耳鼻61（補）2015

EBV 関連バイオマーカーによる上咽頭癌の治療効果・予後判定

脇 坂 尚 宏 ・ 平 井 信 行 ・ 近 藤

悟

吉 崎 智 一

ほとんどの上咽頭癌で Epstein-Barr ウイルス（EBV）が発癌や進行に関与している。 欧米での標準治療は、化学放射線同時併用療法＋補助化学療法であるが、補助化学療法ま で含めた治療完遂率は 55％と低くメタアナリシスにおいてもその有効性は示されてはい ない。一方で、EBV-DNA（BamHI-W 断片）をバイオマーカーとして再発リスクが高い 症例にのみ補助化学療法を施行する臨床試験が海外で進行中である。近年、エクソソーム と呼ばれる小胞が細胞中の RNA やタンパク質を内包し、細胞外へ放出され細胞間メッセ ンジャーとして機能していることが判明した。エクソソームは生きた細胞から放出され、 内包されている RNA は血液中でも安定に存在することができる。そこで、上咽頭癌患者 血 清 の エ ク ソ ソ ー ム 中 に EBV に 特 異 的 な RNA で あ る EBV-encoded small RNAs （EBERs）が内包されているか検討し、さらに、上咽頭癌治療後の効果判定、予後予測に関 して既存の画像診断やバイオマーカーと比較し鋭敏な指標となるか話題提供することに した。

Key words：上咽頭癌、バイオマーカー、Epstein-Barr ウイルス、リキッド・バイオプシー、治療効果判定

は じ め に

上咽頭は顔面深部にあり、周囲には内頸動脈や

海綿静脈洞、頭蓋底、脳神経など狭い領域に重要

臓器がひしめいているため、一般に外科的アプ

ローチは困難である。病理組織学的には角化を伴

わない癌や未分化癌が大多数を占めるため、放射

線への感受性が高い。初期には症状が乏しく、リ

ンパ節転移や脳神経症状を呈してから医療機関を

受診するため進行癌の状態で診断されることが多

い。また、治療後の遠隔転移の頻度は約 25％と高

く、そのため化学療法の放射線増感作用による局

所制御の向上と十分な強度の化学療法による遠隔

転移の制御が肝要である

1)

_。

上咽頭癌の欧米での標準治療は Al-Sarraf らの

Intergroup Study 0099（IGS 0099）に準じた治療

である（図 1 )

2)

_{。本プロトコールの補助化学療法}

を含めた治療完遂率は 55％と低く、また、化学放

射線療法を補助化学療法の有無で検討した比較試

験では補助化学療法は生存率を改善しないことが

示された

3)

_{。この結果は、全症例に補助化学療法}

を行うことは臨床的に意義がなく、少なくとも治

療後に再発リスクが高い症例にのみ補助化学療法

を行うことが経済的・時間的にも治療毒性からみ

ても患者の負担軽減に繋がる可能性があることを

示しており、治療後に再発リスクが高い症例を確

実に抽出することには大きな意義がある。

上咽頭癌は大多数で、Epstein-Barr ウイルス

（EBV）の潜伏感染が発癌に密接に関与する腫瘍

である。そのため上咽頭癌では、EBV-encoded

small RNAs（EBERs）を始め、いくつかの EBV

関連因子が発現しており、血清中では EBV 関連

金沢大学医学部耳鼻咽喉科・頭頸部外科

抗体価が高値となる

4)

