Caveolin-1プ
ロ モ ー タ ー を 用 い たHerpes
Simplex
Virus-thymidine
kinase遺
伝 子 発 現 ア デ ノ ウ ィ ル ス に よ る
前 立 腺 癌 遺 伝 子 治 療 に お け る 有 効 性 と 安 全 性 の 検 討
江
原
伸
キ ー ワ ー ド: caveolin-1 promoter, prostate cancer cell line, orthotopic model
緒 言 前 立 腺 癌 は ア メ リ カ 合 衆 国 に お い て 男 性 癌 死 の 第 1位 で あ り1),日 本 に お い て も近 年 患 者 数 な らび に 死 亡 者 数 が 増 加 し て い る.癌 が 前 立 腺 内 に 限 局 し て い る 早 期 癌 で は 前 立 腺 全 摘 出 術 が 一 般 的 に 行 わ れ て い る が,前 立 腺 被 膜 外 に 浸 潤 し手 術 適 応 の な い 場 合 や 遠 隔 転 移 を認 め る 進 行 癌 に 対 して は 主 と し て ホ ル モ ン療 法 が 選 択 さ れ る .し か し数 年 後 に局 所 再 発 や 遠 隔 転 移 病 巣 の 出 現 な い し増 強 が 認 め ら れ る こ とが あ り,特 に ホ ル モ ン療 法 中 に 再 燃 し た 場 合 は 現 在 の と こ ろ 有 効 な 治 療 法 が 確 立 さ れ て い な い.こ の よ う な 再 燃 性 前 立 腺 癌 に 対 す る新 た な 試 み と し て 遺 伝 子 治 療 法 が 注 目 さ れ て い る. 遺 伝 子 治 療 法 の ひ と つ と し て ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク
タ ー に 組 み 込 ま れ たHerpes simplex virus
thymidine kinase (HSV-tk)遺 伝 子 の 導 入 と そ れ に 続 く抗 ウ ィ ル ス 薬 で あ るGancyclovir (GCV)の 投 与 を行 う,い わ ゆ る 自殺 遺 伝 子 治 療 が あ る.こ の 自殺 遺 伝 子 治 療 に 特 徴 的 な の は,遺 伝 子 が 導 入 さ れ た 細 胞 数 よ り も 多 くの 細 胞 が 障 害 さ れ る と い うby-stander effect現 象 が 認 め られ る こ と で あ り3)4),こ の こ とは 必 ず し も全 て の 細 胞 にHSV-tk遺 伝 子 が 導 入 さ れ る 必 要 が な い こ と を 意 味 し て い る. Eastham ら は ヒ ト ま た は マ ウ ス の 前 立 腺 癌 細 胞 株 を 用 い て
HSV-tk/GCV遺 伝 子 治 療 のin vitro, in vivoに お
け る有 効 性5), Hermanら は 放 射 線 治 療 後 に 局 所 再 発 を起 こ した 前 立 腺 癌 患 者 で のHSV-tk遺 伝 子 治 療 の 第1相 試 験 に お い て そ の 安 全 性 と有 効 性 を報 告 して い る6).ま た, HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い た 自殺 遺 伝 子 治 療 の 前 臨 床 研 究,臨 床 研 究 は 前 立 腺 癌 の み な ら ず 様 々 の 癌 種 に 対 し て も実 施 さ れ て い る7)8)9). こ れ ら の 研 究 に お い て 用 い ら れ て い る ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー に 組 み こ ま れ る プ ロ モ ー タ ー は Cytomegalovirus (CMV)プ ロ モ ー タ ー ま た はRous sarcomavirus (RSV)プ ロ モ ー タ ー で あ る.こ れ ら の プ ロ モ ー ター は 癌 細 胞 も し くは 臓 器 に 特 異 的 な プ ロ モ ー ター で は な い こ と,な ら び にCMVプ ロ モ ー ターHSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク ター の 大 腸 癌 肝 転 移 モ デ ル で 肝 機 能 障 害 が 引 き起 こ され た と い う報 告10) な ど 問 題 点 も少 な く な い.そ こ で 腫 瘍 が 特 異 的 に 産 生 す る糖 蛋 白 な ど を標 的 と し た プ ロ モ ー タ ー を 用 い る こ とでHSV-tk遺 伝 子 が 正 常 細 胞 に は 発 現 され ず , 腫 瘍 組 織 内 だ け に 発 現 さ れ る よ う な 試 み が 行 わ れ て い る11)12)13).し か し, in vivoに お い てCMVプ ロ モ ー タ ー, RSVプ ロ モ ー タ ーHSV-tkに 匹 敵 す る よ う な 抗 腫 瘍 効 果 が 誘 導 さ れ る か に つ い て は 未 だ 検 (平 成13年7月24日 受 理) 岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究 科 泌 尿 器 病 態 学 指 導:公 文 裕 巳 教 授 論 文 請 求 先:岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究 科 泌 尿 器 病 態 学 教 室 電 話: 086-235-7287 FAX: 086-231-3986 E-mail: [email protected]
