1 亜鉛はインタ - フェロン α β の抗ウイルス作用を増強する群馬大学大学院保健学研究科教授長嶺竹明

(1)

1

亜鉛はインタ－フェロンα・βの

抗ウイルス作用を増強する

群馬大学大学院保健学研究科

(2)

研究背景－１

ｲﾝﾀｰﾌｪﾛﾝ（

_{Interferon）}

とは？

☆インターフェロン（

_{IFN）は動物体内でウイルスなどの侵入に反}

応して細胞が分泌する蛋白質（サイトカインの一種）。

☆インターフェロンの型（ヒト）

＊

_{IFN typeⅠ型}

IFN-α

：

_13種類

IFN-β

：

_1種類

IFN-ω、 IFN-ε、 IFN-ε、 IFN-κ ：其々1種類

＊

_{IFN typeⅡ：}

IFN-γ

＊

_{IFN typeⅢ ：}

_IFN-λ

☆

_{IFN-α、βは抗ウイルス薬（Ｂ型、Ｃ型肝炎）や抗腫瘍薬（腎癌、}

骨髄腫、白血病など）として臨床応用されている。

(3)

3

Ｉ型インターフェロン（

_{IFNα,β）の抗ウイルス機序(仮説）}

mRNA 不活性型 endoRNase 活性型 endoRNase eIF-2α Mx蛋白質,その他リン酸化_eIF-2α ウイルス mRNA分解 ウイルス増殖抑制ウイルスペプチド鎖_{合成開始阻害} ウイルス由来二本鎖RNA 2,5-OAS系

核

IFN-α,β

（IFNα/β受容体） PK系 シグナル細胞膜

IFNAR1

IFNAR2

(4)

研究背景

--２

亜鉛

亜鉛酵素：

活性中心に亜鉛を必要とする約３００種類の酵素

例：アルカリフォスファターゼ、アルコール脱水素酵素、

プロテインキナーゼC、ホスホリパーゼC、ＲＮアーゼ

機能：炭水化物、脂質、蛋白質、核酸などの合成と分解

構造性亜鉛含有蛋白

＊蛋白の高次構造を維持し、遺伝情報の発現に関与

例：亜鉛フィンガー

＊

メタロチオネイン

：チオール基が２個の亜鉛と結合

機能：ラジカルスカベンジャー

重金属の代謝

抗ウイルス作用

HIV-1, herpes simplex virus

(5)

5

メタロチオネイン

分子量６

_,０００

アミノ酸の３０％をシステインが占める

システインのチオール基が亜鉛と結合

ー生理活性ー

金属（Zn,Cu）の代謝

重金属の解毒作用

ラジカル消去作用

．

細胞増殖・分化

ー誘導ー

金属（Zn,Cd)

グルココルチコイド

活性酸素

TNF-α,IL6

インターフェロン

(6)

新技術の基となる研究

_-1

_{: 亜鉛、インターフェロンαによるメタロチオネイン誘導}

Zｎ100μM

IFN100U/mL

+ Zｎ100μM

Control

細胞内亜鉛濃度

(μg/dL)

Zn100μM 39

Zn100μM

+ IFNα/β100IU/ml

64 Control 14

TRL1215細胞

(7)

7

(8)

肝組織メタロチオネイン染色とインタ－フェロンα治療成績

メタロチオネイン

染色強度

インターフェロンα著効率

治療前

治療後

（±）（＋）（＋＋）（＋＋＋）０／０２／５２／４１／４５／１０５／６２／２１／１

（５０％）

（58％）

（３３％）

（８６％）

(9)

9

新技術の基となる研究-2

:

難治性Ｃ型慢性肝炎６８例に対する

インターフェロンα＋亜鉛併用療法(1996～９８年)

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11

インターフェロンレセプター発現はＣ型慢性肝炎の

インターフェロンα 治療効果と関連する

・ Effectiveness of interferon-alpha therapy in chronic hepatitis C is associated with the amount of interferon-alpha receptor mRNA in the liver. Fukuda R, et al.Hepatology 1997.

・ _{FN-a receptor mRNA expression in a United States sample with}

predominantly genotype 1a/I chronic hepatitis C liver biopsies

correlates with response to IFN therapy. Mathai J, et al. J Interf Cytok Res 1999.

・ Immunohistochemical analysis of hepatic interferon alpha-beta receptor level: relationship between receptor expression and

response to interferon therapy in patients with chronic hepatitis C. Yatsuhashi H, et al. J Hepatol 1999.

・ _{Expression of interferon alpha/beta receptor in the liver of chronic}

hepatitis C patients. Mizukoshi E, et al. J Med Virol 1998.

・ Type 1 interferon receptor and response to interferon therapy in

chronic hepatitis C patients: a prospective study. Fujiwara D, et al. J Viral Hepat 2004.

