6 （２）ドパミン受容体サブタイプ

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(1)各種特異的リガンドを用いた脳内ドパミン受容体の生理機能の解析. 2015 年. 中澤. 俊介.

(2) 目次序論 ......................................................................................................................................... 4 第１節はじめに ............................................................................................................... 4 第２節神経伝達物質としてドパミンの役割 ................................................................... 6 （１）神経伝達物質ドパミン ............................................................................................. 6 （２）ドパミン受容体サブタイプ...................................................................................... 6 （３）ドパミンの制御を標的とした治療薬 ....................................................................... 7 第１章. 陽電子放出断層撮像法を用いた覚醒下コモンマーモセットにおける新規統合失調. 症治療薬ルラシドンの脳内ドパミン D2 受容体及びセロトニン 5-HT2A 受容体占拠率評価 .............................................................................................................................................. 12 第１節背景 .................................................................................................................... 12 （１）統合失調症と抗精神病薬 ....................................................................................... 12 （２）抗精神病薬の PET を用いた脳内受容体占拠率の評価 .......................................... 12 （３）新規統合失調症治療薬ルラシドン......................................................................... 13 第２節実験方法 ............................................................................................................. 15 （１）覚醒下コモンマーモセットを用いた PET イメージング ....................................... 15 （２）使用動物 ................................................................................................................. 15 （３）使用薬物及び放射標識 PET トレーサー ................................................................ 15 （４）ルラシドン及びオランザピンの受容体占拠率評価 ............................................... 16 （５）ラットにおけるルラシドン及びオランザピンの受容体占拠率評価...................... 19 （６）統計解析 ................................................................................................................. 19 第３節実験結果及び考察............................................................................................... 20 （１）再現性試験（test-retest study） ............................................................................... 20 （２）ルラシドン及びオランザピンによる D2 受容体占拠率測定.................................. 21 （３）ルラシドン及びオランザピンによる 5-HT2A 受容体占拠率測定 .......................... 22 （４）各薬剤の血漿中薬物濃度と脳内受容体占拠率の関係性 ........................................ 25 （５）考察 ........................................................................................................................ 27 （６）小括 ........................................................................................................................ 30 第２章コモンマーモセットを用いたドパミン D4 受容体作動薬 Ro 10-5824 の行動学的及び神経生理学的効果検討.......................................................................................................... 31 第１節背景 .................................................................................................................... 31 （１）ドパミンと実行機能及び注意欠陥多動性障害 ...................................................... 31 （２）ドパミン D4 受容体と ADHD ................................................................................ 31 （３）認知機能におけるガンマオシレーションの役割 ................................................... 32. 1.

(3) （４）精神疾患の中間表現系としてのガンマオシレーション ........................................ 34 （５）D4 受容体によるガンマオシレーションの制御 ..................................................... 35 第２節実験方法 ............................................................................................................. 37 （１）使用動物 ................................................................................................................. 37 （２）使用薬物 ................................................................................................................. 37 （３）ORD 課題を用いた注意・衝動性に対する薬剤の効果検討 ................................... 38 （４）定量脳波試験を用いた薬剤の脳波周波数帯域パワーへの効果検討...................... 40 （５）自発運動量に対する薬剤の効果検討 ..................................................................... 41 （６）統計解析 ................................................................................................................. 42 第３節実験結果及び考察............................................................................................... 43 （１）注意衝動性に対する D4 受容体作動薬 Ro 10-5824 の作用 .................................... 43 （２）D4 受容体作動薬 Ro 10-5824 による脳波パワースペクトラムへの作用 ............... 44 （３）D4 受容体作動薬 Ro 10-5824 による自発運動量への作用 ..................................... 49 （４）γ脳波パワーに対する D4 受容体拮抗薬 L-745,870 の作用検討 ........................... 51 （５）考察 ........................................................................................................................ 53 （６）小括 ........................................................................................................................ 53 第３章. ラットを用いたドパミン D4 受容体作動薬の睡眠・覚醒リズムに対する効果検討. .............................................................................................................................................. 55 第１節背景 .................................................................................................................... 55 （１）睡眠覚醒リズム制御におけるドパミンの役割 ...................................................... 55 （２）睡眠覚醒リズム制御における各ドパミン受容体サブタイプの役割...................... 55 （３）睡眠覚醒制御における D4 受容体の関与 ............................................................... 57 第２節実験方法 ............................................................................................................. 59 （１）使用動物 ................................................................................................................. 59 （２）外科手術及び EEG/EMG 記録 ................................................................................ 59 （３）使用薬物及び試験デザイン.................................................................................... 60 （４）睡眠構成成分及び脳波周波数帯域パワーの解析 ................................................... 60 （５）脳内 c-fos mRNA 発現レベルの解析 ...................................................................... 62 （５）統計解析 ................................................................................................................. 63 第３節実験結果および考察 ........................................................................................... 64 （１）ラット睡眠覚醒リズムに対する Ro 10-5824 の効果検討 ....................................... 64 （２）ラット睡眠覚醒リズムに対する A-412997 の効果検討 ......................................... 67 （３）EEG パワースペクトラムへの両 D4 受容体作動薬の効果検討 ............................. 70 （４）脳内 c-fos mRNA 発現レベルに対する両 D4 受容体作動薬の効果検討 ................. 73 （５）睡眠覚醒制御における D4 受容体の役割に関する考察 ......................................... 74. 2.

(4) （６）D4 受容体活性化による覚醒作用の神経解剖学的考察 .......................................... 76 （７）小括 ........................................................................................................................ 77 総括 ....................................................................................................................................... 78 謝辞 ....................................................................................................................................... 79 論文目録 ............................................................................................................................... 80 引用文献 ............................................................................................................................... 81. 3.

(5) 序論第１節はじめに. 思考や行動といったありとあらゆる我々の日常動作は全て脳が司っている。脳は、進化学的にも多くの生物が持つ器官であり、生命の維持にも必要不可欠なものである。脳の細胞は神経細胞及びグリア細胞から構成されており、一つ一つの神経細胞が様々な領域間でネットワークを形成することにより情報伝達を行う。これにより、外部からの情報をキャッチしどう対応するか、過去の経験に基づいてどう行動するかといった比較的高次の行動から、食欲、性欲、睡眠、呼吸といった本能的原始的な行動までもが制御されることになる。そして、神経細胞の基質的な破綻、あるいは機能的な破綻は神経変性疾患や精神疾患へとつながる。これらの疾患には脳卒中、植物状態である意識障害といった生命や尊厳に関わるものから、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病や統合失調症等様々な病気が含まれる。これら中枢神経系（Central Nervous System, CNS）領域の疾患は、高血圧や糖尿病といった循環器系等末梢臓器の疾患に比べ、未だに治療法が確立されておらず治療薬も潤沢に存在するわけではない。これは、生命科学の発達した現代においても、脳がすなわち神経細胞が支配する生理機能のごく一部しか解明されていないためであり、CNS 領域の疾患の治療法や治療薬の開発には脳が担う生理機能を理解することが必要不可欠である。特に近年、他の領域に比べ CNS 領域の新薬開発が極めて困難であることが数多くの分析結果[1-4]より明らかとなっており、脳機能及び疾患の理解がますます必要とされている。生理機能を司るための神経細胞間の情報伝達は、神経細胞同士の接合部であるシナプスで行われる。この情報を送る側（前シナプス）と受け取る側（後シナプス）とのやり取りは様々な神経伝達物質及びその受容体によって行われる。これまでに多くの神経伝達物質及びその受容体が同定されてきた。グルタミン酸及び GABA（gamma-aminobutyric acid）はそれぞれ興奮性及び抑制性の神経伝達物質として知られている。他にもドパミン、セロトニン（5-hydroxytryptamine, 5-HT）、ノルアドレナリン、ヒスタミン、アセチルコリンといった比較的単純な. 4.

