Age-related Menory Impairment and Hippocampal Damage in ddY Male Mice

Exp. Anim. 43(5), 697-702,1995

Age-related

Memory

Impairment

and Hippocampal

Damage

in ddY Male Mice

Masahiro TANAKA, Akimune ASANUMA, Junya IKUTA*, Hideki YAMADA,

Sadahiro SHIMIZU*, Teruji KOGA, and Tomofumi KAKISHITA

Kowa Co. Ltd., Fuji Research Laboratories,

321-1 Ohnoshinden,

Fuji, Shizuoka 417, and

* Tokyo Research Laboratories,

2-17-43 Noguchicho, Higashirnurayarna,

Tokyo 189, Japan

(Received 30 September 1994/Accepted 9 January 1995)

The relationship between behavioral change and hippocampal lesion was studied in ddY male mice, at 4.5, 20, 40 and 60 weeks of age. In passive avoidance response, the aging mice (40 and 60 weeks of age) showed shorter latency than young mice (4.5 weeks of age). The degenerated pyramidal cells were more numerous after 40 weeks of age in the CA3 than CA 1. The mean incidence of the degenerated pyramidal cells in the CA3 was 20.8% at 60 weeks of age. In 71.9% of mice, impairment of passive avoidance response was associated well with hippocampal lesions. These results indicate that the hippocampas plays some role in the memory in mice. The ddY mice may be possible to use as models for reversible hippocampal lesion. •\KEY WORDS: aging mice, hippocampal lesion, memory impairment

ddY系 雄 マ ウスの加 齢 に伴 う記憶 障害 と海 馬神経 細胞 の 変性

田 中 雅 弘 ・浅 沼 章 宗 ・生 田 殉 也*・ 山 田 英 樹 清 水 貞 宏*・ 古 賀 照 二 ・垣 下 奉 史

興和 株式 会社 富士研 究所

*東 京研 究所

ヒ トの 記 憶 機 能 に は 海 馬 を 含 む 大 脳 辺 縁 系 が 強 く 関 与 し て い る こ と は よ く 知 ら れ て い る[13.18,22. 26]。 一 方,高 次 中 枢 機 能 を 持 た な い と さ れ て い る ゲ ッ 歯 類 で も 学 習 能 あ る い は 海 馬 神 経 細 胞 の 変 化 に 関 し て 多 くの 報 告 が あ る が[5,6,15.17,20],両 者 の 関 連 性 に つ い て は 否 定 的 な 意 見 も あ り議 論 の 多 い 所 で あ る[10,11]。 ま た 加 齢 と 海 馬 神 経 細 胞 との 関 係 に つ い て 詳 細 に 検 討 した 動 物 実 験 は 少 な い[17]。 特 に マ ウ ス で は 加 齢 に 伴 う学 習 能 の 低 下 と 海 馬 神 経 細 胞 変 化 と の 関 連 に つ い て 詳 細 に 検 討 した 報 告 は 見 当 た ら な い 。そ こ で 今 回,我 々 は バ リ ヤ ー シ ス テ ム 環 境 下 で マ ウ ス を 飼 育 し,加 齢 に 伴 う行 動 薬 理 学 的 変 化 と 海 馬 神 経 細 胞 の 組 織 学 的 変 化 と の 関 連 に つ い て 検 討 した の で 報 告 す る。

材 料 お よび 方 法

実 験 に は4.5(N=17),20(N=19),40(N=14)お よ び60週 齢(N=12)のSlc:ddY系 雄 マ ウ ス(日 本 エ ス エ ル シ ー)62匹 を 用 い,各 週 齢 で 一 試 行 性 受 動 的 回 避 反 応 に よ る 行 動 薬 理 学 的 検 査 を 実 施 し た 。 回 避 反 応 試 験 に は 明 箱 と 暗 箱 よ りな るstep-through式 受 動 的 回 避 訓 練 箱 を 用 い た 。 明 箱 中 央 に マ ウ ス を ゲ ー ト と 反 対 側 に 頭 部 を 向 け て 静 置 し,暗 室 内 に マ ウ ス が 移 動 し た 直 後 に 床 グ リ ッ ド を 介 し て 矩 形 波 電 流(10 mA,0.4 ms,50 cps)に よ る シ ョ ッ ク を与 え,回 避 反 応 を獲 得 させ た 。な お 暗 室 内 へ の 移 動 時 間(獲 得 試 行 で の 反 応 潜 時)が60秒 以 上 の 動 物 お よ び 一 般 状 態 が 良

