はじめに 学習や記憶，情動，意識などの脳高次機能の 発現には，脳内神経回路網における適切な情報 伝達が不可欠である。シナプスは神経細胞間の 接着装置であり，近年，数多くのシナプス蛋白 質が同定され，それらの機能解析が行われてき た。シナプスは大きく，前シナプス，シナプス 間隙，後シナプスの 3 領域に分けることができ る。前シナプスには神経伝達物質を含有したシ ナプス小胞がクラスターを形成し，アクティブ ゾーン（active zone; AZ）と呼ばれる構造体に ドッキングしている（図 1）。活動電位の刺激 によって Ca2+が神経終末に流入するとシナプ ス小胞は前シナプス形質膜に融合し，神経伝達 物質がシナプス間隙に放出される。放出された 神経伝達物質は後シナプスに存在する各種神経 伝達物質受容体に結合し，後神経細胞に情報が 伝達されてゆく。この一連の情報伝達の中で， AZ はシナプス小胞がドッキングし融合する特 異的な構造体であり，神経伝達物質の放出の位 置とタイミングを制御している。 私たちは数年前に，新規の AZ 特異的蛋白質 を精製し CAST（Cytomatrix at the active zone-associated structural protein）と命名した。そ の他にも，AZ 特異的蛋白質として Bassoon， Piccolo，RIM1，Munc13-1，ELKS などが知ら れている。近年の分子生物学・生化学的な解析 によって，これら AZ 蛋白質間の相互作用と， 前シナプスからの神経伝達物質放出における AZ の役割が明らかになりつつある。本稿では， シナプス伝達の中でも特に前シナプス・AZ の 構造と構成分子群の生理機能について，CAST を中心に，最近の話題を提供したい。 I．AZ の構造 前シナプスには神経伝達物質を含有したシ ナプス小胞がクラスターを形成している1）。こ のシナプス小胞の一部は AZ に特異的にドッ キングしている。形態学的に見ると，AZ は比 較的電子密度の高い領域として前シナプスの 形質膜直下に見いだされる2–4）（図 1）。電子密 ばれる神経細胞間の接着部位であり，このシナプスの形成・維持・破綻のメカニズムを明らかにす ることで，複雑な神経回路網の動作原理を分子レベルで解明できると考えられる。本稿では，特に 前シナプスからの神経伝達物質放出に関わる構造体・アクティブゾーンの分子構造基盤に関する最 近の研究を紹介したい。 キーワード アクティブゾーン，CAST，シナプス小胞 〒 409-3898 山梨県中央市下河東 1110 番地 受付：2012 年 12 月 6 日 受理：2012 年 12 月 12 日
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度が高い領域は（図 1 のピラミッド状の構造 体），スペトリン等のアクチン結合蛋白質が主 要構成分子の一つであり，AZ における細胞骨 格（Cytomatrix at the AZ; CAZ）とも呼ばれて いる。本稿では，この細胞骨格と形質膜を合わ せた部分を AZ と定義する。 現在，数多くの種で特徴的な AZ 構造が見出 されている5）。例えば，網膜のシナプスでは， 細長いリボン状の AZ が存在し，その根元にカ ルシウムチャネルなどの神経伝達物質放出に 関わる分子群が局在している6）（図 1）。また， AZ は種を超えてよく保存さており，進化的に もシナプスを構成する重要な構造体の一つと考 えられる。 90 年代に入り，AZ の構成分子群が明らかに なってきた。現在 AZ 特異的蛋白質として知 ら れ て い る も の は，Bassoon7），Piccolo8–10）， RIM11），Munc13-112），CAST13,14），ELKS14,15） がある（図 2）。
II．AZ 構成蛋白質