(6) 構造をもつ物質から、オレキシン、オキシトシン、バソプレッシンといった神経ペプチド等が含まれ、それぞれに対していくつもの受容体サブタイプの存在が確かめられている。しかし、各々が担う生理学的役割は完全に解明されていない。神経細胞が支配する生理機能を理解することは、これら各神経伝達物質及びその受容体それぞれが担う生理機能を解明していくことに他ならないのである。これらを解き明かしていく手段には欠かせない要素がある。一つは神経伝達物質受容体に特異的なリガンドであり、もう一つはこうしたリガンドの薬理学的・神経生理学的な作用を生体内で生きたまま非侵襲的に、そして客観的かつ定量的に計測する技術である。こうした要件を満たすものとして、陽電子放出断層撮像法（Positron Emission Tomography, PET）[5]、脳波（Electroencephalography, EEG）[6]、核磁気共鳴画像法（Magnetic Resonance Imaging, MRI）[7, 8]が挙げられる。実際、これら PET 試験[5]、定量脳波試験[9]、ポリソムノグラフィ（睡眠脳波）試験[10, 11]は、脳の生理機能の解明のみならず、薬理学的・神経生理学的作用の解析を目的として動物あるいはヒトを対象に、治療薬の研究開発において近年度々活用されるようになってきている。. 本論文においては、げっ歯類あるいは非ヒト霊長類（Non-human primate, NHP）を対象に PET 及び EEG といったツールを駆使し、各種特異的リガンドを用いた脳内の主にドパミン受容体の生理機能の解析研究を実施した。. 5.

(7) 第２節神経伝達物質としてドパミンの役割. （１）神経伝達物質ドパミン図 1 に示す通り、ドパミンは L-チロシンから L-Dopa を経て生合成され[12]、神経系において多彩な生理機能に関わる神経伝達物質である。ドパミン神経系は脳内において主として、腹側被蓋野を起始核とする中脳－皮質路、中脳－辺縁路、そして黒質－線条体路及び視床下部－下垂体路、4 つの経路が知られている。これらのドパミン神経はシナプス間隙にドパミンを放出し、様々な生理機能を調節する。その範囲は、自発運動、摂食行動、情動、報酬、睡眠覚醒、下垂体ホルモン分泌、注意、短期記憶、学習等、本能行動のみならず比較的高次な脳機能をも担うものである[13]。このように数多くの機能に関わるため、ドパミン神経系の異常が一因となる疾患が多数知られている。例えば運動に関わるドパミン神経路の脱落によって起こるパーキンソン病、あるいは報酬に関わるドパミン神経系の異常が発症機序とされる依存症等が挙げられる。. （２）ドパミン受容体サブタイプシナプス間隙に放出されたドパミンは、その後様々な調節を受ける。一つには、過剰なドパミンがドパミントランスポーター（Dopamine Transporter, DAT）を介して前シナプスへと再取り込みを受ける過程がある。また酵素による分解制御を受け、モノアミンオキシダーゼ（Monoamine Oxidase, MAO）やカテコール-O-メチル基転移酵素（Catechol-O-Methyl Transferase, COMT）がこのドパミンの代謝に関わる[14]。. 6.

(8) 一方、シナプス間隙に放出されたドパミンが上記のような様々な生理作用を発揮する際には、後シナプスあるいは前シナプスに存在するドパミン受容体に結合しシグナル伝達を引き起こすことが必要となる。ドパミン受容体サブタイプには D1 から D5 までの 5 つが現在のところ知られており、表 1 に示す通り全てが G タンパク質共役型の受容体（G protein couple receptor, GPCR）に属する。これらは、Gs タンパク質に共役する D1 型受容体（D1 及び D5）と Gi/o タンパク質に共役する D2 型受容体（D2, D3, D4）に大きく分類されている[13]。各受容体サブタイプは、発現するそれぞれの脳領域（表 1）の機能に応じて、様々な生理機能を制御する。. （３）ドパミンの制御を標的とした治療薬これまでにドパミンを標的とした数多くの治療薬が承認されている。ドパミン神経系の脱落が起こるパーキンソン病では、ドパミンの前駆体 L-DOPA に加えて MAO 阻害剤、COMT 阻害剤が補助療法として用いられている[14,17]。. 7.

(9) ドパミン受容体を標的とした治療薬としては、D2 受容体拮抗作用を有する統合失調症治療薬（抗精神病薬）が挙げられるであろう。Chlorpromazine や Haloperidole のような古典的な定型抗精神病薬に始まり、Olanzapine や Risperidone 等数多くの非定型抗精神病薬が開発されてきた。しかし、これらの統合失調症治療薬は共通の作用として D2 受容体の拮抗作用を有するものの、他にもセロトニン、アドレナリン、ヒスタミン、アセチルコリン等の神経伝達物質受容体に対して各々が特有の作用を示し、その受容体結合特性によって治療効果あるいは副作用への異なる特徴が認められると考えられる[18, 19]。このため統合失調症治療薬の開発においては、D2 受容体の結合とその他の重要な受容体への結合特性を把握しておくことが必要となってくる。本論文の第 1 章では、2010 年に米国にて承認を受けた新規統合失調症治療薬ルラシドンの薬理学的特性について概説する。ルラシドン（図 2）は他の統合失調症治療薬と同じく D2 受容体拮抗作用に加え、その他セロトニン受容体各サブタイプにも親和性を示すが[19]、非臨床試験において小型霊長類コモンマーモセットの認知機能を改善するといった特長的な知見が得られている[20]。著者はルラシドンの薬理作用と生体内での受容体結合特性との関係を明らかにする目的で、マーモセットにおけるルラシドンのドパミン D2 及びセロトニン 5-HT2A 受容体占拠率を PET により測定した。この評価結果について第 1 章で論述する。. 8.

(10) 一方、ドパミン受容体作動薬も治療薬としていくつか用いられている。例えば、パーキンソン病及びレストレスレッグ症候群の治療薬である pramipexole[21] やパーキンソン病及び勃起不全治療薬である apomorphine[22]等が挙げられるが、これらはいずれもドパミン受容体サブタイプ非選択的な作動薬である。また、 DAT 阻害活性をもつメチルフェニデートは、注意欠陥・多動性障害（attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）及びナルコレプシーの治療薬として知られている[23, 24]。上記の薬剤は全てドパミン受容体各サブタイプを非選択的に刺激しその作用を発揮すると考えられるが、どの受容体がどの生理機能に対して役割を担うかその詳細なメカニズムは不明である。また非選択的にドパミン受容体を刺激することは、依存や嘔吐等副作用発現の懸念もあり実際に上記の薬剤でもしばしば問題となっている[21, 22]。したがって、今後より有効性と安全性に優れた治療薬の開発のためには脳内の各ドパミン受容体サブタイプがどの生理機能を担うのかを明らかにする必要がある。本論文の第 2 章及び第 3 章では、ドパミン D4 受容体サブタイプの生理機能について概説する。. 著者らの第 1 章の研究結果及び共同研究者の検討結果[25]から、ルラシドンのマーモセットでの認知機能への有効性には、ルラシドンの D4 受容体への親和性欠如が関与している可能性が推察された。D4 受容体はヒトの遺伝子多型研究から ADHD の発症と関連する可能性が示唆されている[26, 27]。そこで第 2 章において、ADHD の主たる症状である衝動性と注意機能に対するドパミン D4 受容体作動薬の作用についてマーモセットを用いて検討し、またその神経生理学的メカニズムを検討する目的で、同じくマーモセットの前頭皮質での脳波、特にガンマ帯域脳波に対する D4 受容体の役割を明らかにした。. また、メチルフェニデートが ADHD に加えてナルコレプシーの治療薬であることに着目し[24]、D4 受容体の刺激がメチルフェニデートの様に覚醒作用を発揮するのではないかと著者は仮説を立てた。これを検証するため、第 3 章においてはラットの睡眠脳波試験を用いて、D4 受容体作動薬の睡眠覚醒リズムに対する作用を検討した。本検討において、行動学的及び神経生理学的解析により. 9.

