PowerPoint プレゼンテーション

とっとりバイオフロンティア事業

ー

世界最先端の染色体工学技術開発とその限りない可能性

ー

押村光雄

鳥取大学

大学院医学系研究科

機能再生医科学専攻

遺伝子機能工学

染色体工学研究センター

地域イノベーション創出２０１１inおかやま

2011.7.20

2

鳥取県、（財）鳥取県産業振興機構、

（地独）鳥取県産業技術センター

とっとりバイオフロンティア

創薬・医療産業、食品産業をサポートする

システムの集積化を目指す！

鳥取大学（医学部、農学部、

工学部）

染色体工学技術

協力機関

（医薬品企業、創薬支援企業、公的

研究機関等）

（独）産業技術総合研究所など

医薬品産業、食品産業

（地域農林水産加工関連産業等含む）

支えるシステム

2

3 ５ ．有 用 タ ン パ ク 質 　　製 造 プ ロ ジ ェ ク ト ４ ．医 薬 品 ・食 品 の 機 能 性 ・ 安 全 性 評 価 プ ロ ジ ェク ト １ ．染 色 体 ベ ク タ ー 開 発 　　 プ ロ ジ ェク ト ２ ．遺 伝 子 再 生 医 療 　 　プ ロ ジ ェク ト ３ ．疾 患 モ デ ル 細 胞 ・動 物 　　 プ ロ ジ ェ ク ト

世 界 最 先 端 の

染 色 体 工 学 技 術

（鳥 取 大 学 発 ） 世 界 と の 研 究 開 発 協 力 世 界 へ の 技 術 移 転 、 情 報 発 信 タン パ ク 質 製 剤 の 生 産 効 率 化 に よ る 医 療 産 業 へ の 貢 献 ヒ ト 化 モ デ ル 動 物 を 用 い た 医 薬 品 ・食 品 開 発 の 効 率 化 次 世 代 医 療 ・医 薬 開 発 に 貢 献 医 薬 品 ・機 能 性 食 品 の 探 索 シ ス テム の 構 築

地 域 産 業 活 性 化 へ の 貢 献

医 療 お よ び 医 薬 品 ・ 機 能 性 食 品 の 開 発 に よ る

国 民 の 健 康 増 進 と 経 済 活 性 化 へ の 貢 献

プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 構 想

染色体 遺伝子領域を 削除 任意の遺伝子を細胞・個体に 導入するためのベクター（乗り物） として利用可能

人工染色体ベクターとは

人工染色体ベクターとは

遺伝情報を担う物質（DNA）が凝集したもの

ヒトでは２３対（計４６本）存在

融合遺伝子や任意のヒト遺伝子を搭載

動原体

遺伝子領域

遺伝子領域

転写制御領域 遺伝子 人工染色体ベクター

テロメア

ヒト人工染色体の利点

ヒト人工染色体の利点

宿主染色体に挿入されず 宿主染色体に挿入されず独立して独立して維持される維持される

宿主遺伝子を破壊する可能性がある

導入コピー数のコントロール不可

導入 導入DNADNAサイズにサイズに制約がない制約がない （調節領域を含む遺伝子全長の導入が可能） （調節領域を含む遺伝子全長の導入が可能） 宿主細胞の 宿主細胞の生理的生理的発現制御を受ける発現制御を受ける 過剰発現／発現消失が起きない 過剰発現／発現消失が起きない

ウイルス／プラスミドベクター

＋

外来遺伝子制御領域

＋

遺伝子

多い！

多い！

挿入 長い制御領域全長を導入できない 制御過剰発現／発現消失が起きる

人工染色体ベクター（

人工染色体ベクター（HAC)

HAC) ＋

＋

ゲノム遺伝子

ゲノム遺伝子

ヒト人工染色体

FVIII-HAC maintained as independent

chromosome in

host cells.

8copy FVIII-HAC CHO

16 copy FVIII-PAC 162381 bp loxP -HPRT ex3-9 CMV/bsd

例えば、右の

「

血友病治療用の蛋白質医薬発現ベクター

」

（緑色）

を

細胞の染色体（青色）

に傷つけず

HACベクター（赤色）

の特定部位

に導入できています。

multi-Factor VIII/21HAC hiMSC 16 copy FVIII-PAC 162381 bp loxP -HPRT ex3-9 CMV/bsd hiMSC

hiMSC _{16copy FVIII16copy FVIII--PAC randomly integrated clonePAC randomly integrated clone}

Transferred 16copy FIII-HAC and randomly integrated FVIII-PAC clones maintained for 50PDLs withdrawal of selection.

