変を起こす可能性のあ ることが示唆された． 稿を終えるにあたり終始御指導と御校閲を賜った 降矢 榮教授に心から御礼申上げます．また病理組織 学的検索に御配慮，御助言を頂いた第1病理学教室 豊田智里助教授に深謝致します． 文 献

1）Lieber CS：Metabolic Aspects of Alcoholism． pp1−29， MTP（1977）

2）荒牧琢己ほか：アルコールと肝疾患．拾療 65： 1009−1013，1983

3）Mezey E：Metabolic effects of alcoho1． Federation Proc 44：134−138，1985 4）石井裕正ほか：実験的アルコール性肝障害作成上 の2，3の問題点の検討．「アルコール代謝と肝 2」（高田 昭ほか編）pp1−11，医歯薬出版，東京 （1983） 5）柴田 進ほか：latroscanの赤血球膜脂質分析へ の応用．Clinical Laboratory 21：15−22，1980 6）大野公吉ほか：脂質．「医化学実験法講座，1B，生 体構成成分II」（山川民夫ほか編）， pp115−264，中 山書店，東京（1972） 7）松宮和人：中性脂質．「臨床化学分析III一糖およ び脂質，第2版」（丹羽正治ら編），pp92−106，東 京化学同人，東京（1981） 8）菅野剛史：コレステロールおよびコレステロール エステル．「臨床検査技術全書6，臨床化学検査II」 （石井 畦編），pp218−219，医学書院，東京（1980） 9）三輪史朗：ヘモグロビン．「臨床検査技術全書3， 血液検査」（小酒井望ほか編），pp42−53，医学書院， 東京（1979）

10）Bernt E， Gutmann I：Ethanol Dete㎜ination with Alcohol Dehydrogenase and NAD．∫η Bergmeyer， Hans Ulrich， Methods of En− zymatic Analysis．2nd ed， pp1499−1505， Academic Press，（1974）

11）北村元仕：トラソスアミナ一飛．「実践臨床化学増 補版」pp380−393，医歯薬出版，東京（1982） 12）長崎敏秀：レシチンコレステロールァシルトラン スフェラーゼ．検査と技術 8：1208−1213，1980 13）Furiya K et aL Molecular Sieving Property of the Human Erythrocyte Membrane in Alco−

holic Cirrhotic Patients． XII， World Congress

of Anatomic and Clinical Pathology

14）夏蝉 靖・藤沢 洌ほか：アルコールと免疫「ア ルコール代謝と肝4」（アルコール代謝と肝運営委 員会編）pp71−136，医歯薬出版，東京（1985） 15）池田隆明ほか：サプレッサーT細胞活性からみ たアルコール性肝障害の病態に関する研究「アル ヨール代謝と肝5」（アルコール代謝と肝研究会 編）pp189−198，東洋書店，東京（1986）