(12)

「方法」

Ｕ９３７細胞

_1x10

4

_個を

_{37℃、5％CO}

2

で培養した。塩化亜鉛（０、５０、１００、

２００ μＭ）添加し、２４、４８時間培養後細胞を回収し、遠心した。一次抗体

（抗

IFNα/β受容体抗体）300μl を添加し、1時間反応。遠心後、FACS

bufferで洗浄し、2次抗体ＦＩＴＣ（１％）を添加し1時間反応。遠心、洗浄を3回

繰り返し、暗所で固定後、再び遠心。

FACS buffer 1mlに細胞を懸濁、ポリ

スチレンチューブに入れ測定した。

「測定」

BECTON DICKINSON FACSCalibur 4Sを使用し、FSC（前方散乱光）、

SSC（側方散乱光）、FL1（蛍光強度）を測定した。そして、BECTON

DICKINSON CELL Questを使用しFL1（蛍光強度）のヒストグラムを作成し

た。

＃Ｕ９３７細胞：ヒト慢性骨髄性白血病細胞株

＃一次抗体：ポリクロナールインターフェロンα

_{/β受容体抗体}

(13)

13

塩化亜鉛によるインターフェロンα

_{/β受容体ｍＲＮＡ誘導}

「方法」

Ｕ９３７細胞

1x１０

4

_{個を３７℃}

_,5％ＣＯ

2

で培養。塩化亜鉛（０、５０，１００，２００

μＭ）を添加」し、２４時間培養。細胞を回収し、遠心後上清を除去し

RLT

buffer+β-ME350μl加え細胞を溶解。トータルＲＮＡをＵ９３７細胞から抽出し、

ランダムプライマーを用いて、

cDNAを作成した。２μｌのｃＤＮＡを用い、１８μｌ

の

QuantiTect SYBR Green PCR Master MIX中で増幅反応を行った。

次に、ＰＣＲを

_{95℃15分１サイクル、続いて９４℃２０秒、６０℃１５秒、７２℃１５}

秒、５０サイクル行い、各サイクル後の７２℃で蛍光の検出を行った。

インタ－フェロンα

/β受容体ｍＲＮＡの定量はLight Cyclerで行い、コント

ロール（

18SリボゾームＲＮＡ）に対する比で表した。

＃インターフェロンα

/β受容体ｍＲＮＡプライマー：Hs IFNAR11 SG

(14)

(15)

(16)

「方法」

Ｕ９３７細胞1×10

4

_{個を、5％ＣＯ２，３７℃で培養。}

ポラプレジンク(亜鉛０、５０、１００、１５０、２００μＭ)を添加し、

さらに１２、２４時間培養。インターフェロンα/β受容体蛋白発現

をFACSで測定した。

またL-カルノシン（０、10 、１００、１０００μｇ/mL）を添加し、２４時

間後のインターフェロンα/β受容体蛋白発現を測定した。

• ポラプレジンク(亜鉛０、５０、１００、１５０、２００μＭ)投与12，24

時間後のインターフェロンα/β受容体ｍＲＮＡ発現をreal time

PCR法で測定した。

＃ポラプレジンク：亜鉛とL-カルノシンの錯体

ポラプレジンクによるインターフェロンα/β受容体蛋白の誘導

(17)

17

ポラプレジンクによるインターフェロンα

_{/β受容体蛋白の誘導}

(18)

(19)

19

L-カルノシンによるインターフェロンα/β受容体蛋白の誘導

Green: カルノシン 1000 μｇ/mL Blue: カルノシン 100 μｇ/mL Orange: カルノシン 10 μｇ_/mL Purple: カルノシン 0

(20)

従来技術とその問題点

＊食道癌培養細胞において、抗癌剤（5-Fluorouracil）はインタ

ーフェロンα／β受容体ｍＲＮＡを誘導すると報告されている

（Anticancer Res 2005）。しかし、インターフェロンα／β蛋白

発現は確認されていない。

＊亜鉛製剤は感冒症候群の罹患期間を短縮すると報告されて

いる(Am J Ther 2003) 。海外では感冒薬として亜鉛は広く使

用されているが、亜鉛の抗ウイルス作用は十分には解明され

ていない。

(21)

21

新技術の特徴・従来技術との比較

＊感冒症候群における亜鉛製剤の抗ウイルス作用機序が明らか

となる。さらにポラプレジンクよりもインターフェロンα/β受容

体誘導作用の強い亜鉛錯体を開発することによって、新たな

る感冒症候群の治療薬になることが期待される。

＊インターフェロンα、βは骨髄抑制、インフルエンザ様症状、

倦怠感など副反応が高頻度出現することから、投与量の増大

は制約をうける。インターフェロンα／β受容体を誘導する亜

鉛および亜鉛錯体の併用はC型慢性肝炎に対するインターフ

ェロン治療の副反応軽減に繋がると推察される

。

(22)

想定される用途

①インターフェロンα、β製剤と亜鉛および亜鉛錯体の併用による

抗ウイルス効果の増強および副作用の軽減

②亜鉛および亜鉛錯体による感冒症候群の予防や臨床症状の改善

③慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌などの悪性腫瘍に対する

インターフェロン療法の補助剤として使用

想定される業界

「利用者・対象」

①感冒薬としての亜鉛錯体の参入

②Ｃ型慢性肝炎に対するインタ－フェロンα、β＋リバビリン治療と亜鉛

錯体の併用

③Ｂ型慢性肝炎に対するインターフェロンα、β治療と亜鉛錯体の併用

「市場の規模」

①感冒症候群は日常経験する最も頻度の高い疾患群の１つであり、

市場規模は大きい

②インタ－フェロンα・β製剤で治療されるＣ型慢性肝炎症例は年間２～

(23)