(11) D4 受容体の活性化が覚醒作用を発揮する可能性を示唆する新たな知見を得た。. 上記の通り、本論文において著者は霊長類及びげっ歯類を対象に PET や EEG といった非侵襲的計測ツールを駆使し、ドパミン受容体サブタイプの特異的リガンドを用いて脳内ドパミン受容体の生理機能、とりわけ D4 受容体の機能解析を行った。この一連の検討結果よりドパミン D4 受容体選択的作動薬が ADHD やナルコレプシーに対する新たな治療薬になり得る可能性を示唆する知見を得ることができた。. なお、本文中および図中で使用した略語は以下の通りである。. 5-HT: 5-hydroxytryptamine, serotonin 95% CI: 95% confidence interval ADHD: attention deficit hyperactivity disorder BPND: binding potential nondisplaceable CaMKII: calcium/calmodulin dependent protein kinase II cAMP: cyclic adenosine 3’, 5’-monophosphate cDNA: complementary deoxyribonucleic acid CNS: central nervous system COMT: catechol-O-methyl transferase DAT: dopamine transporter EC50: half maximal effective concentration ED50: half maximal effective dose EEG: electroencephalography Emax: maximum efficacy EMG: electromyography ERP: event-related potential FDG: [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose FFT: fast fourier transform GABA: gamma-aminobutyric acid. 10.

(12) GPCR: G protein coupled receptor HPLC: high performance liquid chromatography KO: knockout LFP: local field potential MAO: monoamine oxydase MAP: methanphetamine MC: methylcellulose mGluR: metabotropic glutamate receptor MRI: magnetic resonance imaging mRNA: messenger ribonucleic acid NHP: non-human primate NMDA: N-methyl-D-aspartic acid NREM: non rapid eye movement ORD: object retrieval detour PCR: polymerase chain reaction PET: positron emission tomography PFC: prefrontal cortex PV: parvalbumin qEEG: quantitative electroencephalography REM: rapid eye movement ROI: region of interest rRNA: ribosomal ribonucleic acid SRTM: simplified reference tissue model TAC: time-activity curve TRN: thalamic reticular neucleus TRY: tryptamine VNTR: variable number tandem repeat. 11.

(13) 第１章. 陽電子放出断層撮像法を用いた覚醒下. コモンマーモセットにおける新規統合失調症治療薬ルラシドンの脳内ドパミン D2 受容体及びセロトニン 5-HT2A 受容体占拠率評価第１節背景. （１）統合失調症と抗精神病薬. 統合失調症はおよそ１％の割合で発症が認められる精神疾患であり、幻覚・幻聴・妄想等の陽性症状、感情平板化・社会性欠如・意欲低下等の陰性症状、注意・判断力・実行機能等の認知機能障害を 3 大主症状とする[28]。統合失調症にはこれまで数多くの治療薬が開発されてきており、一般的に抗精神病薬と呼ばれている。抗精神病薬は古くに開発されてきた定型抗精神病薬及び 20 世紀後半に開発されてきた非定型抗精神病薬にさらに分類される。各抗精神病薬は神経伝達物質であるドパミン、セロトニン、アセチルコリン、ヒスタミン、アドレナリン等の各種受容体に対する親和性がそれぞれ異なり、それらの作用様式によって様々な治療薬としての異なる特徴を発揮することが知られている[18]。しかし、全ての抗精神病薬はドパミン D2 受容体拮抗作用を有し、この作用が統合失調症治療薬としての、特に陽性症状に対する治療効果の作用機序の本体であると考えられており、その機序としては腹側被蓋野から辺縁系に投射するドパミン神経経路の遮断が一つの有力な仮説とされている[28, 29]。. （２）抗精神病薬の PET を用いた脳内受容体占拠率の評価. 抗精神病薬の治療効果発現とともに、錐体外路様症状といった副作用発現についても脳内ドパミン D2 受容体の拮抗作用が鍵となることが知られている[28,. 12.

(14) 29]。この両作用を予測する手段として、数多くの抗精神病薬の研究開発に PET による脳内 D2 受容体占拠率の測定が実施されてきた。Haloperidol や Olanzapine 等いくつかの抗精神病薬の PET による D2 受容体占拠率と治療効果及び副作用発現に関する治験データの関係性を分析したメタ解析によれば、ドパミン D2 受容体の占拠率が 60-95%の用量であれば治療効果を発揮し、80-90%以上になると錐体外路様症状の副作用が発現してくることが判明している[30]。このように抗精神病薬の治療効果/副作用発現予測には PET による D2 受容体占拠率が最も頑健性のあるバイオマーカーであることが世界的に認識されている。一方、後期に開発されてきた非定型抗精神病薬は一般的に副作用の発現頻度が比較的少ないと言われている[29]。これら非定型抗精神病薬は D2 受容体拮抗作用に加えてセロトニン 5-HT2A 受容体の拮抗作用を有することから、この受容体結合特性が副作用低減のメカニズムと考えられている[31]。実際、PET による D2 受容体と 5-HT2A 受容体の占拠率を測定すると、非定型抗精神病薬の一部は D2 受容体を十分占拠する用量において 80%以上の 5-HT2A 受容体占拠率を示すことが知られている[32]。しかし、5-HT2A 受容体の拮抗作用による副作用発現の低下に関して、その詳細な機序の統一的な見解は得られていない[28, 29, 32]。また、5-HT2A 受容体の拮抗作用以外にも非定型抗精神病薬の有する受容体結合特性は種々あり、5-HT1A 受容体の部分作動性[33]、D2 受容体の解離速度の違い [34]等様々な仮説が非定型抗精神病薬の作用機序として考えられている。. （３）新規統合失調症治療薬ルラシドン. ルラシドンは 2010 年に米国において承認された新規統合失調症治療薬である（図 2）。in vitro での受容体結合試験や機能評価試験から、ルラシドンは他の抗精神病薬と同じくドパミン D2 受容体拮抗作用を有し、その他セロトニン 5-HT2A 及び 5-HT7 受容体の拮抗作用及びセロトニン 5-HT1A 受容体の部分作動性を有することが判明している[35]。また、他の抗精神病薬と異なり過鎮静や体重増加等の副作用につながるムスカリン M1 やヒスタミン H1 受容体に対しては親和性をもたない。げっ歯類を用いた行動薬理学的評価により、ルラシドンは抗精神病様作用（メタンフェタミン誘発過運動抑制）を発揮し、錐体外路様症. 13.

(15) 状の発現程度が低いことが明らかとなっている[35]。また、記憶に関連したげっ歯類の受動回避課題や新規物体認識課題においてその成績を向上させることが知られている[36, 37]。さらに、ルラシドンの他の抗精神病薬にはない特長として小型霊長類コモンマーモセットの Object Retrieval Detour (ORD) 課題における成績向上が挙げられる[20]。この報告では、ルラシドンを除く他の抗精神病薬が注意及び衝動性を評価する ORD 課題において成績を悪化させるのに対し、ルラシドンのみが経口投与 10 mg/kg の用量において統計学的有意に成績を向上させた。このことはルラシドンが統合失調症患者の認知機能障害の一つである注意機能を改善する可能性を示唆するものである。しかしながら、このルラシドンのコモンマーモセットにおける特長的な作用が統合失調症治療の主作用である D2 受容体、あるいは他の受容体に対して十分な占拠率を発揮する用量において認められるかどうかは不明であった。. そこでルラシドンの in vivo での脳内受容体結合特性を明らかにする目的で、ルラシドンのコモンマーモセットでの脳内 D2 及び 5-HT2A 受容体占拠率を PET により評価した。比較対照薬として非定型抗精神病薬の一つであるオランザピンについても評価を実施した。. 14.

(16) 第２節. 実験方法. （１）覚醒下コモンマーモセットを用いた PET イメージング. ヒトにおける PET 試験では問題とならないが、動物を用いた PET 試験では不動化が課題となる。一般的にげっ歯類や霊長類を用いた PET 試験においては不動化のため麻酔薬を使用することが多い。しかしながら麻酔薬は中枢神経系のみならず末梢循環系にも生理的な作用を引き起こし、試験結果やその解釈に多大な影響を与えてしまう因子となり得る。実際に、麻酔薬として汎用されている NMDA（N-methyl-D-aspartic acid）受容体拮抗薬ケタミンは脳内のドパミン神経に対して非特異的な影響を及ぼすことが霊長類の PET 試験から明らかとなっている[38]。さらに麻酔薬は腸管運動や循環血流量を低下させることから、投与した薬物の薬物動態学的パラメーターに多大な影響を及ぼす可能性がある。このような課題を解決すべく、著者の共同研究先である理化学研究所ではコモンマーモセットの無麻酔下 PET イメージング技術の方法を確立していた[39]。著者らはこの技術を用い無麻酔下コモンマーモセットの PET 試験を実施した。. （２）使用動物. 4 頭の雄性コモンマーモセット（3-4 年齢）を実験に使用した。試験期間中の体重は 278～418 g であった。全ての動物実験手順は神戸理化学研究所動物実験委員会にて承認を受けた。. （３）使用薬物及び放射標識 PET トレーサー. ルラシドン及びオランザピンは大日本住友製薬株式会社にて合成した。メチルセルロースはナカライテスク社より入手した。これらの薬剤は溶媒である 0.5% メチルセルロース（MC）に懸濁し投与液として実験に使用した。各受容体の放射標識 PET トレーサーとして、ドパミン D2 受容体は [11C]raclopride を[40]、セロトニン 5-HT2A 受容体は[11C]MDL 100907 を[41]用い. 15.

