岡 山 医 誌 (1994) 106, 1073∼1084
ラ ッ トに お け るハ ロ タ ン肝 障 害 に及 ぼ す亜 鉛 の 影 響
岡 山大 学 医 学部 麻 酔 ・蘇生 学 教室(指 導:平 川方 久教 授)
日
高
秀
邦
(平 成6年6月29日 受 稿) Key words:ハ ロ タ ン,肝 障 害,亜 鉛,チ ト ク ロ ー ムP-450,メ タ ロ チ オ ネ イ ン 緒 言 ハ ロ タ ン麻 酔 後 に 生 ず る 肝 障 害 は,数 多 く報 告 さ れ て い る1)が,広 汎 な 肝 壊 死 を特 徴 とす る い わ ゆ るハ ロ タ ン肝 炎 の 発 生 頻 度 は ハ ロ タ ン を 使 用 した 麻 酔6,000∼20,000例 に1例2) 3)と低 く,ま た,周 術 期 に は 種 々 の 要 因 に よ っ て 肝 障 害 が 生 じ る た め,ハ ロ タ ン 肝 炎 の 診 断 は 困 難 で,そ の 研 究 も 困 難 な も の とな っ て い る.肝 障 害 の 原 因 は,ハ ロ タ ン の 直 接 的 な 肝 毒 性,肝 血 流 低 下 に よ る肝 細 胞 のhypoxia4) 5),肝 細 胞 毒 性 の あ る ハ ロ タ ン の 中 間 代 謝 産 物6) 7),あ る い は ハ ロ タ ン や ハ ロ タ ン の 代 謝 産 物 に 対 す る過 敏 性 反 応 の 関 与8) 9)が示 唆 さ れ て い る が,未 だ 明 らか で は な い. 一 方,ラ ッ トを 用 い た 実 験 で,雄 性 の ラ ッ ト に,フ ェ ノバ ル ビ ター ル(phenobarbital:以 下 PBと 略)に よ る酵 素 誘 導 の 後,低 酸 素 化 に ハ ロ タ ン投 与 を 行 う と,広 範 な 肝 壊 死 が 生 じ る こ と が 明 ら か と な り10),その後 さ らに ハ ロ タ ン投 与 前 に絶 食 とす る と肝 壊 死 が増 加 す る こ とが 示 され11), 以 後 こ れ ら 一 連 の 処 置 に よ っ て 肝 障 害 を起 こ す ラ ッ トモ デ ル が,ハ ロ タ ン肝 炎 の 研 究 に 用 い ら れ て い る.こ の ラ ッ ト低 酸 素 ハ ロ タ ン 肝 障 害 モ デ ル に お け る肝 障 害 の 原 因 は, PB投 与 に よ り肝 内 に 誘 導 さ れ る 薬 物 代 謝 酵 素 で あ る ミ ク ロ ゾー ム 中 チ トク ロ ー ムP-450(以 下P-450と 略)の 還 元 的 状 態 での ハ ロ タ ン との 相 互 作 用12) 13) 14)やハ ロ タ ン の 還 元 的 代 謝 で 生 じ る フ リー ラ ジ カ ル を 含 む 中 間 代 謝 産 物 の毒 性6) 7)が考 え られ て い る. 亜 鉛 は,必 須 微 量 元 素 の 一 つ で あ り,成 長 ・ 発 達 な ど に 関 わ っ て い る.ま た,多 くの 亜 鉛 酵 素 の機 能 に 重 要 な役 割 を果 た してお り15),さらに, 最 近 で は,亜 鉛 の ミ ク ロ ゾ ー ム,ミ ト コ ン ド リ ア,ラ イ ソ ゾ ー ム 等 の 生 体 膜 に 対 す る安 定 化 作 用15) 16),脂質 過 酸 化 の 抑 制 作 用17)等の 生 体 防 御 に 関 す る作 用 が 報 告 され て い る. 亜 鉛 を ラ ッ トに 投 与 す る と,肝 に ヘ ム オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 誘 導 され る18).ヘム オ キ シ ゲナ ー ゼ は, ヘ ム代 謝 に 必 須 の 酵 素 で,ヘ ム の 酸 化 的 分 解 を 触 媒 す る19).す な わ ち,亜 鉛 は,肝 に へ ム オ キ シ ゲ ナ ー ゼ を誘 導 し,肝 ミ ク ロ ゾ ー ム 中 の ヘ ム 酵 素 で あ る チ ト ク ロー ムP-450量 を 減 少 させ,ミ ク ロ ゾ ー ム で の 薬 物 の 代 謝 を 抑 制 す る 可 能 性 が あ る18). ま た,亜 鉛 を 動 物 に 投 与 す る と,亜 鉛 結 合 タ ン パ ク で あ る メ タ ロ チ オ ネ イ ン(以 下MTと 略) が 肝 に 誘 導 され る20). MTは,特 異 な ア ミ ノ酸 組 成 を有 し,約60個 の ア ミ ノ酸 残 基 の う ち 約1/ 3の20個 が シ ス テ イ ン で あ り,重 金 属 に 高 い 親 和 性 を示 し,通 常1分 子 あ た り6∼7原 子 の 金 属 とSH基 を介 し て 結 合 して い る20). MTは, 従 来 よ り必 須 微 量 金 属 の ホ メ オ ス タ ー シ ス21),重 金 属 の 解 毒22)に関 わ っ て い る と さ れ て き た が,最 近,フ リー ラ ジ カ ル ス カベ ン ジ ャ ー と して の 機 能 を有 す る こ と も報 告 さ れ て い る23) 24) 25). 以 上 よ り,本 研 究 で は,亜 鉛 前 投 与 が ラ ッ ト 低 酸 素 ハ ロ タ ン 肝 障 害 に 及 ぼ す 影 響 を血 液 生 化 学 的 お よ び 組 織 学 的 に 調 べ,さ ら に,そ の 機 序 を 明 らか に す る た め,肝 障 害 の 程 度 と肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 お よ び 肝MT量 の 変 化 との 関 連 に つ い て 検 討 し た の で 報 告 す る. 1073材 料 と 方 法 1.