Piccolo は， ド イ ツ の Gundelfi nger ら の グ ループによって最初に同定された AZ 蛋白質で 分子量が 500 kDa を超える巨大な蛋白質であ る8）。 同 じ く 分 子 量 が 400 kDa を 超 え る Bassoon と特異的な相同性を示す。Piccolo は そのカルボキシル末端にカルシウムイオンの 結合ドメインとして知られる C2 ドメインを 有する。Bassoon については，ノックアウト マウスが作製され，解析がおこなわれている。 Bassoon ノックアウトでは，興奮性のシナプス の約半分が不活性化の状態になり，生まれた 個体は約 2 週間で痙攣を起こして死亡する16）。 電気生理学的には，プライミングの段階に異常 が見られる。プライミングとは，シナプス小胞 が AZ にドッキングした後，膜と融合するまで の段階のことで，プレ融合段階とも呼ばれる。 このプライミングの状態にあるシナプス小胞の みが Ca2+の流入によって，膜と融合し，含有 する神経伝達物質をシナプス間隙に放出する17）。 最近，Bassoon ノックアウトの小脳を用いた解 析から，Bassoon がシナプス小胞の AZ への再 充填 reloading を制御していることが明らかと なった18）。Piccolo ノックアウトでは著明な表 現型は見出されないが，Bassoon とのダブル ノックアウトでは Bassoon の表現型がより重 篤になるため，Bassoon の機能を修飾している 可能性が高い19）。 RIM1 は当初，低分子量 G 蛋白質 Rab3A の 図 1．シナプスと AZ シナプスの概略図．（A）高等動物の脳（海馬）のシナプスでは，AZ に電子密 度の高い領域が存在する（ピラミッド型の部分）．（B）脊椎動物網膜の AZ．特 徴的なリボンのような構造をしていることからリボンシナプスとも呼ばれる．
標的分子として見出された11）。海馬の電気生 理学的解析から，RIM1 もプライミングのス テップを制御していることが明らかになって いる20）。RIM1 ノックアウトマウスでは，行 動学的解析から，海馬に依存した学習と記憶 の発現に異常が見られる24）。また，海馬のス ライス培養実験から，RIM1 ノックアウトマ ウスでは，海馬の CA3 領域の長期増強 Long term potentiation（LTP）の維持に異常が見ら れた21,22）。LTP は，神経細胞に高頻度の電気 刺激（テタヌス）を加えることで，その後長 期にわたってシナプスにおける伝達効率が上 昇する現象で，シナプス可塑性の代表例であ る。Munc13-1 は線虫 unc13 のラット相同遺伝 子として単離された23）。UNC 変異体は，行動 異常（uncoordinated）を示す一群の変異体で， Unc13 変異は最も重篤な表現型を示す変異体 のひとつである23）。Munc13-1 は RIM1 と結合 することでプライミングのステップを制御し ていると考えられているが24），RIM1 ノックア ウトマウスとは異なり，Munc13-1 ノックアウ トマウスは生後すぐに死亡する24）。Munc13-1 ノックアウトマウスでは，神経伝達物質の放出 が完全に欠失しており，Munc13-1 はプライミ ングステップのマスター蛋白質であると考えら れている。 図 2．AZ 蛋白質 （A）比較的高分子の蛋白質が多い．コイルドコイル領域や PDZ ドメインなど，蛋白質間の相 互作用に関与するドメインを有することから，多数のシナプス蛋白質と複合体を形成している と考えられる．（B）ELKS/CAST ファミリーメンバー．ELKS は神経以外に発現が見られるス プライシング・アイソフォームが存在する．高等動物には CAST と ELKS の 2 つが存在する． 線虫では 1 つ．ハエでは、現在少なくとも 1 つが同定されている（Bruchpilot）．Bruchpilot は他の CAST ファミリーメンバーに比べて分子量が大きく，C 末領域は相同性が低い．また， 特徴的なアミノ酸モチーフ IWA も有していない．
112 大 塚 稔 久 III．CAST とその生理機能 このように，少ないながらも AZ 特異的な蛋 白質が同定・解析されてきたが，その数は後シ ナプスにおいて明らかにされた分子群に比べる と圧倒的に数が少ない。筆者らは，古典的な生 化学的手法と質量分析法を用いて，ラット大脳 より新規の AZ 蛋白質 CAST（CAZ-associated STructural protein）を精製・同定することに 成功した（図 2B）。 CAST は分子量がおよそ 120 kDa の蛋白質 で，複数のコイルドコイル領域とカルボキシル 末端に特徴的な 3 つのアミノ酸 IWA を有して いる。高等動物では，他にファミリーメンバー として ELKS がある25）。