C型 慢 性肝 炎 にお け るHCV-免
疫複 合体 形成 と
イ ンター フェ ロ ン治療効 果 との 関係
眞
鍋
良
二
キ ー ワ ー ド;HCV,chronic hepatitisC,HCV-immune complexes
緒 言 Watoら1)は,C型 慢 性 肝 炎 症 例 の 組 織 分 類 に よ る 肝 組 織 障 害 の 程 度 とHCVの ウ イ ル ス 量 を そ ろ え てInterferon の 有 効 性 を 調 べ る と,比 重 密 度 勾 配 法 で 上 清 分 画 に ウ イ ル ス 量 が 多 い 症 例 の 方 がIFN抵 抗 性 の 傾 向 が あ る と 報 告 し て い る.一 方,こ の 研 究 は,定 性 的 判 断 に 基 づ い て い る こ と,比 重 の 差 だ け で 分 離 し,そ の 重 い 部 分 が 抗 原 抗 体 複 合 体 で あ る か は 不 明 で あ る こ と,ま た,他 の 施 設2,3) か ら は,組 織 病 型 を 統 一 し て い な い が,HCV粒 子 の 免 疫 複 合 体 が 多 い ほ どIFNの 無 効 例 が 多 い な ど相 反 す る 成 績 も報 告 さ れ て お り,一 致 し た 成 績 は な い. 今 回 は,す で にIFN治 療 を 行 っ たC型 慢 性 肝 炎 症 例 の 中 でIFN耐 性 の 多 いGenotype 1bの 症 例 に つ い て,厚 生 省
のIFN判 定 基 準(1991年)4,5)でIFN有 効(Complete
Response:CR)で あ っ た も の と 無 効(Non-Response: NR)で あ っ た 症 例 を 対 象 と し,retrospectiveに,IFN投 与 前 のHCV RNAが 同 じ ウ イ ル ス 量(遊 離 の ウ イ ル ス と 免 疫 複 合 体 中 の ウ イ ル ス の 総 量)で あ り,か つ 組 織 病 型 を 一 致 さ せ て,抗 ヒ ト免 疫 グ ロ ブ リ ン 抗 体 を 血 清 に 添 加 し て,人 工 的 に 免 疫 複 合 体 と 上 清 に 分 離 し,各 分 画 の HCV RNA量 を 微 量 か ら高 濃 度 ま で 比 較 的 直 線 的 に 測 定 可 能 と さ れ るReal-time PCR法6)で 測 定 ・解 析 す る こ と に よ り,IFNの 治 療 効 果 をIFN投 与 開 始 前 に 予 想 す る こ と が 可 能 か ど うか を検 討 した の で 報 告 す る. 対 象 と 方 法 対 象:Genotype 1bで ア ン プ リ コ ア 法1)に よ る 定 量 で ほ ぼ 同 程 度 の 治 療 前 の ウ イ ル ス 量 で あ り,同 時 に 肝 組 織 病 型 が 新 犬 山 分 類7)でfibrosis(F)の 程 度 がII∼IIIのC 型 慢 性 肝 炎 症 例 の う ち,年 齢,性 別 も 同 じ よ う に 考 慮 し て,IFN有 効 例(CR例)5例 とIFN無 効 例(NR例)5例 のIFN治 療 前 日 の 血 清 を 研 究 対 象 と し た.各 々 の 年 齢, 性 別 を含 む 臨 床 背 景 を 表1に 示 し た. 方 法:各 保 存 血 清100μlを 蒸 留 水 で1mlに 希 釈 し,抗 ヒ トIgG+A+Mウ サ ギ 抗 体(DAKO社)42 .9μ1を 添 加, 室 温 で2時 間 撹 拌 後,15,000rpm15分 間 遠 沈 し上 清(Sup) と 沈 渣(Ppt)を 分 離 し 沈 渣 は 生 理 食 塩 水1mlに 溶 解 し た.な お,各 々 の 詳 細 は さ き の 報 告8)に 従 っ た.上 清 と 沈 渣 を そ れ ぞ れ0.5mlず つ,SRL社 に 提 出 し,Real-time PCR法6)で 定 量 を行 っ た. 一 方HCV RNA定 量 の た め に ,希 釈 法 に よ る 半 定 量 的 reversetranscription-PCR(RT-PCR)法9)に よ る解 析 も 実 施 し た.各 上 清(Sup)と 沈 渣(Ppt)を さ き の 方 法 で, 表1対 象症例の臨床的背景 (平 成14年1月16日 受 理) 指 導:辻 孝 夫 教 授(岡 山 大 学 大 学 院 医 歯 学 総 合 研 究 科 消 化 器 ・肝 臓 ・感 染 症 内科 学(内 科 学 第 一)) 論 文 請 求 先:コ ー プ み ん な の 診療 所 〒703-8228岡 山市 乙多 見101番 地-4 眞 鍋 良 二 電 話:086-278-8522 FAX:086-278-8523 E-mail:[email protected]