(17) た（図 3）。これらのトレーサーは既報[40, 41]に従って標識合成を行った。実験に使用した両トレーサー化合物の放射化学的純度は毎回 99%以上であった。 [11C]raclopride の投与を行った時点での投与した放射活性、比放射能、投与化合物量はそれぞれ、17.3 ± 1.7 MBq、72.6 ± 24.4 GBq/mol、0.77 ± 0.21 nmol/kg であった。[11C]MDL 100907 については同順に、19.4 ± 1.4 MBq、62.6 ± 21.0 GBq/mol、1.01 ± 0.34 nmol/kg であった。. （４）ルラシドン及びオランザピンの受容体占拠率評価. 各マーモセットの脳構造情報を取得するため麻酔下 Magnetic Resonance Imaging（MRI）による脳画像スキャンを実施した。MRI は Varian Associates 社 4.7 T MRI を用いた。その後、覚醒下 PET イメージング実施のため既報[39]に従い、麻酔下各個体の頭蓋に頭部固定用の装置を外科的に取り付けた。手術後抗生物質処置を行いながら 2 週間以上の回復期間を設けた後、PET 撮像環境への不動化馴化を少なくとも 3 回以上実施した。 PET イメージングはシーメンス社の microPET Focus220 を使用した。薬物の消化管吸収に対する食事の影響を避けるため PET 撮像の少なくとも 12 時間前から摂食制限を行った。撮像実験当日は、まず PET トレーサーの静脈内投与に用いるカテーテルを尾静脈に留置した後、マーモセットをモンキーチェアーに座らせ頭部を固定した。その後溶媒（0.5% MC, vehicle）、ルラシドン（1, 3, 10 mg/kg）、あるいはオランザピン（0.3, 1 mg/kg）を 5 mL/kg にて経口投与し、PET スキャナーの中に動物を入れた。減弱補正画像取得のため 68Ge–68Ga 線源を用いたトラ. 16.

(18) ンスミッションスキャンを 30 分間行い、薬物投与から 1 時間後に PET トレーサー[11C]raclopride あるいは[11C]MDL 100907 を急速静脈注射で体内に投与した。トレーサーの投与と同時にエミッションスキャンを開始し 90 分間撮像を行った。前もって検討したルラシドン及びオランザピンの血中薬物濃度推移（図 4）及び薬物投与後 1 時間後に評価した ORD 課題試験[20]を基にこれらの実験パラダイムを設定した。各 PET スキャン終了後に採血を実施し、血漿中の薬物濃度を HPLC-tandem mass spectrometry (MS/MS)を用いて測定した。. 図4. ルラシドン及びオランザピンの血中濃度推移. Time-course of mean plasma concentrations of drugs after oral administration of 10 mg/kg of lurasidone (square) and 1 mg/kg of olanzapine (triangle) in common marmosets. Blood samples were taken at the indicated time points and plasma drug concentrations were measured as described in materials and methods. Each point with bar represents the mean and standard error of the mean (N=3-5). Data of 9 hours after oral administration of lurasidone represents the mean of two data. PET scanning were conducted during 1 to 2.5 hours after the drug administration as indicated within this figure. 公刊主論文 1 Fig. S1 より引用. 17.

(19) 以下の画像解析は PMOD ソフトウェア（PMOD 社）を用いて行った。取得した PET 画像データを各個体の MR 画像と重ね合わせ、関心領域（Region Of Interest, ROI）を設定した。[11C]raclopride を用いた D2 受容体の解析には尾状核（Caudate）及び被殻（Putamen）を合わせた線条体（Striatum）を、[11C]MDL 100907 を用いた 5-HT2A 受容体の解析には前頭葉皮質（Frontal Cortex）、後頭葉皮質（Occipital Cortex）、及び島皮質（Insular Cortex）を各受容体が豊富に発現している ROI に設定した。またいずれの解析においても、各受容体の発現が認められないことが知られている小脳（Cerebellum）を参照領域に設定した。これらの関心領域中の時間-放射活性曲線（Time-Activity Curve, TAC）を描き、Binding Potential nondisplaceable （BPND）を Simplified Reference Tissue Model （SRTM）にて算出した [42, 43] 。算出した BPND を用いて式（１）に従って、受容体占拠率（Occupancy, %）を算出した。また質量―作用の法則に基づき式（２）にしたがい、血中薬物濃度と D2 受容体占拠率の関係性について非線形回帰分析を行った。. 𝑂𝑐𝑐𝑢𝑝𝑎𝑛𝑐𝑦 (%) = 100 ×. 𝐵𝑃𝑁𝐷𝑏𝑎𝑠𝑒𝑙𝑖𝑛𝑒 −𝐵𝑃𝑁𝐷𝑑𝑟𝑢𝑔 𝐵𝑃𝑁𝐷𝑏𝑎𝑠𝑒𝑙𝑖𝑛𝑒. ・・・式（１）. ここで、 BPNDbaseline 及び BPNDdrug はそれぞれ Vehicle 投与時及び薬物投与時の BPND 値を表す。. 𝑂𝑐𝑐𝑢𝑝𝑎𝑛𝑐𝑦 (%) =. 𝑂𝑐𝑐𝑢𝑝𝑎𝑛𝑐𝑦𝑚𝑎𝑥 ×𝐶 𝐶+𝐸𝐶50. ・・・式（２）. ここで、Occupancymax は見かけ上の最大受容体占拠率（%）、C は血漿中薬物濃度（ng/mL）、EC50 は最大受容体占拠率の 50%の受容体占拠率を示す時の血漿中薬物濃度（ng/mL）を示す、各 4 頭の個体について[11C]raclopride を用いた試験は 7 スキャン（Vehicle2 回、ルラシドン 1, 3, 10 mg/kg 各 1 回、オランザピン 0.3, 1 mg/kg 各 1 回）、[11C]MDL 100907 を用いた試験は 3 スキャン（Vehicle、ルラシドン 10 mg/kg、オランザピン 1 mg/kg、各 1 回）実施した。各個体のスキャンの間は薬物の wash-out 及び動物愛護（被曝、ストレス、採血等の要因）のため少なくとも 10 日以上空け実. 18.

(20) 験を実施した。. （５）ラットにおけるルラシドン及びオランザピンの受容体占拠率評価. 日本エスエルシー社から購入した雄性ラット（8-10 週齢）を実験に使用した。 Vehicle（0.5% MC）、ルラシドン（0.1, 1, 10 mg/kg）あるいはオランザピン（0.1, 1, 10 mg/kg）を 5 mL/kg にて経口投与し、1 時間後におよそ 10 MBq の [11C]raclopride または[11C]MDL 100907 を尾静脈より急速静脈内投与した。放射標識トレーサーの投与から 30 分後、断頭によりラットを安楽死させ脳を摘出した。[11C]raclopride の場合は線条体を、[11C]MDL 100907 の場合は前頭葉皮質を、また両トレーサーいずれの場合も非特異的結合の算出のために小脳を、それぞれ素早く分取し、組織中の放射活性をガンマカウンター（パーキンエルマー社）にて測定した。また湿重量も測定した。各脳組織に集積した放射標識トレーサー量は、個体に投与した放射活性あたりの脳組織中の放射活性（放射性崩壊補正済）を計算し、それを湿重量で割ることで算出した。線条体あるいは前頭葉皮質のこの値から同一個体の小脳の値を引くことで特異的結合を求め、薬剤投与による受容体占拠率は Vehicle 投与時の特異的結合に対する割合から求めた。. （６）統計解析. 全ての統計学的解析は GraphPad Prism5 ソフトウェア（GraphPad Software 社）を用いて行った。血中薬物濃度と D2 受容体占拠率の非線形回帰分析は Spearman’s rank correlation test にて相関関係の検定を行った。群間の統計解析は paired t test にて行った。危険率 P 値が 0.05 未満の場合、有意とみなした。. 19.