討 段 階 に あ る. 一 方 ,Nasuら は 細 胞 膜 の 陥 凹 で あ るcaveolaの 構 成 蛋 白 で あ るcaveolin-1導 入 に よ っ て ホル モ ン 依 存 性 前 立 腺 癌 細 胞 が ホ ル モ ン 抵 抗 性 を 示 す こ と, caveolin-1が 転 移 性 ま た は ホ ル モ ン 抵 抗 性 前 立 腺 癌 細 胞 に 過 剰 発 現 さ れ て い る こ と,ま た ホ ル モ ン抵 抗 性 前 立 腺 癌 細 胞 のcaveolin-1発 現 を 実 験 的 に 抑 制 す る こ と で ホ ル モ ン抵 抗 性 細 胞 の ホ ル モ ン依 存 性 が 回 復 す る こ と を報 告 し た14).そ こ で 今 回caveolin-1 プ ロ モ ー タ ー を 用 い たHSV-tkア デ ノ ウ ィル ス ベ ク タ ー を作 成 し て,従 来 の プ ロ モ ー タ ー との 比 較 を行 う こ と と し た.比 較 に 際 し,現 時 点 のHSV-tk遺 伝 子 治 療 が 前 立 腺 局 所 投 与 を前 提 と し た もの で あ る こ と よ り,caveolin-1が 正 常 前 立 腺 に お い て 平 滑 筋 細 胞 や 血 管 内 皮 細 胞 に も局 在 す る こ とがin vivoの 治 療 に お い て は よ り高 い 抗 腫 瘍 効 果 に つ な が る 可 能 性 を考 え て 実 験 を 組 み 立 て た.同 時 に,局 所 投 与 と い え ど も血 中 へ の 溢 流 に と も な い 肝 障 害 に つ な が る 可 能 性 もあ り,安 全 性 と い う観 点 か ら もCMV, RSV プ ロ モ ー タ ー と の 比 較 を 試 み た. 材 料 と 方 法
1) Prostate cancer cell line
Caveolin-1高 発 現 前 立 腺 癌 細 胞 株 と してPC-3, 178BMA, Caveolin-1低 発 現 前 立 腺 癌 細 胞 株 と して LNCaP,178PAを 用 い た.ヒ ト前 立 腺 癌 細 胞 株 で あ るPC-3, LNCaPは そ れ ぞ れHam's F12K, RPMI 1640を 培 養 液 と し て 用 い た.マ ウ ス 前 立 腺 癌 細 胞 で あ る178PA,178BMAはThompsonら に よ
り 確 立 さ れ たmouse prostate reconstitution
(MPR) systemに よ っ て 得 ら れ た129 SV由 来 マ ウ
ス 前 立 腺 細 胞 株 で あ る15).細 胞 培 養 は そ れ ぞ れ の 培 養
液 中 で37℃,5%CO2下 で 静 置 培 養 を行 い,継 代 は
0.025% trypsinに て 行 っ た.使 用 さ れ た 薬 品 は す べ
てGIBCO Labs (Gaithersburg)よ り購 入 し た.
2) ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー
ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー は 以 前 報 告 さ れ た 方 法 に
て16)Dr. Timothy Thompson Lab.で 作 製 さ れ た も
の で あ る.ウ ィ ル スtiterは293細 胞 内 で 決 定 さ れ,
plaque-forming units (pfu)と し て 表 現 し た. 3) In vitro transduction HSV-tk遺 伝 子 導 入 とGCVに よ る ヒ ト ま た は マ ウ ス 前 立 腺 癌 細 胞 株 に 対 す る 細 胞 障 害 活 性 を 調 べ る た め,各 細 胞 数 を2.5×104cells/cm2に 培 養 後, 100MOI の 濃 度 に て 各 ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 導 入 し た. 導 入 時 間 中 は 培 養 液 をserum-free medium (SFM: DMEM, 10mM HEPES, 100U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin,0.1% bovin serum albumin)
に 変 え,2時 間 感 染 さ せ た,培 養 液 を 新 し いSFMに 変 え24時 間 培 養 し た 後,PBSも し く はGCVを10μg/ mlに 濃 度 調 節 し た 培 養 液 で72時 間 培 養 し た.ト リ プ シ ン 処 理 後,生 細 胞 をtrypan blueで 染 色 し 染 色 さ れ た 細 胞 数 を 測 定 し た. 4) マ ウ ス 前 立 腺 癌 同 所 移 植 モ デ ル を 用 い たin vivo gene therapy HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー と そ れ に 引 き 続 くGCV治 療 に よ る マ ウ ス 前 立 腺 癌 細 胞 に 対 す るin vivo効 果 を 評 価 す る た め,ト リ プ シ ン 処 理 し た マ ウ