実 験 動 物 Wistar系7週 齢 雄 性 ラ ッ ト(体 重 約200g) は,日 本 ク レ ア社 よ り購 入 し,室 温 は28℃ に 設 定 し,照 明(蛍 光 灯80W,照 明 時 間7:00∼19: 00)の 飼 育 室 で,固 形 飼 料(オ リエ ン タ ル 酵 母 社)お よ び,水 道 水 を 自 由 に 与 え,約1週 間 の 飼 育 の 後 に実 験 に 供 し た. 2.試 薬 お よ び 実 験 装 置 超 遠 心 分 離 機 は,日 立 工 機(東 京)製 のSCP -70HにRP-70T型 ロー ター を付 して 使 用 した. 高 速 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィー(以 下HPLCと 略) は, Pharmacia LKB Biotechnology製(Upp sala, Sweden)HPLCコ ン トロ ー ラー(2152 LC Controller), HPLCポ ン プ(2150 HPLC Pump),お よびRheodyne製(California, USA)
200μlサ ン プ ル ロ ー ドルー プ 付 サ ン プ ル イ ン ジ ェ ク ター(Model7125)に て 構 成 し て 使 用 した.ク ロ マ トグ ラ フ ィー カ ラ ム は,東 ソ ー(東 京)製 陰 イ オ ン 交 換 樹 脂 カ ラ ムTSKgel DEAE-5 PW; 7.5cm×7.5mmを 用 い た.原 子 吸 光 分 光 光 度 計(以 下AASと 略)は,島 津 製 作 所(京 都) 製AA-640-12型 を用 い,ピ ー ク面 積 に よ る 亜 鉛 濃 度 の 計 算 に は,島 津 製 作 所 製 ク ロ マ トパ ッ ク (C-R1 B型)を 用 い た.分 光 光 度 計 は,日 本 分 光(東 京)製 のUbest-55型 を使 用 した. Sephadex G-50お よ びDEAE-Sephadex A-25は, Phar
macia Fine Chemicals(Uppsala, Sweden)よ り購 入 した.ハ ロ タ ン 専 用 気 化 器 は, Cyprane
(Keighley, Yorkshire, England)製Fluotec 3を 使 用 し た. ハ ロ タ ン は ,武 田薬 品(東 京)よ り購 入 した. 硫 酸 亜 鉛(試 薬 特 級)は,片 山 化 学 工 業(大 阪) 製 を,塩 酸(試 薬 特 級),ジ チ オ ス レ イ トー ル(以 下DTTと 略)お よ び ト リス ア ミ ノ メ タ ン(以 下Trisと 略)は,ナ カ ラ イ テ ス ク(京 都)製 を 使 用 し た.フ ェ ノバ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム(以 下PBと 略),ビ ウ レ ッ ト液,エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸 塩(以 下EDTAと 略)お よ び 原 子 吸 光 分 析 用 亜 鉛 標 準 液 は,和 光 純 薬(大 阪)製 を, フ ッ化 フ ェ ニ ル メ チ ル ス ル フ ォニ ル(以 下PMSF と略)は, Sigma(USA, St. Louis)製 を,そ れ そ れ 使 用 し た. 3.方 法 ラ ッ トを 以 下 の5群 に 分 け 実 験 を行 っ た. 正 常 群:無 処 置 の 正 常 群. 対 照 群: 0.1%フ ェ ノ バ ル ビ ター ル ナ ト リウ ム 水(以 下PB水 と略)を5日 間 自 由 飲 水 させ, 1mlの 生 理 食 塩 水 を筋 注 し た 後, 24時 間 の 絶 食 を行 っ た 群. Zn 5mg/kg体 重(以 下mg/kgと 略)投 与 群, Zn 10mg/kg投 与 群, Zn 20mg/kg投 与 群(以 下,そ れ ぞ れZ5群, Z10群, Z20群 と略):対 照 群 と 同 様 にPB水 を5日 間 自 由 飲 水 させ, ZnSO4 を生 理 食 塩 水1mlに 溶 解 し,そ れ ぞ れ 亜 鉛 量 と し て5mg/kg, 10mg/kg, 20mg/kgと な る よ うに 筋 注 し た 後, 24時 間 の 絶 食 を行 っ た群. 対 照 群, Z5群, Z10群 お よ びZ20群 の ラ ッ トは, 24時 間 の 絶 食 の 後 に, McLainら10)お よ びJeeら26)の 方 法 に 準 じ,酸 素 濃 度14%下 に1.0 %の ハ ロ タ ン を2時 間 吸 入 投 与 し た.そ れ ぞ れ の群 の ラ ッ トは,図1に 示 す よ う に,ハ ロ タ ン 投 与 の 直 前(亜 鉛 投 与24時 間 後),直 後 そ して 投 与 終 了24時 間 後 に 犠 死 せ しめ,血 清GPT値, MTの 主 要 な 二 つ の ア イ ソフ ォー ム で あ る肝MT -1とMT-2量 お よ び 肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 の 測 定 を行 っ た.ま た,ハ ロ タ ン投 与 終 了24時 間 後 に,肝 障 害 を組 織 所 見 か ら 評 価 し た.