(21) 第３節. 実験結果及び考察. （１）再現性試験（test-retest study）. 同一個体を用いた長期間の実験となるため、実験間の再現性・安定性が必須となり PET の論文においてはよくこの確認が実施されている[44]。そこで日を空けた実験間でバラつきが生じるかどうかを確認するため test-retest study を実施した。 [11C]raclopride を用いた試験において、一連の実験の最初に取得した Vehicle 投与時のデータ及び最後に取得した Vehicle 投与時のデータを用いてバラつきを比較した。表 2 に各スキャン時の Caudate、Putamen、Striatum の BPND 値及び Paired t テストでの P 値を示す。いずれの領域においても両スキャン間での有意な変化は認められなかった。この結果より、本覚醒下マーモセットでの PET 試験が再現性のある実験系であることが示された。以後、Vehicle 投与時の BPND 値はこの平均値を用いた。. 11. 表 2 [ C]raclopride を用いた覚醒下コモンマーモセット PET 試験の test-retest study Two baseline scans were carried out separately, before and after the repeated measurements during 6 months. 11. Data represent mean±SD. Regional BPND values of [ C]raclopride were compared by paired t test. 公刊主論文 1 Table 1 より引用. 20.

(22) （２）ルラシドン及びオランザピンによる D2 受容体占拠率測定. 図 5 に Vehicle、ルラシドン 10 mg/kg、オランザピン 1 mg/kg 投与時の線条体及び小脳での TAC を示す。[11C]raclopride は他の種での報告と同様小脳に比べて線条体に高い集積を認めた。この結果は D2 受容体の発現分布と一致するものであった。ルラシドン及びオランザピンの投与によって線条体での放射活性は著しく減少したが、小脳ではほとんど影響を認めなかった。このことは両薬剤が特異的に線条体の D2 受容体を占拠することを意味すると考えられた。また小脳を参照領域とした SRTM 解析の妥当性を保証するものであった。. 図5. 溶媒、ルラシドン及びオランザピンの投与時の線条体と小脳での. 11. [ C]raclopride TAC Time–activity curves of regional radioactivity concentration (kilobequerels per cubic centimeter) after 11. [ C]raclopride injection in striatum (a) and cerebellum (b) at baseline (circle), and after oral administration of 10 mg/kg lurasidone (square) or 1 mg/kg olanzapine (triangle). Each point with bar represents the mean and standard deviation.. 公刊主論文 1 Fig. 1 より引用. 21.

(23) 表 3 に各薬剤投与時の線条体 BPND 値、受容体占拠率、及び血漿中薬物濃度を示す。オランザピンの投与によって用量依存的な BPND 値の低下及び受容体占拠率と血漿中薬物濃度の上昇が認められた。一方、ルラシドンの 1 mg/kg と 3 mg/kg の間には用量と受容体占拠率の間に逆転が認められた。これは表中に示す通り、血漿中薬物濃度の逆転が原因と考える。血漿中薬物濃度の逆転が認められた理由は不明であるが、後に示す（図 8）血漿中薬物濃度と受容体占拠率の関係には有意な相関関係が認められている。. 11. 表 3 溶媒、ルラシドン及びオランザピン投与時の[ C]raclopride の BPND 値、受容体占拠率、血漿中薬物濃度 BPND 値は SRTM により、受容体占拠率は式（1）により算出した。データは平均値と標準偏差を表す。. 公刊主論文 1 Table 2 より引用（３）ルラシドン及びオランザピンによる 5-HT2A 受容体占拠率測定. 図 6 に Vehicle、ルラシドン 10 mg/kg、オランザピン 1 mg/kg 投与時の前頭葉皮質、後頭葉皮質、島皮質及び小脳での TAC を示す。Vehicle 投与時において、 [11C]MDL 100907 は小脳に比べ各皮質領域において高い集積を認めた。この結果は 5-HT2A 受容体の発現分布と一致するものであった。オランザピンの投与によって、各皮質領域での[11C]MDL 100907 の集積が大きく低下した。ルラシドンの投与時にはオランザピンの低下に比べて半分程度の集積の低下が認められた。いずれの薬物によっても小脳への[11C]MDL 100907 の集積は低下が認められなかった。このことは両薬剤が特異的に皮質領域での. 22.

(24) 5-HT2A 受容体を占拠することを意味すると考えられた。また小脳を参照領域とした SRTM 解析の妥当性を保証するものであった。表 4 に各薬剤投与時の各皮質領域での BPND 値、受容体占拠率、及び血漿中薬物濃度を示す。オランザピンの投与によって各領域でおよそ 80%の占拠を認めた。一方ルラシドンの投与ではおよそ 40%の占拠率が認められた。. 図 6 溶媒、ルラシドン及びオランザピンの投与時の各皮質領域と小脳での 11. [ C]MDL 100907 TAC 11. Time–activity curves of regional radioactivity concentration (kBq/cc) after [ C]MDL 100907 injection in frontal cortex (a), occipital cortex (b), insular cortex (c), and cerebellum (d) at baseline (circle), and after oral administration of 10 mg/kg lurasidone (square) or 1 mg/kg olanzapine (triangle). Each point with bar represents the mean and standard deviation.. 公刊主論文 1 Fig. 3 より引用. 23.

(25) 11. 表 4 溶媒、ルラシドン及びオランザピン投与時の[ C]MDL 100907 の BPND 値、受容体占拠率、血漿中薬物濃度 BPND 値は SRTM により、受容体占拠率は式（1）により算出した。データは平均値と標準偏差を表す。. 公刊主論文 1 Table 3 より引用. 図 7 に Vehicle、ルラシドン 10 mg/kg 及びオランザピン 1 mg/kg 投与時の [11C]raclopride 及び[11C]MDL 100907 の BPND マップを示す。[11C]raclopride に関して、Vehicle 投与時は線条体のみが描出され、各薬剤の投与によって線条体の D2 受容体がほぼ完全に占拠されていることを確認できた。[11C]MDL 100907 に関しても皮質領域のみが描出され、オランザピンの投与によって皮質 5-HT2A 受容体がほぼ完全に占拠されていた。一方ルラシドンの投与では完全な占拠には至らなかった。. 24.

(26) 11. 図 7 溶媒、ルラシドン及びオランザピンの投与時の [ C]raclopride 及び 11. [ C]MDL 100907 の BPND マップ 11. 11. Typical PET images of [ C]raclopride (a) and [ C] MDL 100907 (b) at baseline (vehicle), and after oral administration of 10 mg/kg lurasidone or 1 mg/kg olanzapine. Parametric images of BP ND from one marmoset were generated by SRTM2[45] and superimposed on its own coregistered MR image. The fixed k2′ value for SRTM2 calculation was determined by averaging k2′ values in ROIs calculated by SRTM. 公刊主論文 1 Fig. 4 より引用. （４）各薬剤の血漿中薬物濃度と脳内受容体占拠率の関係性. 図 8 にはルラシドン及びオランザピンの血漿中薬物濃度と脳内 D2 受容体及び 5-HT2A 受容体占拠率の関係性をプロットしたグラフを示す。ルラシドンの血漿中薬物濃度と D2 受容体占拠率との間には有意な相関関係（R = 0.7334、P = 0.0155）が認められ、見かけの最大受容体占拠率及び EC50 値はそれぞれ、89.4% （95%. 25.