698 田 中雅 弘 ・浅 沼 章 宗 ・生 田 殉 也 他 好 で な い 動 物 は 本 実 験 か ら 除 外 し た 。 回 避 反 応 獲 得 24時 間 後 に 再 び 明 室 内 に マ ウ ス を 静 置 し,暗 室 に 移 動 す る ま で の 時 間(テ ス ト試 行 で の 反 応 潜 時)を 測 定 し,こ の 値 を 記 憶 能 の 指 標 と し た 。テ ス ト試 行 で は 反 応 潜 時 を 最 大600秒 まで 測 定 し た 。行 動 薬 理 学 的 検 査 終 了 後,20,40お よ び60週 齢 マ ウ ス に つ い て 無 作 為 に10匹(60週 齢 で は12匹)の 動 物 を 選 び,エ ー テ ル 麻 酔 下 で,脳 を摘 出 し10%中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン で 固 定 し た 。 そ の 後,Sidman[19]の マ ウ ス脳 解 剖 図 譜 に 従 い,背 側 海 馬 を通 る面 で 脳 を横 断 し,常 法 に 従 い 組 織 切 片 を作 製 した 。切 片 に は ヘ マ トキ シ リ ン ・エ オ ジ ン(HE)お よ び ク リ ュ ー バ ー バ レ ラ(KB)染 色 を 施 し,Fig.1に 示 し た 海 馬 のCA1お よ びCA3の 領 域 に つ い て 顕 微 鏡 下 で0.25mm当 た りの 神 経 細 胞 数(総 神 経 細 胞 数 お よ び 変 性 神 経 細 胞 数)を 算 出 した 。 な お 今 回 の 実 験 で は 変 性 神 経 細 胞 の 定 義 を 核 お よ び 胞 体 が 萎 縮 し,ヘ マ トキ シ リ ン に濃 染 す る細 胞 と した 。 ま た60 週 齢 の 動 物 で は 海 馬 領 域 の 一 部 を2.5%グ ル ター ル ア ル デ ヒ ド液 で 前 固 定 し,次 に1%オ ス ミ ウ ム 酸 で 後 固 定 した の ち,エ ポ ン812樹 脂 に 包 埋 し た 。 超 薄 切 片 作 製 後,酢 酸 ウ ラ ン と ク エ ン酸 鉛 の 二 重 染 色 を 施 し,透 過 型 電 子 顕 微 鏡(JEM-100SX,日 本 電 子)で 観 察 した 。

テ ス ト試 行 で の 反応 潜 時 が200秒 以 下 の もの を記

憶 障 害個 体,CA1あ

るい はCA3領

域 で の変 性 神経 細

胞 の 出現 頻度 が5%以 上 の もの を海馬組 織 障害 個体 と

し,各 個 体 を 〔

記憶 障害,海 馬組 織 障 害〕 群,〔 記 憶

障 害,海 馬組 織 正常 〕群,〔 記憶 正常,海 馬組織 障 害〕

群,〔 記憶 正 常,海 馬組 織 正常 〕 群 の4グ ルー プ に分

類 し,形 態 学 的変 化 と行 動 薬 理学 的変 化 との 関連 を

検 討 した。

回 避 反 応 試 験 の 潜 時 お よ び 変 性 神 経 細 胞 の 出 現 頻 度 に お け る 統 計 的 有 意 差 はKruska1-Wallisの 検 定 後, Sheffeの 検 定 に よ っ て 求 め,危 険 率5%以 下 を 有 意 と判 定 し た 。

成

績

1.行 動 薬 理 学 的 検 査 獲 得 試 行 の 反 応 潜 時 は60週 齢 で 軽 度 な 延 長 傾 向 が 認 め ら れ た が,4.5週 齢 と の 間 に 有 意 差 は 認 め られ な か っ た 。 一 方,テ ス ト試 行 に お け る 平 均 反 応 潜 時 は 4.5,20,40お よ び60週 齢 で そ れ ぞ れ361±40秒,202 ±31秒,128±40秒 お よ び123±30秒 と20週 齢 か ら 短 縮 傾 向 が み ら れ,40週 齢 お よ び60週 齢 で は4.5週 齢 と 比 較 し有 意 な 短 縮 が 認 め ら れ た(Fig.2)。

