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Instrument Handbook
日本語取扱説明書
Bia co re X コ ン ト ロ ー ル ソ フ ト ウ ェ ア 日 本 語 取 扱 説 明 書Biacore
®
X
2008 GE ヘルスケア バイオサイエンス株式会社 本書の全部または一部を無断で複写複製することは、著作権法上の例外を除き、禁じられています。 掲載されている製品は試験研究用以外には使用しないでください。掲載されている内容は予告なく変更される場合がありますのであらかじめご了承ください。 掲載されている社名や製品名は、各社の商標または登録商標です。 e-mail WebBiacore®X
目次
1．電源およびソフトウェアの起動 1 1-1. 電源の立ち上げ 1 1-2. ランニング緩衝液、廃液ビンのセット 1 1-3. ソフトウェアの起動 1 (補足 1) ランニング緩衝液の調製 1 2．システムの初期化 3 2-1. センサーチップの挿入 3 (補足 2) センサーチップの種類 4 2-2. ランニング緩衝液によるシステムの置換 4 2-3. 測定温度の設定 6 2-4. Normalize 6 3．基本操作 7 3-1. 測定の開始 7 3-2. 試料溶液の添加 8 (補足 3) サンプルロードの方法 9 (補足 4) サンプルの回収 10 3-3. 測定の終了 11 3-4. レポートポイントの記録 11 3-5. データの保存 13 3-6. データのクローズ 13 4.リガンドの固定化 14 4-1. リガンド希釈用緩衝液の至適 pH の選択 16 (補足 5) プレコンセントレーションの評価 18 4-2. マクロプログラムの実行 19 4-3. センサーグラムの終了 23 4-4. レポートポイントの設定 23 4-5. データの保存 25 4-6. データのクローズ 25 (補足 6) アミンカップリングの標準プロトコール 25 (補足 7) 固定化全体における注意事項 26 (補足 8) マニュアルインジェクションを用いた固定化量の調節 275. アナライトとの相互作用測定 31 5-1. センサーグラムの開始 33 (補足 9) センサーグラムの表示 34 5-2. アナライトの添加 35 5-3. 再生溶液の添加 36 5-4. レポートポイントの記録 37 5-5. 新規サイクルへの変更 38 (補足 10) 同一ファイル内への保存 39 5-6. センサーグラムの終了 39 5-7. データの保存 39 (補足 11) 複数のサイクルを持ったファイルの保存様式 40 6. システムの終了 41 6-1-1. 2～3 日以内で継続して使用する場合 41 6-1-2. 電源を落として終了する場合 41 6-2. センサーチップの取り出し 41 6-3. システムの終了 42 6-4. センサーチップの保存 42 7. メンテナンス 43 (補足 12) コネクターブロックのメンテナンス 44 8. システムチェック 45 9. 警告ボックス 48 9-1. コンプレッサーからのプレッシャーが足りない時 48 9-2. 定期的にメンテナンス(Desorb)が行われていない時 48 10. データ管理 49 10-1. フォルダーの作成 49 10-2. フロッピーディスク（2HD）への保存 50 11. 索引 51
1.電源の入れ方，ソフトウェアの起動 1
1. 電源およびソフトウェアの起動
1-1. 電源の立ち上げ 定電圧電源装置 → コンプレッサー →プリンター → モニター画面 → シス テム本体 → コンピューターの順に電源を入れます。 システム本体の電源を立ち上げると、本体中央にあるインジケータ(ライト)がす べて点灯します。30 秒ほどでリセットされ、新たに必要項目のみが点灯あるい は点滅します。 1-2. ランニング緩衝液,廃液ビンのセット ランニング緩衝液(補足 1)入りボトルは所定の位 置にセットした後、シリンジポンプから出ている インレットチューブをボトルに差し込みます。ま た、システム本体左のコネクターブロック下部に 廃液ビンを置きます。 1-3. ソフトウェアの起動モニターの初期画面左下のStart → BIA Programs → BIACORE X
のアイコンをクリックして、ソフトウェアを起動させます。
(補足 1) ランニング緩衝液の調製
●弊社で販売しているランニング緩衝液
HBS-EP(フィルターろ過,脱気済み)
10 mM HEPES pH7.4 containing 0.15 M NaCl , 3 mM EDTA and 0.005 % Surfactant P 20(Tween 20)
HBS-P(フィルターろ過,脱気済み)
10 mM HEPES pH7.4 containing 0.15 M NaCl , 0.005 % Surfactant P20
HBS-N(フィルターろ過,脱気済み)
10 mM HEPES pH7.4 containing 0.15 M NaCl
●実験にあわせ、ランニング緩衝液の変更は可能です。各自で調製する場合に
は、0.22 μm フィルターろ過を行い、十分脱気をしてください。センサーチッ
プCM5(補足 2)を使用する場合、固定化操作終了時まで、アミン系の緩衝液(ト
2 1.電源の入れ方，ソフトウェアの起動 ① ② ③ ④ ⑥ ⑤ ① Menu bar BIACORE のメニューコマンドを選択します。主要なコマンドについてはショー トカット key で操作できます。 ② Tool bar 使用頻度の高いコマンドをアイコン化してあり、アイコンをクリックするだ けでコマンドを選択できます。 ③ Sensorgram window センサーグラムをリアルタイムに表示します。