ス 前 立 腺 細 胞 株178BMA を Hank's balanced saline solution (HBSS)にsingle cell suspension と し 生 細 胞 数5×103個/10ulの 細 胞 浮 遊 液 を 同 種 の 129SV マ ウ ス 前 立 腺 に 注 入 し た.注 入7日 後,各 HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を5×108pfu/25μl に な る よ うHBSSで 希 釈 し,腫 瘍 内 に 注 入 し た.こ の 時,腫 瘍 全 体 に ベ ク タ ー 溶 液 が 暴 露 さ れ る よ う針 先 を 調 整 し た.ベ ク タ ー 注 入 翌 日 か ら6日 間, GCV 100mg/kg body を 一 日2回,12時 間 毎 に 腹 腔 内 投 与 し た. ベ ク タ ー 注 入14日 後,マ ウ ス を 屠 殺 し 腫 瘍 の サ イ ズ を 測 定 し た.ホ ル マ リ ン 固 定,パ ラ フ ィ ン 包 埋 さ れ た 腫 瘍 組 織 は,4-5μm切 片 に ス ラ イ ス し 標 本 を 作 製 し た.ま た 腫 瘍 組 織 はOCT compound 内 に も 凍 結 保 存 し, 4-5μm 切 片 に ス ラ イ ス し,免 疫 組 織 学 的 検 討 の た め ア セ ト ン に て 固 定 し た.
5) Quantitative immunohistochemical analysis OCT compound内 に 凍 結 保 存 さ れ た 腫 瘍 組 織 を 4-5μm切 片 に ス ラ イ ス し ア セ ト ン に て 固 定 し た 後,avidin-biotin-peroxodase Vectastain Elite
ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を 用 い て 免 疫 染 色 法 を 行 っ た. primary anti-bodyと し てanti-CD4 (clone: H129.19, Phar-Mingen), anti-CD8 (clone: 53-6.7, PharMin-gen), anti-Factor Ⅷ (rabitt polyclonal A 0082, Dako)を 使 用 し た. Second antibodyはbiotinylated goat anti-rat immunoglobulin (Vector Labora-tories)を 使 用 し た.ま たapoptosis index, % ner crosisを 測 定 す る た め,ホ ル マ リ ン 固 定,パ ラ フ ィ
ン 包 埋 さ れ た 腫 瘍 組 織 を 4-5μm 切 片 に ス ラ イ ス し た 後TUNEL法 に よ っ て 解 析 し た.腫 瘍 組 織 の
necrosis, apoptosis は computer-assisted image analyzer (Bioscan)に よ っ て 定 量 的 に 測 定 し た.
6) In vivo vector toxicity
各 種HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い た 自 殺 遺 伝 子 治 療 に よ る 副 作 用 を 検 討 す る た め,血 清 Aspartate aminotransferase (AST)レ ベ ル を モ ニ
タ リ ン グ し て 肝 障 害 の 評 価 を 行 っ た.各HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を1×109pfu/100μlに な る よ
うHBSSで 希 釈 し,マ ウ ス の 尾 静 脈 よ り 注 入,翌 日 よ り6日 間GCV 10mg/kgを1日2回,12時 間 毎 に 腹 腔 内 投 与 し た.ベ ク タ ー 注 入1日 後,2日 後,3日
Fig. 1 In vitro cytotoxicity
RSV-β-gal/PBSコ ン ト ロ ー ル と の 細 胞 数 の 比 較 □-PBS処 理,■-GCV処 理
PC-3細 胞 に お い てRSV-β-gal/GCVと 比 較 し て 有 意 差 が 認 め ら れ た(P<0 .038) Bars: Means±standard deviation (SD)
後,7日 後,14日 後 に マ ウ ス を 屠 殺 し 血 液 を採 取, 血 液 を2000rpm/minで 遠 心 分 離 し血 清 を採 取 し, AST値 を 測 定 し た. 結 果 1) In vitro cytotoxicity プ ロ モ ー ター の 違 い に よ るHSV-tk遺 伝 子 の 細 胞 障 害 活 性 を マ ウ ス 前 立 腺 癌 細 胞 株,お よ び ヒ ト前 立 腺 癌 細 胞 株 を用 い て 比 較 検 討 し た(Figure 1).コ ン トロ ー ル ベ ク ター と し てRSVプ ロ モ ー タ ー 下 で bacterial β-galactosidase遺 伝 子 が 組 み 込 まれ た ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー(RSV-β-gal)を 使 用 し た. RSV-β-gal導 入 後PBS入 り培 養 液 に て72時 間 培 養 し測 定 さ れ た 細 胞 数 を 基 準 値 と し,そ れ ぞ れ の 治 療 群 で の 細 胞 数 を%で 表 示 し た.Caveolin-1を 相 対 的 に 高 発 現 し て い る178BMAマ ウ ス 細 胞 株 で は 有 意 差 は な い も の の,Cav.