[総説]Dihydrobiopterin による内皮型一酸化窒素合成酵素機能障害: 沖縄地域学リポジトリ

全文

(1)Title. [総説]Dihydrobiopterin による内皮型一酸化窒素合成酵素機能障害. Author(s). 野口, 克彦; 濱舘, 直史; 松﨑, 俊博; 坂梨, まゆ子; 仲宗根, 淳子; 内田, 太郎; 新垣, 久美子; 久保田, 陽秋; 石内, 勝吾; 益崎, 裕章; 須加原, 一博; 大屋, 祐輔; 坂梨, 又郎; 筒井, 正人. Citation. Issue Date. URL. Rights. 琉球医学会誌 = Ryukyu Medical Journal, 32(1･2): 7-12. 2013. http://hdl.handle.net/20.500.12001/17582. 琉球医学会.

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(7) 野口克彦１), 濱舘直史１), 松俊博１), 坂梨まゆ子１), 仲宗根淳子１), 内田太郎１), 新垣久美子２), 久保田陽秋３), 石内勝吾４), 益崎裕章５), 須加原一博３), 大屋祐輔２), 坂梨又郎１), 筒井正人１) １). 琉球大学大学院医学研究科薬理学, ２)循環器・腎臓・神経内科学, 麻酔科学, ４)脳神経外科学, ５)内分泌代謝・血液・膠原病内科学. ３). (年２月日受付, 年４月９日受理).

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(187) . . . . 一酸化窒素 () は, 内皮由来血管弛緩因子としてだけでなく, 生体の恒常性維持や病態で大変重要な役割をもつことが知られているシグナル分子である. 内因性を産生する合成酵素は , 基質である . を, 中間体である

(188) . を経て, 酸化することによって . . とともにを生成する. 内皮型合成酵素 ( ) の構造と機能を示した模式図 ( ) にあるとおり, 合成酵素は, . . と . . からなるホモダイマーを形成しており, . . からの電子を . . のヘムに運ぶことによって . を活性化し, を生成する. この合成酵素の本来の機能である生成には, である .

(189) . . ( )の存在が必須である. ところが, 高脂血症・糖尿病・喫煙などの酸化ストレスを伴う心血管疾患や生活習慣では, が減少していることが報告されている１). そのような状態 ( 不足の状態) では, は . を酸化することができずに, 本来生成すべきの代わりに活性酸素であるスーパーオキサイドを産生してしまう２). つまりこのような状況下では合成酵素は, スーパーオキサイド産生酵素として機能することになる. これをの . と呼び, これら病態における血管内皮機能障害の重要な機序のひとつとされている ( ). すなわち, の不足は . を引き起こすと考えられている. 合成酵素の必須であるは, プテリジン骨格内の!, ", #, $位の箇所が水素化された構造を持っているが, が酸化されるとプテリジン骨格の!, "位の水素が取れ, #% $

(190) . . (&) となる ( &). 糖尿病・高血圧症などの心血管疾患では, の酸化型である

(191) . . (&).

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(197) . が増加することが観察されている３,４). しかし, これまで生体位における &の役割についてはほとんど調べられていない. そこで, 私たちは, &自体の作用について明らかにするため, 生合成経路 ( ') の ( 経路にあって &の前駆物質である . . . と, 細胞内で &からへの変換を行う

(198) . . ()*) の選択的阻害薬

(199) . . (+,-) を併用した. これにより, 生体内 &レベルを増加させ, このときの内皮機能への影響を調べ, さらに今回はその機序についての検討の結果を併せて紹介する.. "

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(211) 野口. . 克彦. . 実験には, 体重の雄性 .

(212) 系ラットを使用した. ( ), またはその溶媒である ( ) は ,.

(213) . ( ) の時間前に投与し,.

(214) . 投与後の影響を調べた. 溶媒のみを投与した !. !群, のみを投与した単独群 , と.

(215) . をともに投与した併用群の群で検討した. なお, 本研究の動物実験計画は, 琉球大学動物実験委員会の承認を得ており, ｢動物実験の適正な実施に向けたガイドライン｣に準じて実施された. ［測定］摘出した胸部大動脈の組織中含量を, "##. $

(216) % & '! (()*)５) の方法に準じ + を用いて測定した. 量は, 酸性条件下でのヨウ素酸化反応による , ! . 量 ( !