Transfection

Transfection

FVIII cDNA was transfected into hiMSC which our evaluation ot the FVIII-HAC stability by comparison to rondomly integration

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Amount of DNA FVIII / ACTB

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 2 P DL 50 PD L 50 PD L 2 P DL

Blue：DAPI

Green：FVIII

FVIII relative expression 50PDL/2PDL

16 FVIII - HAC 16 FVIII - PAC 16 FVIII - HAC 16 FVIII - PAC

採取

（骨随）

間葉系幹細胞

（未分化）

体外培養

HAC

HAC

移入

移入

分化誘導

分化誘導

自家移植

治療用遺伝子

患者

ヒト人工染色体ベクター

ヒト人工染色体ベクター

(HAC)

(HAC)

を利用した

を利用した

遺

遺

伝子再生治療

伝子再生治療

筋組織

N

or

ma

l i

PS

D

M

D

iP

S

_{DMD iPS(+DYS-HAC)}

DMD patient: GM05169 from Coriell

, deletion of exon 4-43

exon 45

exon48

exon

4

exon44

exon

12

exon

8

exon51

exon

17

exon

19

Exons of the

red line

were deleted in DMD-patient derived iPS cells.

1

2

3

4

Multiplex PCR analysis for detection of deletion of DMD gene

? ? 受精卵 万能細胞 (ES細胞)

倫理的問題

正常線維芽細胞 万能細胞 (iPS細胞)

?

レトロウイルスベクター を用いた遺伝子の導入 （従来型）

発癌など、安全性に不安

レトロウィルスベクターの挿入部位の問題 癌遺伝子そのものを導入している問題 Ａ A B C D ？ 遺伝子搭載-HACを除去 万能細胞 (iPS細胞)

iPS

iPS

細胞作製の背景と解決策

細胞作製の背景と解決策

HACベクターに４因子全て搭載可能 ホストゲノムに変異を導入しない

HACの利点

HACによる遺伝子導入

1Kb

10Kb

100Kb

1Mb

10Mb

100Mb

plasmid

cosmid

BAC

YAC

Size limit of transgene

Human

Chromosomes

(40-250Mb)

染色体ベクターの利点

Vector for transgenesis

1. IgH=2Mb, Igκ=2Mb, Igλ=1Mb

2. CYP3A cluster=1Mb

3. HLA cluster=3Mb

4. DS critical region=5Mb

5. DMD gene=2.5Mb

colcemid

Any recipient

cells including

mouse ES cells

G418 selection

CHO or A9 cells containing a

human chromosome

fusion & Centrifuge

Mouse ES cells containing

a human chromosome

Chimeric mice containing a

human chromosome

Microcell

Germline transmission

(Trans-chromosomic mice

;Tc mice)

Injection into 8-cell

Microcell-mediated chromosome transfer (MMCT)

Cytochalasin B

Injection into

Pseudopregnant female Neo resistance gene

遺伝子 転写制御領域

発現を調節

DNA RNA タンパク質 （アミノ酸）

組織によって発現する遺伝子が異なる

遺伝子

転写制御領域

骨に関わる遺伝子の場合

肝臓

骨

遺伝子

転写制御領域

遺伝子

転写制御領域

肝臓に関わる遺伝子の場合

DNA上には遺伝子が

2万2000種

存在する

DNA

遺伝子

転写制御領域

・・・発現

・・・発現

肝臓遺伝子

転写制御領域

肝臓機能の回復と共に

発光酵素が産生される

融合遺伝子搭載HACを持つマウスを作製

する

肝機能良好時

肝機能悪化

光によって

肝臓の状態を

判断できる！！

光

光

る！！

る！！

マウスによる機能性成分評価システム

マウスによる機能性成分評価システム

肝臓機能の維持・肝細胞再生促進に関わる因子を探索するためのモデルマウスを作製

発光酵素遺伝子

肝機能保護効果を調べたい 物質を投与

光らない

効果なし

効果有り

Click # TSU20080912171844_005 Fri, Sep 12, 2008 17:31:11 Em filter=Open Bin:M (4), FOV12.5, f1, 60s Camera: IVIS ISO646N4031, DW434

Series: Experiment: 1 Label: Comment: 080911 7-15min2 Analysis Comment: 2.0 1.5 1.0 0.5 x10 6 Color Bar Min = 50000 Max = 2e+06 bkg sub flat-fielded cosmic Click # TSU20071228121540 Fri, Dec 28, 2007 12:15:49 Bin:M (4), FOV10, f1, 30s Filter: Open