CAST は神経特異的 に発現し，免疫電顕法による解析から，神経シ ナプス前部の膜直下に特異的にシグナルが観察 される26）（図 3）。特に CAST は AZ に高度に 濃縮しており，AZ を検出するために適したマー カーの一つである26）。一方，ELKS は神経特異 的な分子と，神経以外の組織に発現するスプラ イシングアイソフォームを有している25）。神 経系において ELKS は，CAST と同様に AZ に 局在しており，CAST および ELKS は CAZ 蛋 白質の新たな構成分子ファミリーとして機能し ている。 次に私たちは，CAST の機能を明らかにする 目的で，その結合蛋白質の同定を試みた。AZ 図 3．海馬における CAST の局在 海馬 CA3 領域における抗 CAST 抗体を用いた免疫電子顕微鏡．中央は樹状突起で，その周り にシナプス小胞がクラスターを形成しているシナプスが同定できる．黒いシグナルが銀増感法 による CAST のシグナル．CAST は前シナプス形質膜直下に特異的に局在しているのが分かる． 文献 13 より転載．Bar は 100 nm．
画分を含むシナプス結合画分を陰イオン性の 強力な界面活性剤である SDS にて可溶化し， Triton X-100 にて中和後，抗 CAST 抗体で免 疫沈降実験を行った。驚いたことに，既知の AZ 蛋白質がすべて共沈してくることが明らか となった37）。その後，詳細な生化学的解析か ら，Bassoon，Piccolo，RIM フ ァ ミ リ ー が 直 接 CAST/ELKS と結合することが明らかとなっ た27）。CAZ は 比 較 的 電 子 密 度 の 高 い 構 造 で あるが，おそらく CAST を介した巨大な蛋白 質の複合体がその分子基盤ではないかと想像 している（図 4）。また CAST と RIM1，また は CAST と Bassoon の結合を阻害すると，神 経伝達物質の放出も阻害されることから27）， CAST を介した複合体は構造的な役割だけでな く，機能的な役割も担っていると考えられる。 では，生体における AZ の機能は何か？ ひ とつのヒントがハエの遺伝学からもたらされ た。10 年以上前に，nc82 というモノクローナ ル抗体がハエの脳の抽出液を免疫することで偶 然に得られていた28）。興味深いことに，この 抗体はハエのシナプスの AZ を認識しているこ とが知られていたが，その抗原については謎の ままであった。しかし，最近になって，nc82 の抗原が実は CAST と高い相同性を有した蛋 白質であることが明らかになった29,30）。この蛋 白質はアミノ末端領域が CAST に相同性が高 く，一方カルボキシル末端は相同性がなく細胞 骨格系蛋白質のスペクトリンなどと類似した構 造を有していた（図 2B）。この蛋白質をコード する遺伝子はその変異体（RNA 干渉法で遺伝 子発現を抑えたもの）が飛べずに落ちる（crash 図 4．AZ 蛋白質の相互作用
CAST お よ び ELKS は 互 い に 相 互 作 用 し，C 末 で RIM1 と 結 合 す る． ま た，Bassoon と Piccolo もコイルドコイルドメインを介して，CAST に直接結合する．Munc13-1 は RIM1 に結 合しており，CAST を介した巨大な分子複合体が形成される．
114 大 塚 稔 久 する）ことから Bruchpilot（Brp）と名づけら れた（Bruch は英語で crash の意）。Brp の発 現が抑えられた変異体では，ハエの AZ 構造（通 称 T-bar）が完全に消失した29,30）。そして，全 長の Brp を発現させることで，T-bar の形成が 再び認められた。これは，ひとつの遺伝子をな くすことで，AZ 構造そのものが消失した最初 の例であり，CAST ホモログ Brp は少なくと もハエにおいて AZ の形成に必須の蛋白質であ ることが証明された。さらに，電気生理学的解 析から，Brp 変異体では，神経伝達物質の放出 が阻害された。光学顕微鏡を用いた解析でも， カルシウムチャネルが AZ に濃縮せず，diffuse な局在パターンを示すことが確認された31）。 したがって，Brp（つまり AZ 構造体）は直接 もしくは間接的にカルシウムチャネルと相互作 用し，AZ におけるカルシウムチャネルの集積 を制御している可能性が高い。