2.変 性 神 経細 胞 の出現 率

海 馬 の 正 常 錐 体 神 経 細 胞 は 大 型 で 円 形 の 核 と 豊 富 な 細 胞 質 を 有 し て い た 。40週 齢 以 上 の マ ウ ス の 海 馬 で は 核 お よ び 胞 体 が 萎 縮 し,KB染 色 で 紫 色 に濃 染 す る 変 性 錐 体 細 胞 の 出 現 が 目立 っ た が,海 馬 全 体 の 構 築 は 保 た れ て お り,脳 血 管 障 害 お よ び 神 経 細 胞 の 壊 死 に よ る 脱 落 は認 め ら れ な か っ た(Fig.3)。 電 顕 所 見 で は 変 性 錐 体 細 胞 の 核 は 不 整 形 に 萎 縮 し,ミ トコ ン ド リ ア の 腫 大 お よ び リ ポ フ ス チ ン の 増 加 が 認 め ら れ た(Fig.4)。 変 性 錐 体 細 胞 数 はCA1お よ びCA3領 域

Fig. 1. Diagram of coronal section (left) and standard section of hippocampus (right). Two frames (CAI, CA3)

indicate the area chosen for cell counting.

Fig. 2. Influence of ageing on the mean latency at the test trial in a passive-avoidance situation. Each column and vertical bar represents a mean •}SE. *: significantly different from 4.5 weeks old (P<0.05).

699 マ ウ ス の 加 齢 に伴 う海 馬 障 害 の い ず れ に お い て も 加 齢 に 伴 い 増 加 し た が,CA1領 域 に 比 べCA3領 域 で 顕 著 で あ っ た 。 特 に60週 齢 (20.8%)で は20週 齢(3.4%)の もの と比 較 し,CA3 領 域 で の 変 性 錐 体 細 胞 が 有 意 に 増 加 し て い た (Fig.5)。 またCA3領 域 に お い て 総 錐 体 神 経 細 胞 数 の 5%以 上 が 変 性 錐 体 細 胞 で あ っ た 個 体 の 出 現 頻 度 は20 週 齢 お よ び40週 齢 で そ れ ぞ れ20%,70%と 加 齢 に 伴 い 高 く な り,60週 齢 で は す べ て の 個 体 で 変 性 錐 体 細 胞 が5%以 上 認 め ら れ た(Fig.6)。 な お 総 錐 体 神 経 細 胞 数 に つ い て は 各 週 齢 間 に一 定 の 傾 向 は 認 め られ ず, 60週 齢 の マ ウ ス で も壊 死 に よ る 神 経 細 胞 の 脱 落 は 観 察 さ れ な か っ た 。

3.行 動薬 理 学 的 変化 と海 馬 神経 細 胞 の組 織 学 的変

化 との関連

個 別 の 値 に お い て は,反 応 潜 時 と 変 性 細 胞 出 現 率 の 間 に 良 好 な 相 関 性 は 認 め ら れ な か っ た(R=0.07)。 しか し な が ら,回 避 反 応 試 験 の 結 果 と海 馬 の 形 態 変 化 が 一 致 し た 二 つ の グ ル ー プ,す な わ ち 〔記 憶 障 害

Fig. 3. Sixty-week old mouse. Atrophic change of the CA3 subfield of the hippocampus. Kluver-Barrera•fs stain. •~ 400.

Fig. 4. Electron micrograph of the degenerated pyramidal cells containing enlarged mitochondria and lipofuscin deposit. •~ 3000.

700

田 中 雅 弘 ・浅 沼 章 宗 ・生 田 殉 也 他 Fig. 5. Incidence of degenerating pyramidal cells in hippocampal CAl and CA3 regions. Each column and

vertical bar represents mean and S.E., respectively. *: significantly different from 20 weeks old (P<0.05).

Fig. 6. Incidence of animals with degenerating pyramidal cells (more than 5%) in hippocampal CA3 region.