(217) , ! . - . . , ! . ) とアルカリ条件下でのヨウ素酸化反応による , ! . 量 (., ! . ) との差から算出した. なお, 生体中の , ! . 量は, 無視できるほど微量であることからアルカリ条件下での値を量とした６). ［血行動態の測定］ラットをペントバルビタール麻酔後, 大動脈圧 () を頸動脈に挿入したカテーテルを介して圧トランスデューサにより, 大腿動脈血流量 ("") を超音波血流計によりそれぞれ測定した. 大腿部血管抵抗は次式により算出した： ("/0 -

(218) "").

(219) . 投与後分以降に, 内皮依存性血管拡張薬である

(220) 1 . 2 1 $!. (3 $)と内皮非依存性血管拡張薬 (&4放出薬) である. !5 # . ! #. 5の静注による降圧反応と末梢血管抵抗の反応を調べた. ［摘出大動脈実験］エーテル麻酔下に摘出した大動脈からリング標本を作製し, 6 ,. . . 液 (℃, )7 4.7 4) 中に懸垂した後, 等尺性張力変化を記録した. $ 2 $. ((8 ) による拘縮に対する 3 $ (() ∼( ) , あるいは. !5 # ( . ! #. 5(( ∼( ) の弛緩反応を調べた. ［スーパーオキサイド産生の測定］胸部大動脈リング標本をμ #1. を含んだ 6 ,. 99 液中におき, 誘発された化学発光を, # !. . ( +#

(221) +)8)により測定した. ［ウエスタンブロッティング］液体窒素で凍結した胸部大動脈をガラスホモジナイザーでホモジナイズし, 遠心後上清 (μ ! . ) を分析に使用した. 一次抗体は, 次のものを使用した. &4 (:

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(238) ). ［統計］用量反応データは, 反復測定分散分析で行い, 多群間の比較は一元配置分散分析と :#. の !. . . ほか. $!1 . で行った. 対応のない群の比較は, #

(239) . 5 #5 <. . . で行った. 統計学的有意さの水準は, = とした. すべてのデータは, 平均値±9で表した.. . . 大動脈中の , の含量を + 法で測定し各群で比較したところ (" ), .

(240) . 併用群では, 含量の変化を伴わずに, の含量は, 対照群の* 倍の著明な増加を示した (= (). しかし, 含量には, 各群間で有意の差は認められなかった. 比は, .

(241) . 併用群で著明に低下し (= (), 単独群でも有意の減少が認められた (= (). 各群のベースラインの血圧は, .

(242) . 併用群でのみ, 対照群に比べ軽度ながら有意の血圧上昇が認められた. また, 血圧は, 含量が増加すればするほど上昇することを示していたが, 含量と血圧との間には, 有意の相関はみられなかった. 内皮依存性血管拡張薬の 3 $による降圧反応と血管拡張反応は, 単独群では有意の影響はみられなかったが , .

(243) . 併用群では , 有意の減弱 (= ) が認められ, 内皮機能障害を生じていることを示した (" ). 一方, 内皮非依存性血管拡張薬の . ! #. 5による反応にはどちらの群にも有意の影響はみられなかったことから, &4による血管拡張能自体には差がないと考えられた. さらに, 摘出大動脈標本を用いた検討でも, !での結果と同様に, 併用群で 3 $による血管弛緩反応に有意の選択的減弱 (= ) がみられたが, . ! #. 5による血管弛緩反応には有意の影響はみられなかった (" 8). これらの結果から, 血管内の増加は, 内皮機能障害を引き起こすことが示唆された..

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(279) . つぎに, #$%の増加がどのようにしての !. "を引き起こすのかを調べるため, の活性調節に影響するリン酸化状態をウエスタンブロッティング法で検討した (& "'). の活性亢進を引き起こすのリン酸化部位である

(280) ((''のリン酸化は, 併用群で抑制傾向がみられ, 逆に活性を抑制するリン酸化部位の

(281) )*のリン酸化は増加傾向 )*) は併用がみられ, これらの比 ( ((''+ 群で対照群に比べ有意の減少を示した ( ). このことから, #$%によるの活性障害の機序として, リン酸化状態の変化が関与する可能性が示唆された.. .

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(296). 併用群でみられたによる摘出大動脈標本での血管弛緩反応の減弱は, スーパーオキサイド消去剤の

(297) . 処置により有意に改善され ( ), .

(298). 処置による内皮機能障害にスーパーオキサイドが関与することが示唆された. そこで, 大動脈内スーパーオキサイド産生量を化学発光法で測定したところ, 併用群では, コントロール群に比べ有意のスーパーオキサイド産生亢進が認められた ( ). このスーパーオキサイド産生は, 合成酵素阻害薬ので抑制されたことから, 由来であること, すなわち .