_。

本稿では、上咽頭癌治療後の腫瘍遺残のスク

リーニングについて EBV 関連バイオマーカーの

視点から現状を述べ、さらに、われわれが現在取

り組んでいる EBERs 核酸（DNA + RNA）のコ

ピー数定量について話題提供する。

対象と方法

1 ．EBV 抗体価と予後に関する検討

当科で加療した EBERs 陽性上咽頭癌 24 例に

つ い て 治 療 後 の EBV 抗 体 価（VCA-IgG、

VCA-IgA）と腫瘍の再発・遺残の有無について

Mann-Whitney U-test で検討した。

2 ．

18

_{FDG-PET と予後に関する検討}

11 例 に つ い て 治 療 後 の 腫 瘍 原 発 巣 の SUV

（standard uptake value）の最大値（SUVmax）、

関心領域内の閾値以上の容積 MTV（metabolic

tumor volume）、MTV と関心領域内の SUV の平

均 値（SUVnean）の 積 TLG（total lesion

gly-colysis）を算出し、腫瘍再発の有無と再発部位に

ついて検討した。

3 ．血 清 EBV-DNA（BamHI-W、EBERs）と

EBV-核酸（EBERs-DNA + RNA）コピー数

の定量

血清 500 μℓから核酸（DNA および RNA）を

抽 出 し た。EBV-DNA の 定 量 に は BamHI-W、

EBER1、EBER2 にそれぞれ特異的なプライマー

を用いて定量的リアルタイム PCR による解析を

行った。EBV-核酸の定量には逆転写処理をして

RNA を cDNA に変換した上で、EBER1、EBER2

について解析した。当科で治療した上咽頭癌症例

8 例 に つ い て、血 清 1mℓ あ た り の EBV-DNA

（BamHI-W、EBERs）と EBV-核酸（EBERs）コ

ピー数として定量した。6 例については治療前後

のコピー数を示した。

結

果

1 ．EBV 抗体価と予後に関する検討

24 例中 11 例で再発・遺残を認めた。再発・遺

残の有無で EBV 抗体価に有意差は認めなかった

（図 2 ）。

2 ．

18

_{FDG-PET と予後に関する検討}

SUVmax、MTV、TLG の計測結果を図 3 に示

す。完全寛解（CR）を維持している症例で各指標

が高値のものがあり、治療後の

18

_{FDG-PET は予}

後の有意な指標とはならないことが判明した。

3 ．血 清 EBV-DNA（BamHI-W、EBERs）と

EBV-核酸（EBERs）コピー数の定量

患者の TNM 分類と計測結果、治療結果を表 1

に示す。治療後 CR を継続している症例では、い

図 1 上咽頭癌の治療（欧米の標準治療：Intergroup Study 0099）

図 2 EBV 抗体価と予後

24 例について再発・遺残の有無と治療後の VCA-IgG、IgA について検討した。 11 例で再発・遺残を認めた。両者に明らかな相関は認めなかった。

図 3 治療後の18_{FDG-PET の指標による予後評価}

ずれも治療後の EBV-DNA、EBV-核酸のコピー

数は 0 であった。腫瘍が明らかに残存した 3 例の

うち、症例 1 では治療後も EBV-DNA、EBV-核

酸は同定されていた。ただし、遠隔再発した症例

6 は EBER2-DNA、EBER2-核酸が同定されず、

同 じ く 遠 隔 再 発 し た 症 例 8 で は EBV-DNA、

EBV-核酸ともに治療後は同定されなかった。

考

察

上咽頭癌は欧米では IGS 0099 に準じて、化学

放射線療法後に補助化学療法を行うのが標準的で

ある

2)

_{。しかし、長期にわたる入院が必要であり、}

図 4 われわれが想定する上咽頭癌治療後のフローチャート 表 1 上咽頭癌症例の血清における EBV-DNA、核酸コピー数 0 7.43 × 103 DNA + RNA 0 T1N3M1 遠隔残存 病期 1 治療結果 8.59 × 105 症例 _BamHI-W 治療後 治療前 治療前後 0 1.81 × 104 DNA 0 7.33 × 103 0 1.31 × 105 遠隔再発 1.66 × 103 1.50 × 105 5.63 × 102 1.57 × 105 7.64 × 103 治療前 T1N3M0 6 EBER2 EBER1 EBER2 EBER1 0 0 0 0 0 治療後 CR 継続中 4.87 × 103 3.64 × 104 3.32 × 103 1.30 × 104 3.25 × 104 治療前 T1N1M0 4 CR 継続中 0 0 0 0 0 治療後 T4N2M0 3 治療中 9.57 × 104 1.61 × 103 8.02 × 104 5.53 × 102 9.48 × 103 治療前 T2N2M0 2 8 2.40 × 103 3.97 × 104 1.92 × 102 1.46 × 104 6.70 × 102 治療後 遠隔再発 1.32 × 103 6.40 × 104 1.05 × 103 3.09 × 104 2.73 × 104 治療前 T3N1M0 7.83 × 103 1.85 × 104 6.68 × 103 治療前 T3N0M0 7 _{治療後 0 0 0 0 0} 6.5 × 102 治療後 CR 継続中 7.60 × 102 4.87 × 104 0 8.40 × 103 0 7.93 × 102

補助化学療法を施行するかしないかで生存率に差

がなかったとする報告があり、補助化学療法を全

症例に施行することが疑問視されている

3)

_。しか

し、上咽頭癌では転移再発が他の頭頸部癌と比較

して多く、IGS 0099 に準じた補助化学療法が不要

とは言い難い。そこで、バイオマーカーを用いて

上咽頭癌治療後に再発リスクが高い症例を抽出

し、症例を選んで補助化学療法を行うことにすれ

ば、患者の治療侵襲軽減の面からも医療経済面か

らも有意義である。上咽頭癌はほとんどの症例が

EBV 関連疾患である。よって、EBV-DNA やそ

の転写産物・ウイルス関連蛋白は、バイオマーカー

と し て 期 待 さ れ て お り、実 際 に EBV の

BamHI-W 領域 DNA をバイオマーカーとして化

学放射線療法後の補助化学療法の適応を決める臨

床研究が進行中である

5)