-1-tk群 に お い て 生 存 細 胞 数 が 減 少 し て お り(32%),よ り強 い 細 胞 障 害 活 性 を示 す こ と が 認 め ら れ た(Figure 1 C).さ ら にCaveolin -1を 相 対 的 に 高 発 現 して い る ヒ ト前 立 腺 癌 細 胞 で あ るPC-3細 胞 で はCav.-1-tk群(34%)に お い て CMV-tk群(65%)に 比 べ 細 胞 障 害 活 性 に 有 意 な 差 が 認 め ら れ た(P<0.038)(Figure 1 D).一 方
Caveolin-1発 現 が 相 対 的 に 低 い178PA, LNCap細
胞 株 で はCav.-1-tkの 効 果 が 弱 い こ と が 認 め られ た(Figure 1A, 1B). 2) マ ウ ス 前 立 腺 癌 同 所 移 植 モ デ ル を 用 い たin ViVo gene therapy in vitroで の caveolin-1高 発 現 細 胞 に 対 す る Cav.-1-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク ター の 細 胞 障 害 活 性
効 果 に 基 づ き,178BMAを 用 い てin vivoに お け る
抗 腫 瘍 効 果 を 比 較 検 討 し た(Figure 2).コ ン トロ ー ル 群 に 比 し て 各 治 療 群 で はprimary tumorの サ イ ズ が 有 意 に 抑 制 さ れ て い た.Cav.-1-tk(1.02± 0.3g: wet weight±SD), CMV-tk (1.23±0.34 g), RSV-tk(1.56±0.35g)各 群 間 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た が,Cav.-1-tkに お い て 腫 瘍 形 成 は 最 も抑 制 さ れ て い た.
3) Quantitative immunohistochemical analysis 腫 瘍 抑 制 の メ カ ニ ズ ム を 評 価 す る た め,屠 殺 し た マ ウ ス の 腫 瘍 組 織 中 のapoptosis及 びnecrosis level
を 評 価 し た(Figure 3). Apoptosis indexはRSV -β-galコ ン ト ロ ー ル 群(0 .98±0.15cells/hp)に 比
し て 全 て の 治 療 群 に お い て 有 意 に 上 昇 し て い た が, 各 治 療 群 間 に は 有 意 な 差 は 認 め な か っ た(Cav.-1-tk: 2.52±0.98cells/hp, CMV-tk: 2.27±0.74 cells/hp, RSV-tk: 1.73±0.68cells/hp, Figure
3A). 一 方, % necrosisはCav.-1-tk群(17.3±2.9 %/hp)に お い てRSV-β-galコ ン ト ロ 原 ル 群(8.5± 1.4%/hp)に 比 し て 有 意 に 高 値 を 示 し た(Figure 3B).ま た, factor Ⅷ を 指 標 と し たmicrovessel densityに つ い て は, Cav.-1-tk群(16.6±2.1cells/ hp),RSV-tk群(19.2±3.0cells/hp)に お い てRSV -β-galコ ン ト ロ ー ル 群(29 .9±3.4cells/hp)に 比 し 有 意 に 低 下 し て い た(Figure 3C). 次 にHSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー に よ っ て 誘 導 さ れ たTcellの 腫 瘍 内 浸 潤 を 評 価 す る た めCD4, CD8 positive T cellを 顕 微 鏡 下 に 測 定 し,そ の 評
Fig. 2 In vivo gene therapy
5×108pfu のHSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を orthotopic tumorにinjectionし た. RSV-β-gal に 比 し てHSV-tkに よ る 治 療 群 す べ て に お い て 腫 瘍 サ イ ズ は 有 意 に 縮 小 し て い た(P<0.0005). Bars: Means±standard deviation (SD)
Fig. 3 Quantitative immunohistochemical analysis A: Apoptosis index. HSV-tk治 療 群 す べ て に お い てRSV-β-galコ ン ト ロ-ル に 比 し て 有 意 差 を 認 め た(CMV-tk: p<0.005, RSV-tk: p<0.05, Cav. -1-tk: p<0 .005). B: %necrosis. Cav.-1-tkに お い て の みRSV-β-galコ ン ト ロ ー ル と の 比 較 に て 有 意 差 を 認 め た(P< 0.05).