23

実用化に向けた課題

＊亜鉛および亜鉛錯体によるインターフェロンα/β受容体

誘導効果について培養細胞で確認した。

しかし、実験動物における亜鉛によるインターフェロン

α/β受容体誘導は未解決である。

＊今後、ラット、マウスを使用して実験データを集積し、

臨床応用する場合の投与量を設定する。

企業への期待

＊今回はポラプレジンク（亜鉛とL-カルノシン錯体）を実験に

使用した。

＊他のアミノ酸と亜鉛の錯体を作成し、インターフェロン

α/β受容体誘導能について解析したい。

(24)

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称：亜鉛および亜鉛錯体による

インターフェロンα/β受容体の誘導

• 出願番号：特願2007-034984

• 出願人

：群馬大学

• 発明者

：長嶺竹明、鈴木和浩、中嶋克行

お問い合わせ先

群馬大学ＴＬＯ

・ＴＥＬ

0277-30-1171～1175

・ＦＡＸ

0277-30-1178

・e-mail

[email protected]

1 亜鉛はインタ - フェロン α β の 抗ウイルス作用を増強する 群馬大学大学院保健学研究科教授長嶺竹明

亜鉛はインタ－フェロンα・βの

抗ウイルス作用を増強する

群馬大学大学院保健学研究科

研究背景－１

ｲﾝﾀｰﾌｪﾛﾝ（

Interferon）

とは？

☆インターフェロン（

IFN）は動物体内でウイルスなどの侵入に反

応して細胞が分泌する蛋白質（サイトカインの一種）。

☆インターフェロンの型（ヒト）

＊

IFN typeⅠ型

IFN-α

：

13種類

IFN-β

：

1種類

IFN-ω、 IFN-ε、 IFN-ε、 IFN-κ ：其々1種類

＊

IFN typeⅡ：

IFN-γ

＊

IFN typeⅢ ：

IFN-λ

☆

IFN-α、βは抗ウイルス薬（Ｂ型、Ｃ型肝炎）や抗腫瘍薬（腎癌、

骨髄腫、白血病など）として臨床応用されている。

Ｉ型インターフェロン（

IFNα,β）の抗ウイルス機序(仮説）

核

IFN-α,β

IFNAR1

IFNAR2

研究背景

--２

亜鉛

亜鉛酵素：

活性中心に亜鉛を必要とする約３００種類の酵素

例：アルカリフォスファターゼ、アルコール脱水素酵素、

プロテインキナーゼC、 ホスホリパーゼC、ＲＮアーゼ

機能：炭水化物、脂質、蛋白質、核酸などの合成と分解

構造性亜鉛含有蛋白

＊蛋白の高次構造を維持し、遺伝情報の発現に関与

例：亜鉛フィンガー

＊

メタロチオネイン

：チオール基が２個の亜鉛と結合

機能：ラジカルスカベンジャー

重金属の代謝

抗ウイルス作用

HIV-1, herpes simplex virus

メタロチオネイン

分子量 ６

,０００

アミノ酸の３０％をシステインが占める

システインのチオール基が亜鉛と結合

ー生理活性ー

金属（Zn,Cu）の代謝

重金属の解毒作用

ラジカル消去作用

．

細胞増殖・分化

ー誘導ー

金属（Zn,Cd)

グルココルチコイド

活性酸素

TNF-α,IL6

インターフェロン

新技術の基となる研究

-1

: 亜鉛、インターフェロンαによるメタロチオネイン 誘導

Zｎ100μM

IFN100U/mL

+ Zｎ100μM

Control

細胞内亜鉛濃度

(μg/dL)

1 亜鉛はインタ - フェロン α β の抗ウイルス作用を増強する群馬大学大学院保健学研究科教授長嶺竹明

_{Interferon）}

_{IFN）は動物体内でウイルスなどの侵入に反}

_{IFN typeⅠ型}

_13種類

_1種類

_{IFN typeⅡ：}

_{IFN typeⅢ ：}

_IFN-λ

_{IFN-α、βは抗ウイルス薬（Ｂ型、Ｃ型肝炎）や抗腫瘍薬（腎癌、}

_{IFNα,β）の抗ウイルス機序(仮説）}

プロテインキナーゼC、ホスホリパーゼC、ＲＮアーゼ

分子量６

_,０００

_-1

_{: 亜鉛、インターフェロンαによるメタロチオネイン誘導}

インターフェロンレセプター発現はＣ型慢性肝炎の

_1x10

_個を

_{37℃、5％CO}

で培養した。塩化亜鉛（０、５０、１００、

_{/β受容体抗体}

_{/β受容体ｍＲＮＡ誘導}

_{個を３７℃}

_,5％ＣＯ

_{95℃15分１サイクル、続いて９４℃２０秒、６０℃１５秒、７２℃１５}

_{個を、5％ＣＯ２，３７℃で培養。}