福岡県工業技術センター 研究報告 No.29 (2019)
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タデスプラウト抽出物によるコラゲナーゼ阻害
川口 友彰*1 永田 香織*2
Collagenase inhibition by water-pepper (Polygonum hydropiper L.) sprout extract
Tomoaki Kawaguchi and Kaori Nagata
コラーゲンは皮膚のハリや弾性に重要な役割を有しており，コラーゲンの減少や変性がシワの形成に寄与してい ると考えられている。コラーゲンの減少にはコラゲナーゼが関与していることから，コラゲナーゼ活性阻害剤が皮 膚の弾性維持やシワ形成抑制に有用であると考えられる。そこで本研究では ，抗シワ食品素材の開発を目的とし，
タデスプラウトのコラゲナーゼ阻害活性評価及び活性成分同定を行った。タデスプラウトメタノール抽出物のコラ ゲナーゼ阻害活性を調べたところ，濃度依存的阻害が認められた。阻害活性を指標にコラゲナーゼ阻害成分を単離 し，quercetin-3-O-galactoside（ヒペロシド）と同定した。Lineweaver-Burkプロットにより，ヒペロシドのコラ ゲナーゼ阻害様式は不競合阻害であることがわかった。
1 はじめに
コラーゲンは細胞外マトリクスの主要成分の一つで あり，皮膚のハリや弾性形成に貢献している。コラゲ ナーゼはコラーゲンを分解するマトリクスメタロプロ テアーゼであり，生体内のコラーゲンターンオーバー に重要な役割を果たしている。一方で，炎症や紫外線 照射された皮膚において観察される過剰なコラゲナー ゼが，シワの形成に関与することが示唆されている。
そのため，シワ形成抑制剤として，コラゲナーゼ阻害 作用を有する食品の開発が行われている。
タデスプラウトは，刺身のツマとして利用され，福 岡県朝倉市で全国の4分の3が生産されている。タデス プラウトは，抗酸化活性，チロシナーゼ阻害活性等の 機能性を有し，ポリゴジアール等の機能性成分を含む ことが報告されている。一方，これまでにタデスプラ ウトのコラゲナーゼ阻害活性に関する検討はなされて いない。そこで本研究では，タデスプラウトのコラゲ ナーゼ阻害活性評価及びコラゲナーゼ阻害成分の同定 を試みた。
2 研究，実験方法 2-1 試料
タデスプラウトは(株)エヌ・エル・エーがJA筑前あ さくらより入手し，乾燥粉末とした。乾燥粉末30 gに 300 mLのメタノールを加え，室温で1時間攪拌抽出し
た。水-ブタノール分配，HP-20カラムクロマトグラフ ィ（溶出 ：水， 25 %メ タノ ール，50 %メタ ノール ， 75 %メタノール，メタノール），高速液体クロマトグ ラフィにより分画した。
2-2 コラゲナーゼ阻害活性評価
種々濃度の試料存在下で，10 µg/mL コラゲナーゼ と0.4 mM Pz-ペプチドを37 ℃30分反応させた（溶液 条件：0.1 M Tris-HCl, 20 mM CaCl2, pH 7.1）。クエ ン酸で反応停止後，酢酸エチルで反応産物を抽出し，
320 nmの吸収を測定した。対照には，試料溶液の代わ りに試料溶媒を用い，また，それぞれのブランクとし て，酵素溶液の代わりに緩衝液を加えて同様の操作を 行った。これらの吸光度からコラゲナーゼ活性阻害率 を算出した。
2-3 分析
活 性 成 分 の 吸 収 ・ マ ス ス ペ ク ト ル は Agilent 1200 series HPLCのフォトダイオードアレー検出器及び質 量分析計（イオン化：ESI）により測定した。カラム は Agilent Poroschell 120 EC-C18 column (4.6 mm
× 50 mm, 2.7 µm)を用いた。溶離液は(A)0.1 %ギ酸，
(B)アセトニトリルを用い，5 %Bを10分維持したのち，
5～45 %Bのグラジエント溶出を60分で行った。流速は 0.5 mL/minとした。
3 結果と考察
3-1 タデスプラウトのコラゲナーゼ阻害活性と活性成分の
*1 生物食品研究所 分画
*2 （株）エヌ・エル・エー
福岡県工業技術センター 研究報告 No.29 (2019)
- 48 - タデスプラウトメタノール抽出物のコラゲナーゼ阻 害活性を評価したところ，濃度依存的な阻害を示した
（IC50＝156.7 µg/mL）。コラゲナーゼ阻害成分の単離 同定のため，水-ブタノール分配及びHP-20カラムクロ マトグラフィで分画した。その結果，ブタノール可溶 性画分のHP-20カラム50 %メタノール溶出画分に活性
（IC50＝23.5 µg/mL）が認められた。この画分をさら にHPLCにより分画し，得られた各画分のコラゲナーゼ 阻害活性を評価した結果を図1に示す。画分8（保持時 間28～32分），画分8中のピーク2に活性が認められた ことから，ピーク2の成分がタデスプラウトメタノー ル抽出物中の活性成分であることがわかった。
図1 コラゲナーゼ阻害活性のHPLCプロファイリング a：各画分のコラゲナーゼ阻害活性評価結果，
b：分取時のクロマトグラム
3-2 コラゲナーゼ阻害活性成分の同定
活性が認められたピーク2を単離し，保持時間・吸 収・マススペクトルから成分同定を試みた。その結果，
得られた活性成分の各特性（図2a）はケルセチン配糖 体であることをしめし，標準試薬との比較（図2b）で は，quercetin-3-O-galactoside（ ヒペロ シド） と 一 致した。さらに同一性をコラゲナーゼ阻害活性により 評価した とこ ろ ，単 離成分 （IC50＝1.9 µg/mL）と ヒ ペロシド （IC50＝ 1.7 µg/mL）で同等 であ ること がわ かった。以上の結果から，タデスプラウトメタノール 抽出物のコラゲナーゼ阻害成分はヒペロシドであるこ とがわかった。ヒペロシドの阻害様式をLineweaver-
Burkプロットにより調べたところ，不競合阻害である ことがわかった。
図2 単離成分 と標準試薬 の LC-DAD-MSクロマト グラム及び吸収・マススペクトル
a：単離成分，b：ヒペロシド
4 まとめ
タデスプラウトのコラゲナーゼ阻害活性評価を行い，
コラゲナーゼ阻害活性を有すること，その活性成分は ヒペロシドであることを明らかとした。この結果，タ デスプラウトがコラゲナーゼ阻害作用を有する抗シワ 食品素材として有望であることがわかった。
5 掲載文献
1) Journal of Herbmed Pharmacology, Vol. 8, No.
2, pp. 114-119 (2019)