C: microvessel density. RSV-tk (P<0.05), Cav. -1-tk (P<0 .005) に お い てRSV-β-galコ ン ト ロ ー ル と の 比 較 に て 有 意 差 を 認 め た. Bars: Means±
tandard deviation (SD)
価 を 行 っ た(Figure 4). CD 4 positive T cel1に お い て は 各 治 療 群 問 に 差 は 認 め ら れ な か っ た(Cav. -1-tk: 7 .9±1.7cells/hp, CMV-tk: 8.4±1.2 cells/hp, RSV-tk: 7.6±1.3cells/hp, RSV-β-gal: 4.8±1.3cells/hp, Figure 4A). CD-8 positive T cellに お い て も コ ン ト ロ ー ル 群 と の 間 で 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た も の の,Cav.-1-tk群
(11.2±3.3cells/hp)に お い てCD-8positive T cellの 数 が 多 い 傾 向 が 見 ら れ た(CMV-tk: 8.9±1.6 cells/hp, RSV-tk: 9.2±1.6cells/hp, RSV-β-gal: 7.6±2.2cells/hp, Figure 4 B).
4) in vivo vector toxicity
各 種HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を 用 い た 自
Fig. 4 Tumor infiltrating T cell analysis A: CD 4-positive T cells B: CD 8-positive T cells
殺 遺 伝 子 治 療 副 作 用 を,肝 障 害 を指 標 と し て 検 討 す る た め 各 ア デ ノ ウ ィ ル スベ ク タ ー を マ ウ ス の 尾 静 脈 よ り 注 入 し,肝 逸 脱 酵 素 で あ る 血 清ASTを モ ニ タ リ ン グ し た(Figure 5).ベ ク タ ー 注 入 後2日 目, つ ま りGCV腹 腔 内 投 与1日 目か ら血 清ASTレ ベ ル が 上 昇 し,GCV腹 腔 内 投 与2日 目 で 血 清ASTレ ベ ル は ピ ー ク と な っ た .特 に,CMV-tk投 与 群 に お い て 血 清ASTレ ベ ル は 著 明 に 上 昇 し た(501.33± 60.33IU/L). RSV-tk投 与 群 に お い て もCMV-tk 投 与 群 と 同 様 にGCV投 与2日 目 で 明 ら か な 上 昇 (373.00±70.13IU/L)を み と め た.一 方,Cav.-1 tk投 与 群 で はGCV腹 腔 内 投 与2日 目 で 血 清AST レ ベ ル の 上 昇 が も っ と も小 さ く(154.67±38.01IU/ L), CMV-tk投 与 群(P<0.0001)とRSV-tk投 与 群(P=0.0054)と の 間 に 有 意 差 が 認 め られ た.な お デ ー タ に は 示 し て い な い が,肝 機 能 障 害 が 原 因 と 推 察 さ れ る マ ウ ス の 死 亡 は ど の 投 与 群 に お い て も 認 め ら れ な か っ た. 考 察 遺 伝 子 治 療 に お い て 導 入 さ れ た 遺 伝 子 の 発 現 レ ベ ル は ベ ク タ ー の 導 入 効 率 お よ び ベ ク タ ー に 組 み 込 ま れ た エ ン ハ ン サ ー/プ ロ モ ー ター に 大 き く左 右 さ れ る と考 え られ て い る17).それ ゆ え 導 入 に 使 用 す るベ ク タ ー は 強 い 転 写 活 性 能 を もつ 様 に デ ザ イ ン さ れ て い る. HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー に お け る プ ロ モ ー タ原 活 性 に つ い て は,種 々 の 癌 細 胞 株 に お い て 評 価 され て きた11)12)18).Cytomegalovirus (CMV)
immedi-ate early geneプ ロ モ ー タ ー お よ び Rous sarcoma
virus (RSV) long terminal repeatプ ロ モ ー タ ー
は 強 力 な 転 写 活 性 能 を 有 す る こ とが 知 ら れ て お り,
HSV-tk遺 伝 子 だ け で な く他 の 遺 伝 子 導 入 に つ い て
も幅 広 く使 用 さ れ て い る19)20).CMVプ ロ モ ー ター お
よ びRSVプ ロ モ ー タ ー で 転 写 コ ン トロ ー ル さ れ る
HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル スベ ク タ ー はin Vitro, in vivo
に お い て 卓 越 し た 抗 腫 瘍 効 果 を も た ら す も の の16)21)22)23)24)25),大腸 癌 肝 転 移 モ デ ル で のCMVプ ロ モ ー タ ーHSV-tkア デ ノ ウ ィ ル スベ ク ター 導 入 に よ っ て 重 篤 な 肝 障 害 が 認 め られ た との 報 告 も あ る10)26). し た が っ て 標 的 細 胞 に お い て 特 異 的 にHSV-tk遺 伝 子 が 発 現 さ れ,肝 細 胞 を 含 む 正 常 細 胞 で はHSV-tk 遺 伝 子 が 発 現 さ れ な い よ う な プ ロ モ ー タ ー を使 用 す る ア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を考 慮 す る こ と が 必 要 と な る.こ の よ う な 観 点 か ら α-fetoprotein (AFP)
や carcino-embryonal antigen (CEA)と い っ た 腫
瘍 が 特 異 的 産 生 す る糖 蛋 白 な ど を標 的 と し た 腫 瘍 細 胞 特 異 的 な プ ロ モ ー ター を 用 い る こ と でHSV-tk遺
伝 子 が 正 常 細 胞 に は 発 現 さ れ ず,腫 瘍 組 織 内 だ け に
発 現 さ れ る よ う な 試 み が 行 わ れ て い る11)12)18).