方 法 の 詳 細 は 以 下 に 述 べ る. (1)ハ ロ タ ン お よ び 酸 素 の 投 与 対 照 群, Z5群, Z10群 お よ びZ20群 の ラ ッ トは,絶 食 後, 35cm×25cm×10cmの プ ラ ス チ ッ ク容 器 に 各 群 よ り1匹 ず つ 計4匹 入 れ た.空 気 61/分,窒 素31/分 の 流 量 で ガ ス を 流 し酸 素 濃 度 を14%と し,ハ ロ タ ン 専 用 気 化 器 で1.0%の ハ ロ タ ン を 自発 呼 吸 下 で2時 間 吸 入 投 与 し た.な お, プ ラ ス チ ッ ク容 器 は 下 面 を37℃ の 恒 温 水 槽 に 浸 し保 温 し た. (2)肝 サ イ トゾ ル お よ び 肝 ミ ク ロ ゾ ー ム の 調 整 ラ ッ トは,ケ タ ミン 筋 注 麻 酔(120mg/kg)下 に 開 腹 し,腹 部 大 動 脈 よ り血 液 を 採 取 し た.そ の 後,直 ち に1mM EDTAを 含 む 氷 冷 生 理 食 塩 水 で の 潅 流 ・脱 血 の 後,肝 を 摘 出 し た.な お, ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後 の ラ ッ トは,血 液 採 取 の 後,肝 右 側 二 葉 を 組 織 標 本 に 供 す る た め,
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そ の 根 元 を結 紮 し た 後 に 上 記 の 潅 流.脱 血 を 行 っ た.摘 出 した 肝 は,湿 重 量 の2倍 容 の1mM DTT, 1mM PMSFを 含 む10mM Tris-HCI緩 衝 液(pH7.4)を 加 え,氷 冷 下 にPotter-Elvehjem 型 ホ モ ジ ナ イ ザ ー を 用 い て 肝 ホ モ ジ ネ ー トを 調 整 し た.こ の ホ モ ジ ネ ー トは, 4℃ で12,000× g, 30分 間 遠 心 分 離 し,そ の 上 清 を さ ら に4℃ で100,000×g, 60分 間 遠 心 分 離 し,得 ら れ た上 清 を細 胞 質 可 溶 性 分 画(サ イ トゾ ル 分 画)と し た.ま た サ イ トゾ ル 分 画 を採 取 し た 後 の 沈 殿 は, 1.15% KCl溶 液 に 懸 濁 し,再 び4℃ で100,000× g, 60分 間 遠 心 分 離 し,得 られ た 沈 殿 を30%グ リセ ロ ー ル を含 む0.1Mリ ン 酸 緩 衝 液(pH7.4) に 懸 濁 し ミ ク ロ ゾ ー ム 分 画 と した.調 整 し た両 分 画 は,測 定 ま で-80℃ に 保 存 し た. (3)血 清GPT値 の 測 定 血 清GPT値 の 測 定 は,デ ュ ポ ン 製 自動 臨 床 化 学 分 析 装 置ACA-SX型 を使 用 し,必 要 に 応 じて 血 清 を 蒸 留 水 で10倍 希 釈 し て 測 定 し た.な お,血 清 は,採 血 し た 血 液 を60分 間 静 置 し,そ の 後, 2,000×gに て10分 間 の 遠 心 分 離 を行 い, そ の 上 清 を使 用 した. (4)サ イ トゾ ル 分 画 お よ び ミ ク ロ ゾー ム 分 画 の タ ンパ ク 濃 度 測 定 各 分 画 の タ ン パ ク濃 度 の 測 定 は,ビ ウ レ ッ ト 法 を 用 い た.検 量 線 の 標 準 タ ンパ ク は 牛 胎 児 血 清 ア ル ブ ミ ン を 用 い た. (5)肝 ミ ク ロ ゾ ー ムp-450量 の 測 定 肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 は, OmuraとSato27) の 方 法 に 従 っ て 測 定 し,ミ ク ロ ゾ ー ム タ ンパ ク 1mg当 た りの 量 と して 算 出 し た. (6)肝MT-1量, MT-2量 の 測 定 肝MT-1量, MT-2量 の 測 定 は, Lehmanと Klassenの 方 法28)に準 じ てHPLCとAASを 組 み 合 わ せ て 以 下 の よ う に 行 っ た. サ イ トゾ ル分 画 は, 100℃ で1分 間 熱 処 理 した 後 氷 冷 し, 4℃ で15,000×g, 5分 間 遠 心 分 離 し た 上 清 を濾 過 してHPLC用 試 料 と し た. HPLC用 試 料200μlは, DEAE-5PWカ ラ ム を組 み 込 ん だHPLC装 置 に 添 加 し,移 動 相A: 10mM Tris-HCl(pH7.4), B: 200mM Tris-HCl(pH7.4)で,直 線 勾 配0-40% B/12分, 流 速1ml/分 に て, MT-1とMT-2に 分 離 し て 溶 出 した.溶 出 液 の 亜 鉛 濃 度 は, HPLC装 置 に 直 接 連 結 され たAASに よ り測 定(波 長213.9nm) し た. MT濃 度 は,亜 鉛 濃 度 と し て 表 し,サ イ トゾ ル タ ンパ ク1mg当 た りの 量 と し て 算 出 した. MTの 標 準 品 は,精 製 したMT-2を 亜 鉛 濃 度 と し て4μg/mlに 調 整 し た も の を 用 い た.な お, 標 準 品 と したMT-2は,ラ ッ トに 亜 鉛15mg/kg を筋 注 し, 18時 間 後 に 摘 出 した 肝 よ り得 た サ イ トゾ ル 分 画 を, Vasakら の 方 法29)に 準 じ て, Sephadex G-50お よ びDEAE-Sephadex A-25を用 い,分 離 ・精 製 した.