最 終 的 に1mlに 溶 解 し た も の の う ち0.5mlをSRL社 に 提 出 し た 残 り の0.5mlを 用 い,5μ1か ら ス タ ー ト し,生 理 食 塩 水 で100倍,1,000倍,10,000倍 希 釈 液 を 作 成 し,各 々 希 釈 液 を200μ1ず つ 用 い て,Nakagawa9)ら の 方 法 に 準 じ て RT-PCRを 行 っ た.増 幅 産 物 は3%ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 後,エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ドに よ り染 色 し写 真 撮 影 した. 表2免 疫沈降後の分画別HCVRNA量 とINF治療効果
A Amplicor法(HCV RNA K copy/ml)
,B Real-time PCR法(HCV RNA copy/ml) 結 果 CR例 とNR例 の ア ン プ リ コ ア 法 に よ るHCVRNA量 の 測 定 は,表2に 示 す よ う にCR群 とNR群 の 問 に は 有 意 な 差 は な か っ た. Real-time PCR法 に よ る 各 症 例 のSupとPptの 成 績 に つ い て は,表2に 示 す よ う にCR群(症 例No.1∼No.5)と NR群(症 例No.6∼No.10)に お い て,ア ン プ リ コ ア 法 に
よ る 測 定 結 果 はK copyに よ り表 しReal-time PCRはSupと
Pptに 区 別 し,各 々,Sup(S)単 独,Ppt(P)単 独, Sup/Ppt(S/P),両 者 の 和(S+P)に つ い て も検 討 を 行 っ て み た.CR群 がSup/Pptで 大 き い 傾 向 に(p=0.1172), Ppt単 独 で 少 な い 傾 向 に(p=0.1732)あ っ た が 有 意 な 差 は 認 め な か っ た.ま た,Sup+Ppt(S+P)の 和 は 表2の よ う に7300か ら19,800ま で,幅 広 い 分 布 を 示 し て い た. 同 量 のPpt溶 解 液 とSupを 採 取 して い る の で,両 者 の 和 は ほ ぼ 一 定 に な る と 予 想 し て い た が,結 果 は 広 い 範 囲 に 分 布 し て い た.(表2) 一 方 ,SupとPptを 各 々 希 釈 し て 行 っ た 半 定 量 的RT-PCR法 に よ る 結 果 は.図1に 示 す 通 り で あ り,各 々 の 希 CR例 症 例1 症例2 症例3 症例4 症例5 NR例 症 例6 症 例7 症 例8 症 例9 症 例10 図1半 定 量 的RT-PCRに よ る 免 役 沈 降 分 画 に お け るHCV
レ ー ン1:100倍 希 釈 検 体,レ ー ン2:1,000倍 希 釈 検 体,レ ー ン3:10,000倍 希 釈 検 体,M:DNA size marker (DNA Molecular Weight Marker V,Roche Diagnostics,Tokyo,Japan),C:陰 性 対 照(生 理 的 食 塩 水 の み)
表3免 疫 沈 降 後 のHCVRNA量 とINF治 療 効 果 ―一 定 量 法 に よ る比 較 ―
A Arnplicor法(HCV RNA K copy/ml) ,B Real-time PCR法(HCV RNA copy/ml),c半 定 量 的RT-PCR法,DS+P
釈 倍 数 にお け る 検 出感 度 は 明確 で あ っ た が,個 々 のIFN 治療 効 果 との 関 連 につ い て は差 が なか っ た.(表3) 考 察 C型 慢 性 肝 炎 症 例 に お い て,(1)ウ イ ル ス 量 が 多 い, (2)Genotypeが1bで あ る,(3)NS5Aが 野 生 型 で あ る,(4)肝 組 織 の 線 維 化fibrosis(F)が 進 行 して い る,(5)血 小 板 が 低 値 で あ る 症 例 な ど はIFNの 治 療 効 果 が 乏 しい と考 え ら れ て い る10,11).しか し,同 じ1bに お い て も ウイ ル ス量 が多 い に も か か わ らず 治 療 効 果 が あ る症 例(CR例)が あ り, そ の有 効 性 の原 因 に つ い て は不 明 の ま まで あ る. 今 回,私 は,さ き のAraki8)ら の 成 績 か ら考 え られ る よ うにC型 慢 性 肝 炎 症 例 の血 中 に お い て,同 じHCV RNA 量 で あ っ て もす で にHCV粒 子 に対 す る 抗 体 が で きて お