Camera: IVIS ISO646N4031, DW434

Series: alb-luc 9 Experiment: 34 Label: luc Comment: 28/1216 Analysis Comment: 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 x10 6 Color Bar Min = 2.2738e+05 Max = 1.6731e+06 bkg sub flat-fielded cosmic

人工染色体ベクターを利用した

人工染色体ベクターを利用した

様々な機能評価用マウスの作製

様々な機能評価用マウスの作製

肝臓・腸

肝臓・腸が光るマウス

が光るマウス

骨・膵臓

骨・膵臓が光るマウス

が光るマウス

脂肪・血管内皮

脂肪・血管内皮が光るマウス

が光るマウス

ヒト薬物代謝酵素

ヒト薬物代謝酵素を持つマウス

を持つマウス

様々なモデルマウスを作製

ヒト型モデル動物へのHACの利用

＜薬の効き方＞

【吸収】

口→

食道

→

胃

→

小腸

→血液中→

門脈

↓

【代謝】

→

肝臓

（分解、解毒）

・分解産物が薬効・毒性を示す

・未分解産物が薬効・毒性を示す

↓

【分布】

肝臓→

血液によって全身へ

送られ、病気を治す。

↓

【排泄】

→

腎臓

クスリとして働き終えたものは、水溶性となり体

外に排出される

（尿、便など）

。

肝臓と小腸で発現する重要な薬物代謝酵素のひとつが

CYP3A遺伝子クラスターである。→市販の薬物の約50％を代謝する

薬物代謝酵素には種差があるため

実験動物を用いて調べられた毒性・薬効は

必ずしもヒトと一致しない

代謝

催奇形性

急性毒性

がん原性

新薬開発上のスクリーニングに有用

ヒトでの応答性を再現

薬効

薬・毒物・食品添加物・環境汚染物質・・・

〜新規薬物の候補となる因子の探索モデルとして〜

ヒトCYP3A

クラスター

搭載HAC

ベクター

(CYP3A-HAC)

CYP3A-HACマウスによる医薬品開発の効率化

→国民の健康増進と経済再生への貢献

＜ヒト化

＜ヒト化

CYP3A

CYP3A

マウス作製の意義＞

マウス作製の意義＞

Adult specific

3A4

14.5 dpc

Fetal specific

3A7

16.5 dpc 18.5 dpc D0 2w 4w 6w 8w 24w 16.5 dpc 11w feta l adul t

Mouse

Human

CYP3A-HAC mouse

Gapdh

成体型CYP3A4は成体期に、 胎児型 CYP3A7は胎児期に発現した

3a11

マウス

ヒト

Control

発生過程のCYP3A-HACマウス肝臓における遺伝子発現解析

0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Human

WT

CYP3A-HAC

Ratio of Vmax/Km for



-hydroxylation

Human

WT

CYP3A-HAC

Metabolic clearance of triazolam

Liver / Intestine

-OH / 4-OH

Ratio of Vmax/Km i

n liver microsomes

CYP3A-HACマウスにおけるトリアゾラム

代謝クリアランス

の特性は、ヒトと

類似していた。

「とっとりバイオフロンティア」において進行中の主な研究開発事業

１．戦略創造研究推進事業；CREST（科学技術振興機構；JST）

研究領域：「人工多能性幹細胞（iPS細胞）作製・制御等の医療基盤技術」

研究課題：「ヒト人工染色体を用いたｉＰＳ細胞の作製と遺伝子・再生医療」

研究代表：鳥取大学染色体工学研究センター長

押村

光雄

事業期間：平成２０年度〜平成２５年度予定

２．地域イノベーション戦略支援プログラム（文部科学省）

管理法人：（財）鳥取県産業振興機構、委託先：鳥取大学

染色体工学技術を核とした研究開発による産学連携のバイオ産業振興を目指した事業

事業期間：平成２２年〜２４年度

３．最先端・次世代研究開発支援プログラム（内閣府；総合科学技術会議）

研究課題：

「医薬品開発支援のための染色体工学技術によるヒト型薬物代謝モデル動物の作製」

研究代表：鳥取大学染色体工学研究センター助教

香月

康宏

事業期間：平成２３年度〜２６年度（予定）

４．「石油精製物質等の新たな化学物質規制に必要な国際先導的有害性試験法の開発」

（経済産業省）

事業委託先である（財）鳥取県産業振興機構が、鳥取大学と共同研究を推進

事業期間：平成２３年度〜平成２７年度（予定）