Prostate-specific antigen (PSA)は 前 立 腺 癌 の 特 異
的 腫 瘍 マ ー カ ー と し て 知 ら れ て お り,PSAプ ロ モ-タ ー を 用 い た 前 立 腺 癌 に 対 す る遺 伝 子 導 入 が 試 み ら れ て い る13)27)28)29)30).しか し,最 近 の 研 究 で はin vivo で の 遺 伝 子 導 入 効 率 に は 限 界 が あ る こ と,お よ び 組 織 学 的 に 未 分 化 な タ イ プ ま た は 転 移 性 の 前 立 腺 癌 で はPSAの 産 生 能 が 相 対 的 に 低 い こ と な ど か ら 十 分 な 抗 腫 瘍 効 果 は 得 ら れ て い な い31).
Fig. 5 in vivo vector toxicity
1×109pfuのHSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー を マ ウ ス 尾 静 脈 よ り 注 入 後,血 清ASTを 測 定 し た. GCV投 与2日 目 で の 血 清ASTレ ベ ル はCav.-1-tk投 与 群 に て 最 も 小 さ くCMV-tk投 与 群(p< 0.0001)お よ びRSV-tk投 与 群(p=0.0054)と の 間 に 有 意 差 が 認 め ら れ た.
一 方 ,Nasuら は, Caveolin-1が 転 移 性 前 立 腺 癌 細 胞 ま た は ホ ル モ ン抵 抗 性 前 立 腺 癌 細 胞 に 高 発 現 し, Caveolin-1を 高 発 現 させ る こ とで ホ ル モ ン 依 存 性 細 胞 が ホ ル モ ン 抵 抗 性 に 変 化 す る こ と,ま た 逆 に Caveolin-1を 高 発 現 し て い る ホ ル モ ン 抵 抗 性 細 胞 の Caveolin-1の 発 現 を抑 制 す る こ とで ホ ル モ ン依 存 性 が 回 復 す る こ と を報 告 して い る14).前立 腺 癌 に 対 す る 遺 伝 子 治 療 の 目標 が,ホ ル モ ン 抵 抗 性 癌 の 治 療 に あ る こ と よ り,caveolin-1プ ロ モ ー タ ー の 現 実 的 有 効 性 を検 証 す る こ と は,こ れ か ら の 前 立 腺 癌 に 対 す る 遺 伝 子 治 療 の 方 向 性 を検 証 す る の に 極 め て 有 意 義 で あ る と考 え ら れ た.ま た,Caveolin-1はYangら に よ っ て 前 立 腺 癌 患 者 に お け る前 立 腺 全 摘 出 術 後 の 組 織 内 で のCaveolin-1高 発 現 が 術 後 再 発 の 予 測 因 子 と な る こ と と と も に,正 常 前 立 腺 に お い て は Caveolin-1が 平 滑 筋 細 胞 や 血 管 の 内 皮 細 胞 に 局 在 し て い る こ とが 報 告 さ れ た32).当 面 の 前 立 腺 癌 に 対 す る遺 伝 子 治 療 が 前 立 腺 へ の 局 所 投 与 で あ る こ と を 考 え る と,Caveolin-1プ ロ モ ー タ ー を転 写 コ ン トロ ー ル と し たHSV-tkア デ ノ ウ ィル ス ベ ク ター を 使 用 す る場 合 に, HSV-tk遺 伝 子 が 癌 細 胞 だ け で な く栄 養 血 管 な ど に も導 入 さ れ る こ と は,腫 瘍 細 胞 へ の 直 接 効 果 の み な ら ず 腫 瘍 内 血 管 障 害 に よ る 間 接 効 果 を 通 じ て よ り強 い 抗 腫 瘍 効 果 が 得 ら れ る可 能 性 に つ な が る もの と考 え ら れ る.