り,soluble immune complexと して ウ イ ル ス粒 子 に免 疫 グ ロ ブ リ ンが 結 合 して い る も の が あ る と考 え,抗 ヒ ト IgG+A+M抗 体 を用 い て,免 疫 グ ロ ブ リ ン が 結 合 した HCV粒 子 と遊 離 のHCV粒 子 を選 別 して各 々 のHCV RNA 量 を測 定 しそ の 結 果 か らIFNの 投 与 前 に,IFNの 治 療 効 果 が予 想 で き るか 否 か を検 討 した. そ の結 果,Wato1)ら が粒 子 の重 い 方,す な わ ち 沈 渣 の HCVRNA量 が 多 い 方 が,そ し て上 清 に 少 な い 方 が 若 干 IFN治 療 効 果 が 高 い と し た報 告 と異 な り,免 疫 グ ロ ブ リ ンを結 合 して い る(沈 渣 のHCV RNA)比 率 が 小 さ い方 が,ま た沈 渣 のHCV RNA単 独 で 少 な い方 にIFN治 療 効 果 が 高 い(CR)例 が多 い傾 向 が あ った が,統 計 的 に は有 意 な差 は な か っ た.一 般 的 に はC型 慢 性 肝 炎 例 で は,血 清 トラ ンス ア ミ ラ ー ゼ値 が 高 い症 例 あ る い は 変 動 して い る 症例 に,よ りIFNの 治 療 効 果 が あ る10)とい わ れ て お り, 沈渣 のHCV RNA量 が多 い症 例 で は血 清 トラ ンス ア ミ ラー ゼ 値 の 変 動 も予 想 さ れ,効 果 が 多 い と予 想 さ れ た が 必 ず し も一定 の傾 向 で は な か っ た. 今 回 は,抗 体 の 量 を あ らか じめ一 定 に して お り症 例 数 が 少 なか っ た た め,今 後,添 加 す る抗 体 量 を多 く した り 症 例 を 重 ね る こ と,特 に1b以 外 の2aや2bな ど の 他 の Genotypeも 併 せ て検 討 す る事 に よ り有 意 な成 績 が 得 られ る の で は な い か と考 え られ た. ま た,免 疫 グ ロ ブ リ ン結 合HCV粒 子 と血 清 トラ ンス ア ミナ ー ゼ の 急 性 増 悪 との 関係 に関 して,現 時 点 で は ほ と ん ど報 告 が み られ ない.す で に報 告8)さ れ て い る よ うに, Clqを 結 合 す る よ う な免 疫 複 合 体 は,慢 性 肝 炎 の 急 性 増 悪 の 前 後 で 高 く,急 性 増 悪 期 で は低 下 して い る こ とな ど が,B型 肝 炎 と非A非B型 肝 炎 で は明 らか に され てい るが, 免 疫 グ ロ ブ リ ン結 合HCV粒 子 につ い て は,さ ら に知 見 が 集積 さ れ る こ と に よ り,今 後,興 味 あ る結 果 が 得 ら れ る 可 能性 が示 唆 され た. な お,ア ンプ リコ ア法 に よ り測 定 したHCV RNA量 を一 定 に して も,Real-time PCR法 で は種 々 の ば らつ い た 定
量 値 が 得 られ る所 か ら,HCV RNAの 正 確 な定 量 は 困難 で あ る こ と,さ ら に今 回 行 っ た よ う な100倍,1,000倍, 10,000倍 希 釈 な ど,希 釈 法 に よ る半 定 量 法 もHCV RNA量 の 定 量 法 と して有 用 で あ る こ とが示 唆 され た. 結 論 ア ン プ リ コ ア 法 に よ るHCV RNA量 が ほ ぼ 等 し い Genotype 1bのC型 慢 性 肝 炎 症 例10例(IFN有 効 例(CR 例)5例IFN無 効 例(NR例)5例)に つ い てIFN治 療 効 果 を投 与 前 にHCV粒 子 に対 す る免 疫 グ ロ ブ リ ン の結 合 状 態 か ら予 想 す る こ とが で きる か 否 か検 討 した. そ の 結 果,免 疫 グ ロ ブ リ ン を結 合 したHCV粒 子(沈 渣 のHCVRNA)の 比 率 が 小 さ い 方 に,ま た 沈 渣 のHCV RNA単 独 で 少 な い方 にCR例 が 多 い傾 向 にあ った が,有 意 とは い え な い 結 果 を得 た.HCV RNAの 定 量 は,ア ン プ リ コア法 とReal-time PCR法 で 一 致 しない 症 例 もあ り,血 清 希 釈 法 に よ る 半 定 量 的RT-PCR法 に よ る 測 定 もHCV RNA定 量 法 と して有 用 と考 え られ た. 謝 辞 稿 を終 え る にあ た り,御 指 導 と御校 閲 を賜 っ た恩 師 岡山大 学 大学 院 医歯 学総 合研 究科 消化 器 ・肝 臓 ・感 染 症 内科 学(第 一 内科)講 座 の辻 孝 夫 教授 に深 謝 い た します.ま た,直 接 実験 の 指導 をい た だ いた 同講 座 の 下村 宏 之講 師,岩 崎 良 章助 手 と梶 谷 浩子 技術 補 佐員 と論 文完 成 に御助 力 いた だい た久 田典 子教授 秘書 に感謝 いた します. 文 献