(27) 信頼区間(CI）、71.7 - 107.0%）、1.1 ng/mL（95%CI, 0.2 – 2.0 ng/mL）と算出された。オランザピンに関しても有意な相関関係（R = 0.9541、P = 0.0022）が認められた。見かけの最大受容体占拠率及び EC50 値はそれぞれ、86.2% （95% CI、75.9 – 96.4%）、6.0 ng/mL（95%CI 2.9 – 9.0 ng/mL）と算出された。両薬剤が十分な D2 受容体占拠率を示す用量及び血漿中薬物濃度において、オランザピンは 80%程度の、ルラシドンは 40%程度の 5-HT2A 受容体占拠率を示した。この結果より、ルラシドンはマーモセットの脳内において、5-HT2A 受容体よりも D2 受容体への結合親和性が高いという結合特性が明らかとなった。一方、オランザピンはこれまでの報告[32]と同様、脳内において D2 受容体よりも 5-HT2A 受容体への結合親和性が高いという知見が得られ、結果の妥当性を示すものであると考えられた。. 図 8 ルラシドン及びオランザピンの血漿中薬物濃度と脳内 D2 受容体、5-HT2A 受容体占拠率との関係性 Relationships between plasma lurasidone (a) or olanzapine (b) level and dopamine D2 (open symbols) and serotonin 5-HT2A (closed symbols) receptor occupancies in conscious common marmosets. Dotted lines represent the regression curves of D2 receptor occupancy generated by Eq. 2. EC50, the plasma concentration required for 50 % of maximal D 2 receptor occupancy; R, correlation coefficient. Correlations were statistically analyzed by Spearman’s rank correlation test (P<0.05, statistical significant). 公刊主論文 1 Fig. 2 より引用. 26.

(28) （５）考察. ルラシドンの in vitro での D2 及び 5-HT2A 受容体への親和性（Ki 値）はそれぞれ、1.68 nM 及び 2.03 nM と報告されている[35]。オランザピンの Ki 値は D2 受容体が 14.4 nM、5-HT2A 受容体が 5.78 nM と報告されている[35]。これら各薬剤の in vitro での D2 受容体への親和性の強弱と今回測定された in vivo での受容体占拠率の EC50 値の強弱（ルラシドン 1.1 ng/mL; オランザピン 6.0 ng/mL）に関して矛盾はない結果であった。ルラシドンは D2 と 5-HT2A 受容体に対する親和性がほぼ同程度であり、この Ki 値から推定すると両受容体を同じ血中薬物濃度で同程度占拠することが予測された。しかし、in vivo で測定する結合特性は D2 > 5-HT2A であった。この正確な原因は不明であるが、in vitro で測定される Ki 値と in vivo の受容体結合特性が必ずしも一致しないことは他の非定型抗精神病薬でも報告されている。例えばジプラシドンは D2 に比べて 5-HT2A 受容体に対する Ki 値は in vitro においては 10 倍程度高いが[46]、in vivo での受容体占拠率を PET により測定するとこの D2 に対する 5-HT2A 受容体の優位性は 3-4 倍程度になることが報告されている[47]。このように in vitro の Ki 値からだけでは生体内の受容体結合特性を単純に予測することはできず、したがって本試験の様に PET による受容体占拠率を測定することの意義・重要性を示唆するものである。. げっ歯類での行動薬理試験においてルラシドンの生体内での薬理作用が報告されている[35]。このことと本結果との整合性を確認するため、PET ではないがラットを用いて in vivo D2 及び 5-HT2A 受容体占拠率を測定した。その結果を図 9 及び表 5 に示す。D2 受容体占拠率の ED50 値はルラシドンが 2.2 mg/kg、オランザピンが 3.8 mg/kg であった。一方 5-HT2A 受容体占拠率に関して、オランザピンは 1.4 mg/kg の ED50 値を示したが、ルラシドンは評価した 10 mg/kg までの投与量において 50%占拠率を越えなかったため ED50 値を算出できなかった。これらのラットでの結果はマーモセットでのルラシドンとオランザピンの受容体結合特性と矛盾しないものであった。さらに、これらの ED50 値はラットにおける各受容体を介した行動薬理試験での ED50 値[35]とほぼ同程度の値が得. 27.

(29) られた（表 5）。ルラシドンはラットにおいて 1,000 mg/kg の投与量までにおいて錐体外路様症状の副作用と考えられるカタレプシー反応を引き起こさないことが報告されている[35]。一般的にカタレプシー反応は D2 受容体の拮抗作用により誘導され、同時に 5-HT2A 受容体を拮抗することでカタレプシー反応が低減するとの仮説もある[31]。しかし、ルラシドンの受容体結合特性の結果より、5-HT2A 受容体以外のメカニズムがルラシドンのカタレプシー低減に関与していることが考えられた。実際、カタレプシーの低減に 5-HT2A 受容体の拮抗作用が関与するとの仮説に対してはいくつもの反証事例があり[28, 29, 32, 48]、5-HT1A 受容体の作動性も有力な作用機序として考えられている[33]。ルラシドンに関してはこの 5-HT1A 受容体の作動性が関与しているのかもしれない。. 図 9 ルラシドン及びオランザピンのラット脳内 D2 受容体、5-HT2A 受容体占拠率の評価 Effect of oral lurasidone (square) and olanzapine (triangle) administration on in vivo binding of 11. 11. [ C]raclopride to D2 receptor (a) and of [ C]MDL 100907 to 5-HT2A receptor in rat striatum and frontal cortex, respectively. Data represent mean ± standard error of the mean (n = 3). 公刊主論文 1 Fig. S2 より引用. 28.

(30) 表 5 ラットにおける各受容体占拠率と関連する行動薬理試験との比較受容体占拠率の ED50 (mg/kg)は平均値と標準誤差（n=3）を示す *10 mg/kg までの投与量において受容体占拠率が 50%を超えなかったので算出できなかった **文献 35 より引用、MAP は Methanphetamine,、TRY は Tryptamine を表す. 第 1 節（３）で述べたように、共同研究者村井らの報告[20]より、注意や衝動性等の実行機能を評価するコモンマーモセットを用いた ORD 課題において、ルラシドンは 10 mg/kg の用量で有意な正答率の上昇が認められている。一方、オランザピンにはそのような作用は認められていない。本 PET 試験の結果ではルラシドン 10 mg/kg における D2 及び 5-HT2A 受容体の脳内占拠率はそれぞれ、平均で 86%及び 40%程度であった。一般的に D2 受容体の占拠率が 80%程度の用量において抗精神病薬が陽性症状に対する治療効果を発揮することが知られており[30]、これらの知見よりルラシドンは陽性症状に対する治療効果を発揮する用量において注意機能等への認知障害に対して有効性を発揮することが示唆された。また、一般的には D2 受容体を十分占拠する用量では錐体外路様症状の発現も認められることが知られているが、ルラシドンのマーモセット ORD 課題において異常な運動行動への作用は認められておらず、ルラシドンの治療薬としての有用性を示唆するものであった。この ORD 課題遂行において前頭葉皮質が重要であることがマーモセットでの脳局所破壊実験により明らかとなっており[49]、5-HT2A 受容体は前頭葉皮質に発現していることから実行機能に対する 5-HT2A 受容体拮抗作用の関与が考えられている。実際に、5-HT2A 受容体の拮抗作用が前頭葉皮質におけるドパミンの遊離を引き起こすことがげっ歯類でのマイクロダイアリシス試験より. 29.

(31) 明らかとなっており、この前頭葉皮質でのドパミンの遊離が認知機能に対する有効性への作用機序として考えられている[50]。しかしながら、本結果において十分 5-HT2A 受容体を占拠しているオランザピンが、注意機能に何ら改善作用を与えないことを考えると、ルラシドンの実行機能への作用は 5-HT2A 受容体の拮抗作用以外のメカニズムが関与するのではないかと考えられた。. （６）小括. 以上、本章では覚醒下コモンマーモセットを用いた PET 試験において、ルラシドンの生体内での受容体結合特性を初めて明らかにした。著者の知る限り、覚醒下コモンマーモセットを用いて治療薬の PET による受容体占拠率を測定した報告はこれが世界で初めてである。大型のサルに比べて取扱いのたやすいコモンマーモセットを用いて、ヒト PET 試験のように麻酔の影響を受けずに受容体占拠率を評価できることは大きな利点であり、CNS 領域の創薬研究開発においてコモンマーモセットの有用性と実用性を大きく進展させると考えられる。本結果を含むルラシドンのコモンマーモセットを用いた非臨床結果の検討より、ルラシドンは抗精神病作用を発揮する用量において認知機能障害への有効性を発揮する可能性を示唆する知見を得た。また、他剤との比較検討よりその作用には 5-HT2A 受容体の拮抗作用以外のメカニズムが関与することが示唆された。. 30.