(潜 時200秒 ≧),海 馬 組 織 障 害(変 性 細 胞5%≦)〕 群 お よ び 〔記 憶 正 常(200秒 〈),海 馬 組 織 正 常(5%〉)〕 群 が 全 体 に 占 め る 割 合 は そ れ ぞ れ56.3%,15.6%で あ っ た 。両 者 を 合 わ せ る と71.9%の 動 物 が 回 避 反 応 試 験 結 果 と 海 馬 の 形 態 学 的 検 査 結 果 が 一 致 す る グ ル ー プ に 属 して い た(Fig.7)。

考

察

健 忘 症 患 者で は 海馬CA1領

域 に限 局 した病 変 が み

られ るこ とや[26],海

馬 障害 モ デ ル動 物 で学 習 能 の

低 下 が 報 告 され て い る こ と[1,21,25]な ど か ら,海 馬 と 学 習 記 憶 と は 深 く関 係 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る 。 一 方 ,記 憶 に 関 連 す る 脳 の 器 質 的 変 化 を 高 次 中 枢 機 能 を 持 た な い ゲ ッ歯 類 で 再 現 さ せ る こ と に は 多 く の 問 題 が 残 さ れ て お り,ゲ ッ歯 類 で の 学 習 ・記 憶 能 と 海 馬 と の 相 関 関 係 に つ い て は 否 定 的 な 意 見 も あ る[10]。 Zola-Morganら[26]は 健 忘 症 を 呈 した 患 者 で はCA1 領 域 の 神 経 細 胞 が 選 択 的 壊 死 に 陥 っ て い る こ と を報 告 して い る 。 ま た 脳 虚 血 モ デ ル 動 物 で はCA1領 域 が 選 択 的 に壊 死 し錐 体 細 胞 数 の 減 少 を 起 こ す,い わ ゆ る 遅 発 性 神 経 細 胞 壊 死 が 良 く 知 ら れ て い る[7,21, 24]。 一 方,今 回 の 実 験 で は 変 性 神 経 細 胞 数 はCAl領 域 に比 べCA3領 域 で 顕 著 で あ っ た 。 こ の 結 果 は9ヵ 月 齢 のCWlマ ウ ス で は 神 経 細 胞 の 占 め る 面 積 お よ び一 個 当 た りの 細 胞 面 積 がCA3領 域 で 減 少 す る と い う Kadarら[6]の 報 告 と類 似 して い た。 ヒ トで はCA3領 域 は ア ル ツ ハ イマ ー 神 経 原 線 維 変 化 を 起 こ し や す い 部 位 で あ る と も言 わ れ て お り[4],今 回 認 め ら れ た 海 馬 神 経 細 胞 の 変 性 に は 加 齢 に よ る 循 環 障 害 の 他 に CA3領 域 の 解 剖 生 理 学 的 特 徴 な ど が 関 与 し て い る も の と推 察 さ れ た 。 神 経 細 胞 数 は 加 齢 に 伴 い 確 実 に 減 少 し,最 終 的 に は グ リ ア細 胞 で 置 き換 え ら れ る とい わ れ て い る[22]。 ま た ラ ッ トで は 加 齢 に よ り脳 の 血 行 障 害 に よ る 海 馬 領 域 の 壊 死 が 報 告 さ れ て い る が[2],今 回 の 実 験 で は 海 馬 領 域 の 総 神 経 細 胞 数 に は 各 週 齢 間 に 一 定 の 傾 向 は 認 め ら れ ず,60週 齢 の マ ウ ス で も 壊 死 に よ る 神 経