最近私たちは， CAST がカルシウムチャネルのサブユニットの 一つであるβ サブユニットと直接結合し，その 活性を制御していることを見出した32）。 最近，CAST のノックアウトマウスの解析か ら，CAST が抑制性のシナプス伝達を特異的に 制御しているという報告がなされた33）。一方 で，AZ の構造に変化はなく，ファミリーメン バーである ELKS が相補的な役割を果たして いることが示唆される。高等動物における AZ の構造の破たんとその意義を解明するためには CAST および ELKS のダブルノックアウトマ ウスの作製と機能解析が待たれるところである が，私たちは CAST ノックアウトマウスの作 製と解析を独自に進め，CAST が網膜の AZ で あるリボンシナプスの大きさを決定しているこ とを世界で初めて明らかにした34）。 IV．AZ とカルシウムチャネル 前述の CAST ホモログ Brp とカルシウムチャ ネルの相互作用に加え，今一つの AZ 蛋白質 RIM1 とカルシウムチャネルの相互作用が明ら かとなっている。京都大学の森らは RIM1 が カルシウムチャネル複合体のβ サブユニット と直接結合することを見出した35）（図 4）。β サ ブユニットはα サブユニットのシナプスへの 局在に必須とされており，RIM1 がカルシウム チャネルの anchoring 蛋白質として機能して いることを示唆する。また，通常電依存性カル シウムチャネルは，活性化開口した後に不活性 化状態へと移行して Ca2+流入が減衰する。し かし，RIM1 がβ サブユニットに結合すると不 活性状態への移行は阻害され Ca2+流入が持続 することが明らかとなった。また，PC12 細胞 を用いた解析から，RIM1 全長や C 末端の過剰 発現により伝達物質であるアセチルコリンの放 出が増加し，一方ドミネントネガティブ体を発 現させた際には放出が減少することが明らかと なった。このことから，AZ における RIM1- 電 位依存性カルシウムチャネルβ サブユニットの 結合は，シナプス小胞をカルシウムチャネル近 傍につなぎとめ，カルシウムチャネルの不活性 化を防ぐことで Ca2+流入を持続させる役割を 担っていると考えられる。 さ ら に 最 近，Sudhof ら の 研 究 チ ー ム は， RIM1 がα サブユニットと直接相互作用する ことを報告した36,37）。P/Q および N タイプの α サブユニットのカルボキシル末端を bait に した酵母 two-hybrid スクリーニングによって， RIM1 の PDZ ドメインを含むフラグメントを 単離した。RIM1 およびファミリーメンバー である RIM2 のダブルノックアウトマウスで は，蛋白質レベルの発現量に変化はないもの の，AZ におけるカルシウムチャネルの集積が 著明に阻害されていた。さらに，シナプス小胞 のプライミングの過程が阻害されていた。ま た，この表現型は，RIM 蛋白質の PDZ ドメイ ンによってレスキューされることから，生体内 において RIM 蛋白質がカルシウムチャネルを AZ の近傍につなぎとめ，Ca2+とシナプス小胞 の距離を近づけることで，効率的な神経伝達物 質の放出を制御していると考えられる。一方で， RIM1 の PDZ ドメインは CAST との相互作用 に必須のドメインであることから，生体内にお
理学的な解析から，神経終末 AZ の構造と機 能に関して大きな進展があった38）。その一方， いくつかの重要な謎は未解決のままである。1） AZ 特異的な分子群はほかにも存在するのか； 2）AZ 蛋白質の組み合わせと相互作用の違い によって，シナプスの特性が変化するのか；3） AZ 構造体を前シナプス形質膜に固定する分子 基盤は何か。今後，このような分子レベルの解 析に加え，光遺伝学や遺伝子改変動物を用いた 研究によって，AZ という構造体が高等動物の 脳機能と行動にとってどのような役割を果たし ているのか，個体レベルで明らかになることを 期待したい。 謝 辞 これまでの研究を支えてくれた国内外の共同 研究者の方々，家族，ならびに現教室のメンバー に，特に図表の作製に尽力してくれた飛田耶馬 人君にこの場を借りて深謝申し上げます。 文 献
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