図1 実 験 方法
P-450量:肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 肝MT量:肝MT-1, MT-2量
(7)組 織 標 本 作 製 肝 の 組 織 標 本 は,ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後 の ラ ッ ト よ り作 製 し た.結 紮 切 離 し た 肝 の 右 側 二 葉 は15%中 性 緩 衝 ホ ル マ リン 浸 漬 固 定 を行 っ た.固 定 さ れ た組 織 標 本 は,十 分 な水 洗 の 後, ア ル コー ル 系 列 に よ る脱 水,パ ラ フ ィ ン 包 埋 し, 5μmの 厚 さ に 薄 切 し た.常 法 に よ りヘ マ トキ シ リ ン ・エ オ ジ ン 染 色 を行 い,光 学 顕 微 鏡 に よ り 検 鏡 し た. (8)統 計 処 理 各 群 で の 吸 入 前 後 の 血 清GPT値,肝MT-1量,肝MT-2量,肝 ミク ロ ゾ ー ムP-450量 の 比 較 は,等 分 散 検 定 を 行 っ た 後, Student's t-testあ る い はWelchの 変 法 を 用 い て 行 っ た. 図2 血 清GPTの 変化 正 常群:無 処 置群 対 照群: PB酵 素 誘 導,生 理 食 塩 水 投 与 群 Z5群: PB酵 素 誘 導,亜 鉛5mg/kg投 与 群 Z10群: PB酵 素 誘 導,亜 鉛10mg/kg投 与 群 Z20群: PB酵 素 誘 導,亜 鉛20mg/kg投 与 群 a: p<0 .01で 有 意 差 あ り b: p<0.05で 有 意 差 あ り
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対 照 群, Z5群, Z10群 お よ びZ20群 の4群 間 の 血 清GPT値,肝 ミ ク ロ ゾー ムP-450量 の 比 較 は 一 元 配 置 分 散 分 析 を行 っ た 後,各 群 間 の 比 較 をScheffe's F-testを 用 い て 行 っ た.な お 肝 細 胞 逸 脱 酵 素 で あ る血 清GPT値 は,常 用 対 数 を と り統 計 処 理 を行 っ た. 結 果 1.血 清GPT値 の 変 化 図2に 示 す よ う に,ハ ロ タ ン投 与 直 前,す な わ ち亜 鉛 投 与24時 間 後 の 血 清GPT値 は,対 照 群, Z5群, Z10群, Z20群 で,そ れ ぞ れ,中 央 値 が24, 46, 52, 77(IU/L)と な っ た. Z5 群, Z10群 お よ びZ20群 は,対 照 群 に 比 し て, 有 意 に 高 値 を 示 し た.ま た, Z20群 は, Z5群 とZ10群 に 比 して も有 意 に 高 値 を示 し た. ハ ロ タ ン投 与 終 了 直 後 の 血 清GPT値 は ,対 照 群, Z5群, Z10群, Z20群 で,そ れ ぞ れ, 中 央 値 が38, 71.5, 84, 98.5(IU/L)と な っ た. ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後 の 血 清GPT値 は, 対 照 群, Z5群, Z10群 お よ びZ20群 で,そ れ ぞ れ,中 央 値 が899, 1160, 241, 189(IU/L)と な っ た.対 照 群, Z5群 で は,著 名 な 血 清GPT 値 の 上 昇 が 認 め ら れ た が, Z10群, Z20群 は, 対 照 群, Z5群 に 比 して 有 意 に 低 い値 を 示 し た. 2.ハ ロ タ ン投 与 終 了24時 間 後 の 肝 組 織 像 写 真1のA, B, Cお よ びDは,そ れ ぞ れ, 対 照 群, Z5群, Z10群 お よ びZ20群 の ハ ロ タ ン投 与 終 了24時 間 後 の 肝 組 織 像 で あ る.対 照 群 (写 真1A)とZ5群(写 真1B)で は,中 心 写真1 ハ ロ タ ン投 与 終 了24時 間 後 の 肝組 織 所 見 A,対 照 群:門 脈 周 辺 か ら中 間帯 に至 る肝 細 胞 の 空 胞変 性 が 認め られ,中 心 静 脈 周 辺 に は広 範 な壊 死 が 認 め られ た.壊 死 領 域 と空 胞 変 性領 域 の 間 に は,空 胞変 性 もな く核 も保 たれ た肝 細 胞 の あ る領 域 が 帯 状 に 認 め られ た.(×40) B, Z5群:ほ ぼ,対 照 群 と同様 の所 見 で あ っ た.(×40) C, Z10群:小 葉 中心 領 域 に は,壊 死 に 陥 っ た肝 細 胞 が 散 見 され,門 脈 周 辺 の 空 胞 変 性 を起 こ した領 域 が 対 照群, Z5群 に 比べ,拡 大 した傾 向が み られ た.(×40) D, Z20群:ほ ぼ, Z10群 と同様 の所 見 で あ っ た.(×40)静 脈 周辺 に 広範 な壊死 が 認 め られ,門 脈 周辺 か
ら中間帯 に は肝 細 胞 の空 胞変 性領 域 が 認 め られ
た.対 照 群 とZ5群
ともに,中 心静 脈 周辺 の壊
死 領域 と門脈周 辺 の 空胞 変性 領域 の間 に は,空
胞 変性 もな く核 も保 たれ た帯 状 の領 域 が認 め ら
れ た. Z10群(写
真1C),
Z20群(写
真1D)
では,中 心静 脈 周 辺 に,壊 死 に 陥 っ た肝細 胞 が
散 見 され た が,対 照 群, Z5群
にみ られ た広範
な壊死 領域 は認 め られ なか った. Z10群, Z20
群 で は,門 脈 周 辺 の空 胞変 性領 域 は,対 照群,
Z5群
に 比べ,拡 大 した傾 向 が み られ た.