1) Wato M, Shimomura H, Fujio K, Tsuji H, Kondo J, Fujioka S, Ishii Y, Hada H and Tsuji T: Relationship between response to interferon therapy and detection of hepatitis C virus RNA differential flotation centrifugation. Acta Med Okayama
(1996) 50, 139-144
2) Kanto T, Hayashi N, Takehara H, Hagiwara H, Mita E, Naito M, Kasahara A, Fusamoto H and Kamada T: Buoyant density of hepatitis C virus recovered from infected hosts: Two different features in sucrose equilibrium density-graduent centrifugation related to degree of liver inflammation. Hepatology (1994) 19, 296-302
3) Kanto T, Hayashi N, Takehara H, Hagiwara H, Mita E, Naito M, Kasahara A, Fusamoto H and Kamada T: Density analysis of hepatitis C virus particle population in the circulation infected hosts: Implications for virus neutralization or persistence. J Hepatol (1995) 22, 440-448 4) 飯 野 四郎: C型 慢 性 肝 炎 の治 療. 厚 生 省 特 定疾 患 難 治性 の 肝 炎 調 査研 究班 平 成三 年度研 究 報告 (1991) 191-193 5) 飯 野 四郎: C型 慢 性 肝 炎 の イ ン ター フ ェ ロ ン治 療. 厚生 省 特 定 疾 患 難治 性 の肝 炎調 査研 究 班平 成 五年 度研 究 報告 (1993) 21-24
6) Takeuchi T, Katsume A, Tanaka T, Abe A, Inoue K, Tsukiyama-Kohara K, Kawaguchi R, Tanaka S and Kohara M: Real-time detection system for quantification hepatitis C virus genome. Gastroenterology (1999) 116, 636-642
7) 辻 英 之 、 辻 孝 夫: 新 しい 慢 性 肝 炎 組 織 診 断 基 準 (新 犬 山 分 類) とB型 ・C型 肝 炎. 医 学 の あ ゆ み (1999) 190, 769-773
8) Araki K, Nagashima H and Tsuji T: Detection and characterization of circulating immune complexes during acute exacerbation of chronic viral hepatitis. Clin exp Immunol
(1982) 47, 520-526
9) Nakagawa H, Shimomura H, Hasui T, Tsuji H and Tsuji T: Detection of negative strande RNA of hepatitis C virus in infected liver and serum. Acta Med Okayama (1993) 47, 311-316 10) 辻 孝 夫: 慢 性 ウ イ ル ス 肝 炎 の 病 態 と治 療. 日 内 会 誌 (2001) 90, 1633-1642. 11) 林 紀 夫: C型 肝 炎 の 治 療 法: 慢 性 肝 炎 治 療 マ ニ ュ ア ル, 日本 肝 臓 学 会 監 修 ・ 日本 肝 臓 学 会 企 画 広 報 委 員 会 編, 医 学 書 院, 東 京 (2001) pp60-68