(32) 第２章. コモンマーモセットを用いた. ドパミン D4 受容体作動薬 Ro 10-5824 の行動学的及び神経生理学的効果検討第１節背景. （１）ドパミンと実行機能及び注意欠陥多動性障害. 共同研究者である村井らによるコモンマーモセットの ORD 課題での更なる解析から、オランザピン等他の抗精神病薬に比べてルラシドンのドパミン D4 受容体への親和性が低いという受容体結合特性が、ルラシドンの ORD 課題での正答率上昇に関与する可能性が示唆された[25]。ORD 課題の正答率は注意機能と行動抑制（衝動性）とのバランスによって制御されると考えられている[20]。このような認知ドメインに異常が認められる疾患として、注意欠陥多動性障害（Attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）が挙げられる。ADHD は不注意、衝動的行動及び多動を主症状とする発達障害であり、子どもあるいは大人においておよそ 3-10%程度の罹患率との報告がある[26, 27]。 ADHD の治療薬としてドパミン再取り込み阻害薬であるメチルフェニデートが広く用いられていることから、脳内ドパミンレベルの上昇、特に前頭葉皮質でのドパミンレベルの上昇が注意や衝動性等の実行機能において重要な役割を担うと考えられている[23, 51]。この作用機序については、D1 受容体が作業記憶等の実行機能に関わることが知られていることから、長らくドパミン D1 受容体を介していると考えられてきた[52, 53]。. （２）ドパミン D4 受容体と ADHD. 一方、D4 受容体についても認知機能との関連が研究されてきた。まず、実行機能を司る前頭葉皮質に D4 受容体が発現していることがげっ歯類、サル、ヒト. 31.

(33) において確かめられた [16, 54, 55]。また、D4 受容体の遺伝子多型と統合失調症や ADHD、依存症等の精神疾患発症との関連性について多くの研究がなされてきた[56]。D4 受容体遺伝子の 3 番目のエクソンには 48 塩基の variable number tandem repeat （VNTR）多型が存在し、各人で 2 から 11 回の繰り返し配列を有する[57]。7 回の繰り返し多型（DRD4-7 repeat, DRD4-7R）配列を持つ場合は、その他の多型に比べ ADHD の発症率がおよそ 1.4 倍有意に高まることが 2 つのメタ解析より明らかとなっている[26, 27]。この 48 塩基 VNTR は D4 受容体の細胞内 3 番目のループに相当し、DRD4-7R 多型は、最も共通して見られる DRD4-2R や-4R 多型に比べてドパミンに対する細胞内シグナル伝達強度が弱まることが報告されている[57, 58]。このことはドパミンの D4 受容体に対する応答性が低いと注意機能や行動抑制に障害が認められることを意味し、D4 受容体を刺激することでこれら実行機能を向上させる可能性を示唆するものである。実際にげっ歯類を用いた研究により、D4 受容体が注意機能や行動抑制に関与することがいくつか報告されてきた[59, 60, 61]。. （３）認知機能におけるガンマオシレーションの役割. 一方、ヒトの脳波研究から認知機能と特定の脳波との関連性が明らかとなってきた。ヒトにおいて脳波は電極をつけたキャップを頭皮上にかぶることで測定される。これにより大脳皮質上の神経細胞の電気的活動状態の総和として脳波が記録される。一般的に、脳波は図 10 のようにδ波（0.5-4 Hz）、θ波（4-8 Hz）、 α波（8-12 Hz）、β波（12-30 Hz）、γ波（30-80 Hz）という周波数帯域に分類される[62]。波形データを高速フーリエ変換（Fast Fourier Transform, FFT）を行うことで各成分の振幅や頻度を定量的に解析（quantitative EEG, qEEG）することが可能となる。例えば深い睡眠時（徐波睡眠）にはδ帯域のパワー値が上昇、安静時にはα帯域のパワー値が上昇するといったように特定の周波数帯域と生理学的意義との関連が考えられている。. 32.

(34) こうした脳波と生理学的意義との関連についてさらに研究が進められるにつれ、γ帯域と認知機能との関連が明らかになってきた[63, 64]。γ脳波帯域は、一般的に 30-80 Hz の高周波帯域に分類される脳波であり、古くはこのような高周波成分の脳波を測定することは不可能であった。しかし、脳波計測技術の発達により測定時間分解能が向上し 500 Hz 以上での高頻度サンプリングが可能になったことから、高周波数帯域での律動反応、すなわちガンマオシレーション（gamma oscillations）が様々な知覚・情報処理・認知機能と関わることが明らかとなってきた。例えば、ヒトやサルにおいて事象関連電位の測定（Event-Related Potentials, ERP：視覚・聴覚・体性感覚刺激を繰り返しそれら刺激提示と同時にタイミングをあわせて脳波を計測する方法）において、γ脳波帯域パワーの顕. 33.

(35) 著な増加が刺激呈示からおよそ 100 ms において認められ、これは誘発ガンマオシレーションと呼ばれる[65, 66]。このように感覚知覚情報のインプット過程においてガンマ脳波律動が上昇することから、脳内での情報処理過程においてガンマ帯域の活動は何らかの重要な働きをするのではないかと考えられてきた[63, 64]。さらに、後年になって知覚過程だけではなく注意、記憶、行動の抑制（Behavioral Inhibition）、学習等より高次な認知機能課題とも関連することが明らかとなってきた[63, 67, 68]。現在のところこのγ脳波律動は外部からインプットされる情報に対して、個体がその情報にどう対応しアウトプットすべきかを処理する際の皮質脳波活動を表すと考えられており、適切な認知機能を維持するのに重要な役割を担うと考えられている[63, 64]。. （４）精神疾患の中間表現系としてのガンマオシレーション. こうしたことから、様々な精神疾患においてガンマオシレーションの異常が報告されてきた[69]。なかでも、統合失調症[70, 71]、自閉症スペクトラム障害[72]、 ADHD[73, 74, 75, 76]といった実行機能に障害が認められる疾患において精力的に調べられてきている。ここではこれまでの ADHD 患者での知見について述べる。 Yordanova らは ADHD 児では聴覚 Oddball 課題時の誘発ガンマオシレーションに異常が認められることを 2001 年に報告している[73]。聴覚 Oddball 課題とは、周波数の異なる 2 種類の音刺激をランダムに被験者に呈示し、低頻度で出現するターゲット刺激時にはボタン押しを、高頻度で出現する非ターゲット刺激時には無視をすることを教示する実験パラダイムであり、被検者には注意及び行動抑制が要求される。本研究において刺激呈示と同期させ脳波計測を行うと、 ADHD 児群では前頭―中心領域の誘発γ帯域脳波パワーが典型発達児群に比べ増加していることが明らかとなった[73]。また、聴覚刺激 Oddball と Go/Nogo 課題を組み合わせた実験パラダイムにおいて、ADHD 患者群では健常人群に比べ前頭領域での誘発ガンマオシレーションの増加が認められるという同様の研究結果が Karch らから報告されている[74]。一方、課題負荷時だけではなく安静時のガンマ帯域律動についても ADHD 患者での異常が報告されている。Barry らは. 34.