(299). 併用群のは !. "状態であることが示唆された.. . 今回の研究で私達は, の必須 ,.

(300) である #$)生合成の . ! - "経路 (& ". ) において細胞内で #$%を経て #$)を生成する .

(301). , および /

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(303) . (0$&1) の選択的阻害薬 .

(304) . () を併用することによって, 細胞内 #$)の変化を伴わずに #$%のみを増加させることに成功した. その結果, 短期間の細胞内 #$%増加それ自体で #$)レベルと無関係に, おそらくの !. "を介して内皮機能不全が引き起こされることを - -で見出した. 従来, !. "は, #$)が不足したときに生じると考えられてきた. しかし, 今回私たちは, #$%の増加が起こると, #$)の不足がなくても, !. "が起こる可能性のあることを示した. このことは, !. "の, すなわち活性調節の, 新たな機序を示唆するものである. 本研究と同様に, これまでの酸化ストレスが関与するとされている種々の病態モデル, 例えば高フラクトース食負荷による%型糖尿病モデルラット３), 自然発症肥満%.

(305) 野口. 克彦. 型糖尿病モデルであるマウス７), 食塩感受性高血圧ラット８), ヒツジの肺高血圧モデル９), 肥満型糖尿病モデルラットである

(306)

(307) ラット)で, 血管内含量の増加とスーパーオキサイド産生亢進が報告されている. 従来, これら病態でみられた血管内皮細胞機能障害の機序として, の相対的不足, すなわち比の減少による

(308) のためと説明されてきた. しかし, 著者らの以前の研究 )で, 機能障害と比の減少とは必ずしも関連せず, むしろ血管内含量の増加と関連することを示した. また, 今回の実験でも, !"#単独群で比の明らかな減少にも関わらず機能には全く影響がみられなかった. このことは, これら病態でも血管内皮細胞機能不全の原因にの増加自体が関与する可能性を示唆するものである. 著者らは, 今回の研究で, 内因性のを増加させるために $の選択的阻害薬 !"#を使用して生合成経路の % &経路を抑制したが, $活性や発現量の減少がアンギオテンシン負荷')や心臓の虚血再灌流時)に起こることが報告されている. このような状況に, を増加させるような酸化ストレスが加われば, 今回の実験と同様な状態が起こりうることを示唆している. 最近, % &経路, とくに $の活性が機能障害の決定因子として重要であることがいくつかの & の実験で指摘されている'()). 本研究では, !"#単独群では, 含量と内皮機能に影響がみられなかったことから, 少なくとも今回用いた投与量の !"# を投与された健常ラットでは, 機能調節における % &経路の役割は大きくないと思われた. しかし, 糖尿病や高血圧, 動脈硬化などの病態では, $の寄与が増大することが予想される. 今後, !"# 活性の阻害やの増加による短期的な影響だけでなく, これら病態の動物モデルを用いて長期間にわたる影響を明らかにすることが必要かもしれない. 今回の検討で, 血管内含量の増加はのリン酸化状態に有意の影響を与えることが明らかとなった. 同様に, 細胞内含量の増加がの )の脱リン酸化を引き起こし, による産生抑制と活性酸素生成を生じるという観察が, 培養血管内皮細胞で報告されている)). しかし, どのような分子機構でがリン酸化に影響するのかについては不明である. したがって, リン酸化に影響することが知られている分子種 (ホスファチジルイノシトール'* キナーゼ+ , プロテインキナーゼ ,, プロテインキナーゼ +, +!-活性化キナーゼ, カルモジュリンキナーゼⅡ など) の発現状態について今後調べることが必要と思われる. さらに, 活性調節の分子機序は, 転写調節と転写後調節に分けられるが, 転写後調節に関わる要素だけでも, の細胞内局在 , 細胞内 , ＋ *

(309) . 結合, * ニトロシル化,

(310) & * ・. . ほか. . ・分子シャペロンであるヒートショックプロテイン % /・0たんぱく質共役受容体等の % %

(311) * などがリン酸化以外にも知られており多岐にわたる. の活性調節における詳細な役割を明らかにするためには, これら要素に対する検討も今後の課題と考えられる.. . . 本研究の結果から, の血管内含量の増加は, それ自体で, & &における機能障害を引き起こすこと. そして, その機序として, おそらくの

(312) の関与が示唆された1).. . . 本研究は, 2-科研費 (/' の助成を受けたものである.. . . １) % . 34 !5 "4 67

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