3.肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 の 変 化 ハ ロ タ ン 投 与 直 前 の 肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 は,図3に 示 す よ うに,正 常 群,対 照 群 で そ れ ぞ れ,平 均 値 は0.98, 2.67(nmol/mg protein) と な り,対 照 群 の 肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 は, PB投 与 と24時 間 の 絶 食 に よ っ て,正 常 群 に 比 し て 約2.7倍 に 増 加 し た. Z5群, Z10群, Z20群 で は,そ れ ぞ れ,平 均 値 は2.51, 2.43, 2.24(nmol/ mg protein)と な っ た. Z5群, Z10群 お よ びZ 20群 は,対 照 群 に 比 し て,ま た, Z20群 は, Z 5群, Z10群 に 比 して も有 意 に 低 値 を 示 し, PB 図3 肝 ミ クロ ゾー ムP-450量 の変 化 正 常 群:無 処 置 群 対 照 群: PB酵 素 誘 導,生 理 食塩 水 投 与 群 Z5群: PB酵 素 誘 導,亜 鉛5mg/kg投 与群 Z10群: PB酵 素 誘 導,亜 鉛10mg/kg投 与群 Z20群: PB酵 素 誘 導,亜 鉛20mg/kg投 与 群 *:ハ ロ タ ン投 与 直 前 の 値 に 比 してp<0.001で 有 意差 あ り a: p<0.01で 有 意 差 あ り b: p<0.05で 有 意 差 あ りハ ロ タン肝 障害 に 及ぼ す亜 鉛 の影 響
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に よ っ て 誘 導 さ れ た 肝 ミク ロ ゾー ムP-450量 は, 亜 鉛 投 与 量 依 存 的 に 減 少 し た. ハ ロ タ ン投 与 終 了 直 後 の 肝 ミク ロ ゾー ムP-450 量 は,対 照 群, Z5群, Z10群, Z20群 で,そ れ ぞ れ,平 均 値 は1.51, 1.29, 1.43, 1.33(nmol/ mg protein)と な っ た.ハ ロ タ ン 投 与 直 前 の 肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 に 比 し て,全 て の 群 で 有 意 に 低 値 を示 し た. ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後 の 肝 ミ ク ロ ゾ ー ム P-450量 は,対 照 群, Z5群, Z10群, Z20群 で, そ れ ぞれ,平 均 値 は1.24, 1.13, 1.16, 1.16(nmol/ mg protein)と な り,ほ ぼ 正 常 群 の 値 に まで 低 下 図4 肝MT-1, MT-2量 の 変化 前:ハ ロ タ ン投 与 直前(亜 鉛 投 与24時 間 後) 後:ハ ロ タン 投 与終 了 時 24:ハ ロ タン 投 与終 了24時 間後 Z5群: PB酵 素 誘 導,亜 鉛5mg/kg投 与群 Z10群: PB酵 素 誘 導,亜 鉛10mg/kg投 与群 Z20群: PB酵 素 誘 導,亜 鉛20mg/kg投 与群 a:ハ ロ タン投 与終 了時 の値 に対 し て p<0.01で 有 意 差 あ り b:ハ ロ タ ン投 与 終 了時 の値 に対 して p<0.05で 有 意 差 あ り. 各群 と もハ ロ タ ン投 与 終 了時 の肝MT-1, MT-2の 量 は,ハ ロ タ ン投 与 直 前 の値 に 比べ 有 意 な変 化 は な か っ た.ハ ロ タ ン投 与 終 了24時 間 後 で は,ハ ロ タ ン投 与 終 了 時 に 比 べ てMT-1で 約50%, MT-2で 約70%に 有 意 に減 少 して い た.し た.各 群 間 に,有 意 な差 は み ら れ な か っ た. 4.肝 サ イ トゾ ル 中 のMT-1お よ びMT-2 量 の 変 化 肝 サ イ トゾ ル 中 のMT-1量 は,図4に 示 す よ うに,亜 鉛 投 与24時 間 後 に, Z5群, Z10群, Z20群 で,そ れ ぞ れ,平 均 値 は123, 174, 243(ngZn/mg protein)と 亜 鉛 投 与 量 依 存 的 に 増 加 し た.同 様 にMT-2量 も,そ れ ぞ れ,平 均 値 は222, 274, 370(ngZn/mg protein)と 亜 鉛 投 与 量 依 存 的 に 増 加 した.ハ ロ タ ン 投 与 終 了 直 後 のMT-1量, MT-2量 を投 与 直 前 の 値 と比 較 す る と,ど の 群 に お い て も,有 意 な 差 が 見 ら れ な か っ た.ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後 のMT 量 は,ハ ロ タ ン投 与 終 了 直 後 比 べ,ど の群 に お い て もMT-1で 約50%, MT-2で 約70%に 有 意 に 減 少 し た. 考 察 ラ ッ ト低 酸 素 ハ ロ タ ン 肝 障 害 を 作 成 す る た め に, McLainら10)お よ びJeeら26)の 方 法 に 準 じ て 酸 素 濃 度14%下 で1.0%ハ ロ タ ンを 吸 入 投 与 し た.ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後 に 著 し い 血 清 GPT値 の 上 昇 が 認 め ら れ(図2),肝 組 織 所 見 で も広 範 な 小 葉 中 心 性 の壊 死 が 認 め られ(写 真 1A),こ の 条 件 で 肝 障 害 が 生 ず る こ とが 確 認 さ れ た. こ の ラ ッ ト低 酸 素 ハ ロ タ ン 肝 障 害 に 対 し て, 5mg/kgの 亜 鉛 前 投 与 は,ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後 の 血 清GPT値 の 上 昇 を 抑 制 しな か っ た が, 10mg/kg, 20mg/kgの 亜 鉛 前 投 与 は,血 清GPT値 の 上 昇 を 有 意 に 抑 制 し た(図2).ま た 肝 組 織 像 で は,対 照 群(写 真1A)とZ5群(写 真1B) で は,中 心 静 脈 周 辺 に 広 範 な 壊 死 が 認 め られ た が, Z10群(写 真1C)とZ20群(写 真1D) で は,中 心 静 脈 周 辺 に 壊 死 に 陥 っ た 肝 細 胞 が 散 見 され る の み で あ っ た.以 上 よ り, 10mg/kg, 20 mg/kgの 亜 鉛 前 投 与 は,ラ ッ ト低 酸 素 ハ ロ タ ン 肝 障 害 に 対 し て 保 護 作 用 を有 して い る と思 わ れ た. 対 照 群 ∼Z20群 の す べ て の 群 で,ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後 に,門 脈 周 辺 か ら 中 間 帯 に 至 る 空 胞 変 性 領 域 が 認 め ら れ た(写 真1A∼D).こ の 空 胞 変 性 の 成 因 は 明 らか で は な い が,亜 鉛 投 与 量 依 存 的 に 空 胞 変 性 領 域 が 拡 大 して い る 傾 向 が 認 め ら れ た こ とか ら,亜 鉛 が 何 ら か の 影 響 を 及 ぼ し て い る と考 え ら れ た.一 般 に は,低 酸 素 曝 露 で 生 じ る 肝 細 胞 の 空 胞 変 性 は,中 心 静 脈 周 辺 に 生 じ る30) 31).し か し, PB投 与 ラ ッ トを低 酸 素 に 暴 露 す る の み で,空 胞 変 性 は 門 脈 周 辺 に 生 じ る11).平 山 は, PB投 与 ラ ッ トに 低 酸 素 下 で ハ ロ タ ン を投 与 す る と,ハ ロ タ ン投 与1日 後 の 肝 組 織 像 で は,中 心 静 脈 周 辺 の 壊 死 と と も に,門 脈 周 辺 に 空 胞 変 性 領 域 が 認 め られ,さ らに,投 与3日 後 で は,中 心 静 脈 周 辺 に は 線 維 化 が 見 ら れ た が,門 脈 周 辺 の 空 胞 変 性 が 消 失 し て 小 葉 構 造 も保 た れ て い るこ とを報 告 した12).本 研 究 で は, ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後 の 空 胞 変 性 は 門 脈 周 辺 に 見 ら れ,小 葉 中 心 性 壊 死 との 間 に は,ほ ぼ 正 常 な 肝 細 胞 が 帯 状 に 見 ら れ て お り,空 胞 変 性 と壊 死 の 成 因 は 異 な る と考 え ら れ る.ま た,空 胞 変 性 が か な り広 い 領 域 に 認 め られ たZ20群 の ラ ッ トに お い て も 血 清GPT値 の 上 昇 は 軽 度 で あ っ た.空 胞 変 性 の 本 態 は,細 胞 内 に 取 り込 ま れ た 血 漿 成 分 で あ り,低 酸 素 そ の もの よ り も類 洞 圧 の 上 昇 が 主 な 成 因 で,細 胞 内 小 器 官 に は 変 化 が な く,類 洞 圧 の 上 昇 さ え 取 り除 か れ れ ば, 可 逆 的 な 変 化 で あ る と言 わ れ て い る30) 31).以上 よ り,本 研 究 で 認 め られ た ハ ロ タ ン投 与 終 了24時 間 後 の 空 胞 変 性 は,可 逆 的 な 変 化 で あ り,ハ ロ タ ン に よ る肝 細 胞 障 害 と 直 接 は 関 係 な い と考 え ら れ た. ハ ロ タ ン投 与 直 前 の 肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 は,図3に 示 す よ う に,亜 鉛 投 与 量 依 存 的 に 減 少 し て い た.