(36) ADHD 児と典型発達児の安静閉眼時の脳波を比較した 2 つの研究結果を報告しており、別々の被検者を対象としたいずれの結果においても前頭領域を含む全脳領域において、ADHD 児では典型発達児に比べてガンマ脳波パワーが大きく減少していることを見出している[75, 76]。以上の知見をまとめると、典型発達児に比べ ADHD 児では、安静時にγ脳波が低下、注意や行動抑制に関連した課題遂行時にはγ脳波が増加するということが明らかとなっている。現在のところ、ADHD 児では健常児に比べ課題に対応するためより多くのエネルギー（ここではγ脳波の活性化）が必要であり、シグナル/ノイズ比（S:N 比）の異常が病態・行動の根源ではないかという仮説が考えられている[76]。. （５）D4 受容体によるガンマオシレーションの制御. 認知機能におけるγ脳波律動の解明が進むのと並行し、神経科学的、分子生物学的な側面からもγ脳波律動のメカニズムが解明されてきた。2009 年には Cardin らのグループから Parvalbumin（以下 PV）を発現する介在神経細胞（interneuron）がガンマオシレーションの発生に関与することを光遺伝学の技術を用いて証明した研究結果が Nature 誌に報告された[77]。この PV 陽性 interneuron は、抑制性神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸（gamma aminobutyric acid、GABA）を産生する神経細胞群の一種であるが、興奮性神経細胞である錐体細胞（Pyramidal neuron）間の情報伝達が適切に行われるよう制御的な役割を果たすと考えられており、この過程にガンマオシレーションが関わることが示唆されている[78]。 D4 受容体は、免疫組織化学的解析より大脳皮質や海馬の interneuron においてこの PV と共発現することが知られている[54, 79]。このことはドパミンが D4 受容体を介してガンマオシレーションを変化させる可能性を示唆するものである。実際、ラット海馬スライスを用いた in vitro の検討から、D4R 作動薬である PD168077 がカイニン酸誘発のガンマオシレーションを増幅し、この増幅が D4R 拮抗薬である L-745,870 によって減少することが報告されている[79]。さらに、（２）において述べた D4 受容体の遺伝子多型の一つ DRD4-7R を持つ被検者は. 35.

(37) それ以外の遺伝子多型をもつ被検者に比べ、Oddball 課題時の誘発ガンマオシレーションが有意に増加することが報告されている[66]。こうしたことから D4 受容体がγ脳波の制御において重要な役割を担うことが考えられる[78]。. 以上の背景データから、著者は D4 受容体の活性化が注意機能の改善と衝動性の正常化に結びつくのではないか、またその機序として前頭葉領域でのγ脳波の制御が関与するのではないかと考えた。これらのことを明らかにするため D4 受容体作動薬である Ro 10-5824[80]の注意・衝動性への効果及び前頭葉領域の脳波への効果について、コモンマーモセットを用いて評価した。. 36.

(38) 第２節. 実験方法. （１）使用動物. 日本クレア社より入手した合計 16 頭のコモンマーモセット（雄性 10 頭、雌性 6 頭）を本検討に用いた。各個体は個別飼育ケージにて温度（28 ± 2 °C）及び湿度（50 ± 20%）が制御された部屋において維持された。12 時間毎の明暗サイクルにて、摂餌は毎朝、自由摂水下で飼育された。全ての動物実験手順は大日本住友製薬株式会社動物実験委員会の承認を受けた。. （２）使用薬物. Ro 10-5824（図 11）[80]は大日本住友製薬株式会社にて合成、あるいは Tocris Bioscience 社より入手した化合物を用いた。L-745,870（図 12）[81]は Tocris Bioscience 社より入手した。全ての薬剤は実験日に生理食塩水にて溶解し、実験に用いた。. 37.

(39) （３）ORD 課題を用いた注意・衝動性に対する薬剤の効果検討. 既報[20, 25, 82]に従いコモンマーモセットを用いた ORD 課題を実施した。実験には 6 頭の個体（雄 3 頭、雌 3 頭、いずれも 3 年齢）を用いた。ORD 課題は、図 13 に示すように側面のうち 1 面だけが開放されている透明のアクリル製立方体（4 cm ×4 cm ×4 cm）を用いて行った。この中に報酬（0.5 g 程度のケーキ）を置き、ホームケージ内でマーモセットに提示をした。開放面に近い位置に報酬を置いた場合、開放面とは反対の位置に報酬を置いた場合をそれぞれ easy trial、 difficult trial とした。Easy trial の場合は開放面に手を伸ばすことで直接報酬を獲得できるが、Difficult trial の場合 detour（遠回り）をしなければ報酬を獲得できない。このような課題は、開放面を注意深く観察し、近い側面に手を伸ばして報酬を獲得しようとする衝動性を抑える（行動抑制）という一連の思考・行動が個体に要求される課題であり、脳が未発達な乳幼児では正しく課題を実行できないことが知られている[83]。いずれの試行においても 30 秒以内に壁面に手を振れることなく報酬を獲得できた場合、その試行を正答とみなした。実験を実施する前に各個体に対してホームケージ内で課題の訓練を行った。8-10 回程度の訓練を実施することで easy trial、difficult trial ともにそれぞれ 80%程度、50% 程度の正答率で安定した成績を示すことが既に報告されており[20]、本検討においても安定した成績を確認した後薬剤の評価を行った。. 38.

(40) 1 セッションに 9 回の easy trial、8 回の difficult trial を設定し、薬剤を投与しないセッション（drug-free session）及び薬剤（溶媒を含む）を投与したセッション（drug-treated session）を別々の日に設けた。2 つのセッション間での正答数の差を式（３）により計算し、この正答率の変化を指標として薬剤による作用を評価した。. 正答率の変化(%) = 100 ×. (𝑁𝑑𝑟𝑢𝑔−𝑡𝑟𝑒𝑎𝑡𝑒𝑑 − 𝑁𝑑𝑟𝑢𝑔−𝑓𝑟𝑒𝑒 ) 8 𝑜𝑟 9. ・・・式（３）. ここで Ndrug-treated 及び Ndrug-free はそれぞれ drug-treated session 及び drug-free session 時の正答数を示し、difficult trial では 8 を easy trial では 9 を分母として用いた。. 39.

(41) 薬剤の投与は、溶媒である生理食塩水（Saline）または Ro 10-5824（0.3, 1, 3 mg/kg）を 0.5 mL/kg にて課題の 1 時間前に大腿筋より筋肉注射にて行った。各個体の実験は 1 週間以上の休薬期間を設け、薬剤の投与順をランダム化し、クロスオーバーデザインにて実施した。また薬剤の投与実施者と ORD 課題の実施者を別に設定し、盲検化した状態で評価を行った。. （４）定量脳波試験を用いた薬剤の脳波周波数帯域パワーへの効果検討. 5 頭のマーモセット（雄 4 頭、雌 1 頭、2.5-5 年齢）を用いた。各個体に対して EEG 電極を頭蓋内に埋め込む外科手術を実施した。外科手術はケタミンーキシラジン及びキシロカインによる麻酔鎮痛下で実施した。図 14 に示すように両側の前頭領域（ブレグマからの距離：anterior–posterior (AP) = 12.5 mm, lateral (Lat) = ±3.0 mm）を含む計 5 か所の頭蓋内に EEG 電極を配置した。参照電極を頭頂付近（ブレグマからの距離：AP = −4.0 mm, Lat = −4.0 mm）に配置した。設置した電極を保護するためアクリル製の箱を頭蓋にとりつけ、これら電極とアクリル箱を歯科用セメントで固定した。外科手術の後は、抗生物質を投与しながら 10 日間以上のホームケージ内での回復期間を設けた。脳波測定は図 14 に示すように防音箱（75 cm ×70 cm ×60 cm）内で実施する必要があるため、実験実施の前に脳波測定環境への馴化を行った。馴化の際は脳波を記録せず 1 時間個体を防音箱に入れ、これを少なくとも 3 回以上実施した。EEG シグナルは Triangle Biosystems 社の NeuroWare®を用いてワイヤレスにて 512 Hz でコンピュータに送信し、データはキッセイコムテック社の VitalRecorder®を用いて記録した。. 実験の際は、ホームケージよりマーモセットを防音箱の中に移動させ、毎回 30 分間のさらなる馴化期間を設け、その後薬剤投与前の脳波を 30 分間記録した。その後、生理食塩水もしくは Ro 10-5824 （1, 3 mg/kg）、L-745,870（10 mg/kg）を 0.5 mL/kg にて大腿筋より筋肉注射し、続いて薬剤投与後の脳波記録を 80 分間行った。拮抗薬前処置の実験においては、30 分間の馴化、30 分間の薬剤投与前の脳波記録の後、生理食塩水あるいは L-745,870 を大腿筋より筋肉注射し、5 分後に反対側の大腿筋より生理食塩水あるいは Ro 10-5824 を投与し、その後 90. 40.