In vitro cytotoxicity に お い てCav.-1-tk は
Caveolin-1 を 相 対 的 に 高 発 現 し て い る178BMAマ ウス 前 立 腺 癌 細 胞 株,PC-3ヒ ト前 立 腺 癌 細 胞 株 に お い てCMV-tkお よ び RSV-tk と ほ ぼ 同 等 ま た は よ り強 い 細 胞 障 害 活 性 を 示 し た.一 方, Caveolin-1発 現 が 相 対 的 に 低 い178PA マ ウ ス 前 立 腺 癌 細 胞 株, LNCapヒ ト前 立 腺 癌 細 胞 株 に お い て はCav.-1-tk の 細 胞 障 害 活 性 がCMV-tk, RSV-tkに 比 し て 弱 い 結 果 とな っ た.こ の こ と はCav.-1-tkの 癌 細 胞 に 対 す る 細 胞 障 害 活 性 が,癌 細 胞 内 のCaveolin-1発 現 と相 関 を示 す も の と解 釈 さ れ る. In vivoの 実 験 に 関 し て は,ホ ル モ ン 抵 抗 性 前 立 腺 癌 を 想 定 しCaveolin-1発 現 の 高 い マ ウ ス 前 立 腺 癌 細 胞 株 で あ る178BMA細 胞 株 を使 用 し,マ ウ ス 前 立 腺 癌 同 所 移 植 モ デ ル を 作 成 し て 抗 腫 瘍 効 果 を検 討 し た.治 療 群 間 で 腫 瘍 の サ イ ズ に 有 意 な 差 は な か っ た も の のCav.-1-tk治 療 群 に て 腫 瘍 の サ イ ズ が 最 も 小 さ く, apoptosisも よ り 多 く生 じ て い る傾 向 が 認 め ら れ た.特 筆 す べ き 点 は 腫 瘍 組 織 内 に お け る 壊 死 の 範 囲 の 指 標 と な る % necrosisがCav.-1-tk治 療 群 の み コ ン トロ ー ル に 比 し有 意 に 上 昇 し て い た こ と, な ら び に 腫 瘍 内 の microvessel density の 指 標 と な
るanti-factor Ⅷ positive vesselの 数 がCav.-1
-tk治 療 群 に て 最 も低 下 して い た こ と で あ る.こ れ
ら の 結 果 はCav.-1-tkに よ っ てtumor vasculature
が よ り破 壊 さ れ,栄 養 血 管 を 失 っ た 腫 瘍 細 胞 の ne-crosisが 生 じた こ と も抗 腫 瘍 効 果 の 一 因 と考 え ら れ る.さ ら にHSV-tk/GCVに よ っ て 生 じ た 局 所 に お け る癌 細 胞 の apoptosis, necrosis か ら全 身 的 な 抗 腫 瘍 免 疫 が 誘 導 さ れ て い る か 否 か 評 価 す る た め, CD4, CD8-positive T cell の 腫 瘍 内 浸 潤 を解 析 し た.CD4 T cellの 腫 瘍 内 に お け る 数 に お い て 治 療 群 と コ ン ト ロー ル 群 間 で 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た も の の, CD8 T cellに お い て はCav.-1-tk 治 療 群 に て 他 のHSV-tk治 療 群 に 比 し てpositive cellの 数 が 多 い傾 向 が 認 め ら れ た. HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク ター を 腫 瘍 内 局 所 注 入 し た 場 合 に ベ ク タ ー が 前 立 腺 を 超 え て 発 現 す る こ と は,Timmeら の マ ウ スの 実 験33),な ら び にHerman
ら6)のphase 1 clinical trialに お い て 重 篤 な 副 作 用
が ほ と ん ど 認 め ら れ な か っ た こ とか ら推 察 さ れ る. し か しCMVプ ロ モ ー タ ー 下 のHSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー 導 入 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ た 重 篤 な 肝 障 害 の 報 告 例10)やcaveolin-1が 間 質 系 細 胞 に 発 現 して い る こ と を考 慮 す る と,臨 床 応 用 時 の 安 全 性 と い う 観 点 か らcaveolin-1プ ロ モ ー タ ーHSV-tk の 肝 障 害 の 有 無 を他 の プ ロ モ ー タ ー を用 い たHSV-tkと 比 較 検 討 す る 必 要 が あ る と考 え ら れ た .そ こ で 各 ア デ ノ ウ ィ ル スベ ク タ ー を マ ウ ス の 尾 静 脈 よ り注 入 し,肝 逸 脱 酵 素 で あ る 血 清ASTを 指 標 と し て 肝 機 能 障 害 の 程 度 を 比 較 検 討 し た.検 討 し た3種 類 の ベ ク タ ー に お い て,ベ ク タ ー 注 入 後2日 目,っ ま り GCV腹 腔 内 投 与1日 目 か ら 血 清ASTレ ベ ル が 上