亜 鉛 を ラ ッ トに 投 与 す る と,肝 内 に ヘ ム オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 誘 導 さ れ,ヘ ム を 活 性 中 心 と し て 持 つP-450は,減 少 す る18).し た が っ て,本 研 究 で 見 られ た 亜 鉛 投 与 に よ るP-450 の 減 少 に は,亜 鉛 に よ っ て 肝 に 誘 導 さ れ た ヘ ム オ キ シ ゲ ナ ー ゼ が 関 与 して い る と考 え ら れ た. PBで 肝 にP-450を 誘 導 し た ラ ッ トに,低 酸 素 下 で ハ ロ タ ン を 投 与 す る と, P-450の 著 明 な 減 少 と と も に,著 し い肝 障 害 が 発 生 す る12) 13).また, in vitroで 極 低 酸 素 条 件 下 の 還 元 状 態 でPB投 与 ラ ッ トの 肝 ミ ク ロ ゾ ー ム に ハ ロ タ ン を 作 用 さ せ る と,ミ ク ロゾ ー ム のP-450含 量 は 減 少 す る14). こ れ ら の 事 実 よ り,ラ ッ ト低 酸 素 化 ハ ロ タ ン肝 障 害 の 機 序 と して,ハ ロ タ ン が,低 酸 素 下 で還
ハ ロ タン肝 障害 に 及ぼ す 亜鉛 の影響
1081
元 状 態 と な っ た ミ ク ロ ゾ ー ム に お い て, PBで 誘 導 され たP-450に 結 合 し,そ の 結 果,細 胞 膜 の 破 壊 が 起 っ た 可 能 性 が 考 え ら れ る.本 研 究 で も, 重 篤 な 肝 障 害 の 見 られ た 対 照 群 で は,低 酸 素 化 ハ ロ タ ン 投 与 前 後 で 肝 ミク ロ ゾ ー ムP-450含 量 の 著 し い 減 少 が 見 られ た.一 方, Z10群 お よび Z20群 で は,ハ ロ タ ン投 与 直 前 のP-450量 の 減 少 に よ り,ハ ロ タ ン 投 与 前 後 で のP-450量 の 減 少 量 が,対 照 群, Z5群 に 比 し て, 15∼30%程 度 の 低 下 傾 向 が 見 ら れ た.し た が っ て,亜 鉛 投 与 がPB投 与 に よ っ て 誘 導 さ れ たP-450を 減 少 さ せ た結 果,ハ ロ タ ン と反 応 す るP-450量 が 低 下 し た た め,肝 障 害 が 抑 制 さ れ た の で は な い か と 思 わ れ た. ハ ロ タ ン投 与 直 前 す な わ ち 亜 鉛 投 与24時 間 後 の 血 清GPT値 は,亜 鉛 投 与 量 依 存 的 に 上 昇 し た(図2).し か し, 20mg/kgの 亜 鉛 単 独 投 与 は, 24時 間 後 の 血 清GPT値 を 上 昇 さ せ ず(デ ー タ は 示 さず), PBに よ る 酵 素 誘 導 が な け れ ば,図 2に 示 す よ う な 肝 障 害 は 認 め ら れ な い.こ の 原 因 は 明 らか で は な い が,ヘ ム オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の ヘ ム分 解 に お け る代 謝 物 の 中 に,ビ リベ ル ジ ン/ ビ リル ビ ン,一 酸 化 炭 素,鉄 と い っ た 細 胞 毒 性 を持 つ 可 能 性 の あ る もの が あ り19), PB投 与 に よ るP-450の 誘 導 で 増 加 し た 細 胞 内 の ヘ ム が,亜 鉛 で誘 導 さ れ た へ ム オ キ シ ゲ ナ ー ゼ に よ っ て 急 速 に分 解 さ れ て,そ の 結 果 生 じ た 代 謝 産 物 が 細 胞 毒 性 を 示 し た の か も し れ な い. ハ ロ タ ン は 嫌 気 的 条 件 下 で 還 元 的 に 代 謝 さ れ る と, 1電 子 還 元 に よ りフ リー ラ ジ カ ル(CH3 CHClラ ジ カ ル)を 発 生 し,こ の ラ ジ カ ル も, 低 酸 素 ハ ロ タ ン 肝 障 害 の 原 因 の 一 つ で は な い か と疑 わ れ て い る32).ま た, MTは, MT自 身 が SH基 の 酸 化,結 合 して い る 亜 鉛 の 遊 離 な ど で 崩 壊 す る こ と に よ り,フ リー ラ ジ カ ル 消 去 作 用 を 発 現 す る と考 え られ て い る23) 24) 25).さ らに, PB 投 与 ラ ッ トに お い て,亜 鉛 投 与 で 誘 導 され た 肝 MTが,低 酸 素 下 ハ ロ タ ン 投 与 中 に,生 体 内 半 減 期 よ り も速 い 速 度 で 減 少 す る と い う報 告 が あ る33).以 上 よ り,亜 鉛 前 投 与 は,肝 に 誘 導 さ れ た MTが,そ れ 自 身 が 崩 壊 ・減 少 す る こ とに よ り, ハ ロ タ ン 由 来 の フ リー ラ ジ カ ル を消 去 し,肝 障 害 を抑 制 す る 可 能 性 が 考 え られ る.