_。

本稿では、治療後の再発リスクを評価する指標

として、まず EBV 抗体価（VCA-IgG、VCA-IgA）

について検討した。従来の報告では、EBV 抗体

価は上咽頭癌の補助診断法としては有用である

が、治療後では EBV 抗体価が高値のまま推移す

る症例があり、腫瘍遺残や再発の指標としては不

適切と報告されている

6)

_{。本稿でも EBV 抗体価}

について、再発・転移の有無と治療後の抗体価に

ついて有意な傾向は認めず、これまでの報告と同

様、補助化学療法の適応を決めるバイオマーカー

に は 適 さ な い と 思 わ れ た。上 咽 頭 癌 と

18

FD

G-PET に つ い て、治 療 前 の SUVmax、MTV、

TLG などの腫瘍の活動性を示す指標は、腫瘍の

再発率・生存率・治療効果と有意に相関すること

が報告されている

7),8)

_{。しかし、治療後のこれら}

の指標について、腫瘍の再発・遺残との関連につ

いての報告はない。本稿では、CR を維持してい

る症例でも原発巣の集積が維持される症例や遠隔

再発した症例でも原発巣に集積した症例があり、

予後との明らかな相関は認めなかった。化学放射

線療法後に上咽頭照射野の炎症や線維化によ

り

18)

_{FDG の集積が長期間継続する症例があるた}

現在、病勢を反映する最も信頼性が高い指標は、

EBV-DNA 定量である

6),9),10)

_{。血清（血漿）中}

の EBV-DNA コピー数は病期を反映し、治療後

の再発・転移を鋭敏に捉えることができる。また、

治療後の EBV-DNA コピー数は再発・転移を予

測するための因子となる。近年、EBV 感染細胞

が分泌するエクソソームに EBERs や BARTs な

ど の RNA が 内 包 さ れ て い る こ と が 判 明 し

た

11)-13)

_{。BARTs については上咽頭癌患者血清}

中からも検出されることが明らかになった

14)

_。

上咽頭癌患者血清中の EBV-DNA は、壊死・アポ

トーシス・溶解感染による細胞死に伴って血液中

に放出されるのに対して、EBV-RNA は生きた細

胞からエクソソームを介して安定して放出される

ため、より鋭敏に生きた上咽頭癌細胞の活動性を

反映すると思われる。そこで、本稿では病理組織

か ら は in situ hybridization 法 に よ り

EBERs-RNA が同定された症例 8 例について、

EBERs-DNA と EBERs のコピー数を合わせて計

測した。現在、EBV-DNA の中でも最も鋭敏とい

われる BamHI-W DNA の定量とほぼ平行した結

果 が 得 ら れ た た め、EBERs- 核 酸 の 定 量 が

BamHI-W 定量と比較してより鋭敏に病状を反映

しているのか今後、検討を要する。

われわれが想定している上咽頭癌診療のフロー

チャートを図 4 に示す。化学放射線療法後に明ら

かな腫瘍残存所見がない症例について Liquid

Biopsy を行い、腫瘍残存リスクが高い症例を選

択して補助化学療法を行うのが妥当と思われる。

今後は BamHI-W DNA と EBERs-核酸の定量に

ついてさらに症例を増やして検討し、EBERs-核

酸の定量がより鋭敏に腫瘍残存リスクを判定でき

るか、解析していきたい。

文

献

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14) WongAM et al：Profilingof Epstein-Barr virus-en-coded microRNAs in nasopharyngeal carcinoma reveals potential biomarkers and oncomirs. Cancer 118：698-710, 2012.

Analysis of treatment efficacy and prognosis associated with

nasopharyngeal carcinoma using EBV-related biomarkers

Naohiro W

AKISAKA

, Nobuyuki H

IRAI

, Satoru K

ONDO

and Tomokazu Y

OSHIZAKI Division of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Kanazawa University, Kanazawa 920-8640, Japan

Epstein-Barr virus (EBV) is involved in carcinogenesis and progression in most cases of nasopharyngeal carcinoma (NPC). Standard treatment in Western countries is concurrent chemoradiotherapy (CCRT) followed by adjuvant chemotherapy (AC). However, the treatment completion rate is only 55%, and a meta-analysis failed to show the advantage of addingAC followingCCRT. Now, clinical trials addingAC only to high-risk patients accordingto high copy numbers of EBV-DNA (BamHI-W fragment) as biomarker are in progress internationally. In recent years, vesicles called exosomes that enclose RNA and/or protein in cells were found to function as intercellular messengers, and they are released into extracellular fluids. Exosomes are released from living cells, and RNAs that are encapsulated in them can be present stably even in blood. Therefore, we examined whether EBV-encoded small RNAs (EBERs) are present in the serum of NPC patients. In addition, we compared this new candidate biomarker and existingmarkers such as EBV antibody titers and imagingdiagnosis, with respect to the response to treatment and prognostic assessment.