昇 し,GCV腹 腔 内 投 与2日 目 で 投 与 群 の 血 清AST レ ベ ル は ピー ク と な っ た.し か しCav.-1-tk投 与 群 で 血 清ASTレ ベ ル の 上 昇 が も っ と も小 さ く,CMV -tk投 与 群,RSV-tk投 与 群 と の 比 較 に お い て も有 意 に 血 清ASTレ ベ ル は 低 値 で あ っ た. 以 上 の 結 果 か ら 前 立 腺 癌,特 にcaveolin-1を 高 発 現 し て い る 前 立 腺 癌 に お い てcaveolin-1プ ロモ ー タ 転 写 コ ン ト ロ ー ル 下 のHSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー は 腫 瘍 内 に 局 所 注 入 す る と い う 点 で,現 在 転 写 活 性 能 が 最 も強 い と さ れ て い るCMVま た はRSV プ ロ モ ー タ ー 転 写 コ ン トロー ル 下 のHSV-tkア デ ノ ウ ィ ル スベ ク ター に 比 し て 有 効 か つ 安 全 で あ る と思 わ れ る. 結 語 Caveolin-1プ ロ モ ー タ ー 転 写 コ ン トロ ー ル 下 の HSV-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク タ ー の 前 立 腺 癌 に 対 す る有 効 性 お よ び 安 全 性 に つ い て 検 討 し た. 1)Caveolin-1を 相 対 的 に 高 発 現 して い るマ ウ ス お よ び ヒ ト前 立 腺 癌 細 胞 株 に お い て,Cav.-1-tkア デ ノ ウ ィ ル ス ベ ク ター は よ り 強 い 細 胞 障 害 活 性 を 示 し た.
2)in vivoに お い てCav.-1-tk, CMV-tk, RSV
-tk各 群 問 に 有 意 な 差 は 認 め られ な い もの の,Cav.
-1-tk治 療 群 で 腫 瘍 形 成 は 最 も抑 制 され て い る傾
向 が 見 ら れ た.
3)抗 腫 瘍 効 果 の 評 価 と し て はCav.-1-tk治 療 群
で % necrosisま た はmicrovessel densityに 有 意
差 が 認 め られ た こ とか らCav.-1-tkに よ っ て 癌 細 胞 だ け で な くtumor vasculatureが 破 壊 さ れ, 栄 養 血 管 を失 っ た腫 瘍 細 胞 がnecrosisを 引 き起 こ し た こ と も抗 腫 瘍 効 果 発 現 に 寄 与 し て い る と考 え ら れ た. 4)血 清ASTレ ベ ル を指 標 と し た 安 全 性 の 検 討 に お い てCav.-1-tk投 与 群 で はCMV-tk投 与 群, RSV-tk投 与 群 との 比 較 に お い て 有 意 に 血 清AST の 変 動 は 軽 微 で あ っ た. 謝 辞 稿 を終 え る に あ た り,本 研 究 に 対 し御 指 導 い た だ いたBaylor 医 科 大 学Dr. Timothy C. Thompson,岡 山 大 学 津 島知 靖 助 教 授,那 須 保 友 講 師 に 深 謝 い た し ま す と と も に 御 指 導 い た だ き,ま た御 校 閲 を賜 り ま し た恩 師 公 文 裕 巳教 授 に 御 礼 申 しあ げ ます. 文 献
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The efficacy
and toxicity
resulting
from
recombinant
HSV-tk
adenoviral
vector
under
the transcriptional
control
of
caveolin-1
promoter
for prostate
cancer
Shin EBARA
D
epartment of Urology,
Okayama University Graduate School of Medicine and Dentistry
Okayama 700-8558, Japan
(Director:
Prof. H. Kumon)
The efficacy and toxicity of adenoviral vectors that express Herpes Simplex Virus-thymidine kinase (HSV-tk) gene under the transcriptional control of caveolin-1 promoter (cav.-1-tk) was compared to Cytomegalovirus (CMV) promoter or Rous sarcoma virus (RSV) promoter HSV-tk for prostate cancer. The cav.-1-tk demonstrated the strong cytotoxicity in vitro for mouse human prostate cancer cell line (178BMA) and human prostate cancer cell line (PC-3), which overxpress caveolin-1 levels. On the other hand, the cytotoxicity was weak for mouse (178PA) and human (LNCaP) prostate cancer cell line, which express low caveolin-1 levels. The antitumor efficacy was observed in each vector in vivo orthotopic model using 178BMA prostate cancer cell line. The immunohistochemical analysis results indicated that not only cancer cells but also tumor vasculature were destroyed by cav.-1-tk. The serum AST levels of cav.-1-tk was minimal change following intravenous injection.
Taken together, adenovirus-mediated HSV-tk in situ gene therapy under the transcriptional control of caveolin-1 promoter may be effective and safe for prostate cancer compared to CMV or RSV promoter