701

マ ウ ス の 加 齢 に 伴 う海 馬 障 害

Fig. 7. Relationship between the latency in a passive avoidance test and the incidence of degenerating pyramidal cell. 細 胞 の 脱 落 は 観 察 さ れ な か っ た 。 神 経 細 胞 の 機 能 を 形 態 学 的 所 見 か ら の み 判 断 す る こ と は 困 難 で あ る が, 今 回 観 察 し た 神 経 細 胞 の 濃 染 お よ び 萎 縮 と い っ た 変 化 は 軽 度 で あ れ ば 回 復 す る 可 能 性 が あ る と い わ れ て い る[23]。 した が っ て,こ の 変 化 が 顕 著 に 発 現 す る60 週 齢 前 後 の 加 齢 マ ウ ス は 可 逆 性 の 海 馬 障 害 モ デ ル と し て 利 用 で き る 可 能 性 が 考 え ら れ る。 動 物 実 験 で の 学 習 行 動 を 詳 細 に 解 析 す る に は 複 雑 な 学 習 課 題 を 用 い る 必 要 が あ る と い わ れ て い る[8, 12,14]。 事 実,簡 便 な 方 法 と し て 広 く用 い ら れ て い る 受 動 的 回 避 反 応 試 験 で は,そ の 安 定 性 ・再 現 性 に 問 題 が あ る と指 摘 さ れ て い る[3,9,16]。 ま た 老 齢 動 物 で は 様 々 な 刺 激 に 対 し生 理 的 反 応 が 変 化 し て い る 可 能 性 が あ り,潜 時 の 短 縮 が 単 純 に 記 憶 能 の 低 下 を 意 味 し て い る と は 言 え な い が,今 回 の 回 避 反 応 試 験 の 反 応 潜 時(テ ス ト試 行 時)は4.5週 齢 の361秒 に 対 し20, 40お よ び60週 齢 で は そ れ ぞ れ202秒,128秒,123秒 と短 縮 し,反 応 潜 時 の 経 時 的 な 短 縮 が 認 め ら れ た 。 こ の こ と は 今 回 の 反 応 潜 時 の 短 縮 が 感 覚 機 能 や 運 動 機 能 の 障 害 に 起 因 す る 可 能 性 よ り記 憶 能 障 害 に よ る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 唆 して い た 。

今 回,加 齢性 変化 が顕 著 に な る前 の20週 齢 時 にお

け る反応 潜 時 と変性 細 胞 出現 率 の 平均 値 を参 考 に し

て,記 憶 障害 お よび海馬組 織 障害 の基 準 を設 け,動 物

を分 類 した と こ ろ71.9%の 個体 で 両 障 害 の有 無 が

一致 し た 。 こ の 結 果 は 記 憶 能 に は 海 馬 の 形 態 学 的 変 化 が 強 く関 与 し て い る と い う こ れ ま で の 説[1,21,25]を 強 く支 持 す る もの で あ っ た 。 し か し,行 動 薬 理 学 的 変 化 と 海 馬 の 形 態 学 的 変 化 と は す べ て の 個 体 で 一 致 し た わ け で は な く,加 齢 に よ る 脳 の 障 害 に つ い て は 今 後 の 研 究 が 必 要 と思 わ れ る 。

要

約

ddY系 雄 マ ウ ス(4.5,20,40お よ び60週 齢)を 用 い 条 件 回 避 反 応 に よ る 行 動 薬 理 学 的 変 化 と海 馬 神 経 細 胞 の 病 理 組 織 学 的 変 化 と の 関 連 性 に つ い て 経 時 的 な 検 討 を 行 っ た 。 回 避 反 応 試 験 に お い て40週 齢 以 上 の マ ウ ス の 潜 時 は 若 週 齢 マ ウ ス(4.5週 齢)に 比 べ 短 縮 した 。 海 馬 錐 体 細 胞 の 変 性 が40週 齢 以 上 で 著 し く 増 加 し,変 性 細 胞 はCA1に 比 べCA3で 顕 著 で あ っ た 。 60週 齢 マ ウ ス のCA3領 域 の 変 性 神 経 細 胞 の 出 現 率 は 20.8%で あ っ た 。 さ ら に71.9%の 動 物 で 行 動 薬 理 学 的 検 査(受 動 的 回避 反 応)の 成 績 と 海 馬 の 形 態 学 的 変 化 と の 間 に 関 連 性 が 認 め ら れ た 。 こ れ らの 結 果 は マ ウ ス の 加 齢 に 伴 う 記 憶 障 害 に も 海 馬 が 重 要 な 役 割 を 果 た して い る事 を示 して い た 。 ま た,海 馬 の 変 化 は 致 命 的 な も の で は 無 か っ た こ と か ら,60週 齢 前 後 のddY 系 マ ウ ス は 可 逆 性 の 海 馬 神 経 細 胞 障 害 モ デ ル と し て 利 用 で きる 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

70 2 田 中 雅 弘 ・浅 沼 章 宗 ・生 田 殉 也 他

本論 文 の作 成 に あ た って,病 理 組 織 標 本 作製 を担

当 して下 さった萩 原(旧 姓,野 辺)博 子 氏 に感 謝致 し

ます。

文

献

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