し か し,亜 鉛 投 与 に よ っ て 投 与 量 依 存 的 に 誘 導 さ れ た 肝 内 MT-1, MT-2は,ハ ロ タ ン 投 与 前 後 で,と も に,有 意 に 減 少 し な か っ た(図4).ま た,亜 鉛 5mg/kg投 与 で 誘 導 さ れ た 肝MTの 量 は,ハ ロ タ ン 由 来 の フ リー ラ ジ カ ル の 消 去 に 関 わ り減 少 す る と推 定 さ れ るMT量 に 対 し て は,十 分 大 き い と考 え られ た33)が,亜 鉛5mg/kg投 与 は,全 く 保 護 作 用 を 示 さ な か っ た.し た が っ て, MTに よ る フ リー ラ ジ カ ル の 消 去 作 用 は,本 研 究 で 認 め られ た 亜 鉛 前 投 与(10, 20mg/kg)の ラ ッ ト低 酸 素 ハ ロ タ ン肝 障 害 の保 護 作 用 の 主 要 な 機 序 と は 考 え難 か っ た. ま た,ハ ロ タ ン投 与 終 了24時 間 後 の 肝MT-1, MT-2量 は,ハ ロ タ ン 投 与 終 了 時 に 比 し て,各 群 と も,そ れ ぞ れ,約50%,約70%に 減 少 し た. これ は 亜 鉛 に よ っ て 誘 導 さ れ た 肝MT量 の 亜 鉛 投 与24時 間 後 か ら48時 間 後 に か け て の 自然 な 減 少 量34)と ほ ぼ 同 じ もの で あ っ た.す な わ ち,低 酸 素 下 ハ ロ タ ン投 与 は, 5∼20mg/kgの 亜 鉛 で誘 導 さ れ た 肝MT量 の 変 化 に,ハ ロ タ ン 投 与 後 も 明 らか な影 響 を 与 え な か っ た.し か し,ハ ロ タ ン 投 与 終 了 後24時 間 の 間 に 小 葉 中 心 性 の 肝 細 胞 壊 死 が 進 行 して お り,そ れ と同 時 にMTが 減 少 し た こ とか ら, MTが 細 胞 に亜 鉛 を供 給 し,亜 鉛 の 膜 安 定 化 作 用 に よ り肝 細 胞 壊 死 を 抑 制 した と い う可 能 性 は 考 え ら れ る. 結 論 ラ ッ トに フ ェ ノ バ ル ビ ター ル(PB)投 与 後 に 絶 食 を行 い,続 い て 低 酸 素 下 に ハ ロ タ ン を投 与 し 肝 障 害 を発 生 さ せ た.こ の ラ ッ ト低 酸 素 ハ ロ タ ン 肝 障 害 に 対 し て,ハ ロ タ ン 投 与24時 間 前 に 亜 鉛 前 投 与(5, 10, 20mg/kg体 重)を 行 い,血 清GPT値,肝 メ タ ロ チ オ ネ イ ン 量,肝 ミ ク ロ ゾ ー ムP-450量 お よ び 肝 組 織 像 か ら,低 酸 素 ハ ロ タ ン肝 障 害 に 対 し て 亜 鉛 の 及 ぼ す 影 響 を調 べ, そ の 影 響 を与 え る機 序 を検 討 し た. 1. 10, 20mg/kgの 亜 鉛 前 投 与 は,低 酸 素 化 ハ ロ タ ン投 与 後24時 間 後 の 血 清GPT値 の 著 明 な 増 加 を有 意 に 抑 制 し た. 2. 10, 20mg/kgの 亜 鉛 前 投 与 は,ハ ロ タ ン 投 与 終 了24時 間 後,中 心 静 脈 周 辺 の 壊 死 を減 少 さ せ た.3. PBに よ って 肝 細 胞 内 に誘 導 され た 肝 ミク ロ ゾ ー ムP-450は,亜 鉛 前 投 与 に よ っ て,投 与 量 依 存 的 に 有 意 に 減 少 し た. 4.亜 鉛 前 投 与 で 投 与 量 依 存 的 に 肝 内 に 誘 導 さ れ たMT-1, MT-2は,低 酸 素 下 ハ ロ タ ン 投 与 前 後 で,有 意 な 減 少 を 示 さ な か っ た. 5.以 上 の 結 果 よ り,ラ ッ ト低 酸 素 ハ ロ タ ン 肝 障 害 に お い て,亜 鉛 前 投 与 は,小 葉 中 心 性 の. 肝 細 胞 壊 死 を 減 少 させ,保 護 作 用 を持 つ こ とが 示 唆 さ れ た.そ の 保 護 作 用 の 機 序 の ひ とつ と し て,肝 ミ ク ロ ゾー ムP-450が 減 少 し,ハ ロ タ ン とP-450の 還 元 的 状 態 に お け る反 応 が 減 少 した こ とが,重 要 と考 え られ,亜 鉛 に よ り誘 導 さ れ る肝 メ タ ロ チ オ ネ イ ン の フ リー ラ ジ カ ル の 消 去 作 用 は,主 要 な 機 序 と は 考 え 難 か っ た. 稿 を終 え るに あ た り,終 止 懇 切 な る御 指 導,御 校 閲 を賜 り ま した恩 師,岡 山 大 学 医 学部 麻 酔 ・蘇 生 学 教 室 平 川 方 久教 授 に 謹 ん で 感謝 の 意 を表 し ます.ま た,御 助 言,御 協 力 を戴 い た 同 教 室 山 田輝 夫 先 生, 板 野義 太郎 先 生,高 橋 徹 先 生 な らび に 教 室 貝 各位 の 皆様 に 心 よ り御 札 申 し上 げ ます.
文
献
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