④ Report point table
指定したReport point について必要なデータを表示します。
⑤ Event log window
実行した操作事項を経時的に記録します。
⑥ Status window
2. システムの初期化 3
2．システムの初期化
2-1. センサーチップの挿入 ①センサーチップポートカバーを開ける ②コンベアーを引く ③センサーチップをセットする ④コンベアー、カバーを戻すセンサーチップを挿入すると、BIACORE 本体のインジケータの Sensor chip の緑
ランプが点滅します。
画面に表示されるDock のダイアログボックスの Dock をクリックします。
(ボックスが画面に表示されていない場合は、Menu bar の Command から Dock
を選びます。)
完全にDock が終了すると、インジケータの Sensor chip の緑ランプが点灯に変
4 2. システムの初期化 (補足 2) センサーチップの種類 CM5 カルボキシメチルデキストランをコーティングしたセンサーチップ。サンプル のアミノ基,チオール基,アルデヒド基を介して固定化することができ、最も汎用 性の高いセンサーチップです。 SA ストレプトアビジンをあらかじめ固定化しているカルボキシメチルデキストラ ンベースのセンサーチップ。ビオチン化したサンプルの固定化に使用します。 NTA
NTA(N-(5-amino-l-carboxypentyl) iminodiacetic acid,キレート試薬)をあらかじめ固 定化しているカルボキシメチルデキストランベースのセンサーチップ。ヒスチ ジンタグを持つ融合タンパク質を、Ni を介して固定化できます。 HPA アルカンをコーティングした疎水性の高い表面を持つセンサーチップ。糖脂質, リン脂質等の固定化に利用できます。リポソームを添加することにより、脂質 の単層(Monolayer)として固定化します。 2-2. ランニング緩衝液によるシステムの置換
Dock が終了すると、Working Tools の Prime が自動的に選択表示されます。Start…
をクリックします。(Prime 操作は、Tools → Working Tools → Prime を選択し
ても行うことができます) Prime は、ポンプやマイクロ流路系をランニング緩衝
液で平衡化する操作です。センサーチップをDock する時やランニング緩衝液を
2. システムの初期化 5
Prime 操作の内容が表示されますので、確認後改めて Start をクリックします。
3 分後、以下のダイアログボックスが表示されます。Exit をクリックして Prime を終了します。
6 2. システムの初期化
2-3. 測定温度の設定
Command → Set Temperature をクリックします。
4-40℃の測定温度の設定が可能です。Status Window 中で、実際の温度を表示し
ています。設定温度に達して安定すると Temperature は、赤色表示の点滅から
から黒色点灯表示に変化します。
2-4. Normalize
Tools → Working Tools → Normalize をクリックします。
Normalize は、SPR シグナルの校正を行うための操作です。Start…をクリック後、
新しいボックスのContinue を改めてクリックします。BIAmaintenance Kit 中の
BIAnormalizing solution 100 μl をサンプルループにシリンジあるいはオートピペ ットを用いてロード(補足 1 参照)し、Start をクリックします。所要時間は約 3 分。 注意事項 実験途中で温度を変更する場合は、温度が新規設定温度に達し、安定した後に Normalize のみ行ってください。
3.基本操作 7
3.基本操作
3-1.測定の開始もしくは Run → Run Sensorgram をクリックします。
(Sensorgram とは、Biacore で得られるグラフのことをいいます。)
Detection Mode, Flow Path を選択し、OK をクリックします。
Detection Mode では、検出モードを選択します。Single は、1 つのフローセル
のみの測定を、Multichannel は、同時に 2 つのフローセルの測定を行う時に選
択します。Detection Mode で Multichannel を選択しておけば、一連の測定中に
Flow Path を切り替えることも可能です。
Flow Path で試料溶液を添加するフローセルを選択できます。Fc1-2 を選択す
ると、試料溶液はフローセル1→2 と流れます。
流速(1～100 μl/min)を入力し、OK をクリックします。 センサーグラムが動き出します。
8 3.基本操作
3-2. 試料溶液の添加
もしくは Command → Inject をクリックします。
ここでは添加容量(10 μl)を入力します。添加容量は、最大 100 μl まで可能です。 試料溶液ロード(補足 3)後、Start Injection をクリックします。
3.基本操作 9 (補足 3) サンプルロードの方法 サンプルの添加には、100 μl あるいは 200 μl 用のオートピペットを使用します。 ●通常のサンプルロード サンプル必要量(サンプルの添加容量＋ 20 μl)を吸い取ります。 チップの先をサンプルチューブから抜き出し、目盛りを 5μl 分 空まわしし、air を吸います。 サンプルの吸い方 ＝(サンプルの添加容量 + 20 μl ) + ( air 5 μl ) ●相互作用測定時のサンプルロード サンプルが希釈されないよう下記のようにサンプルを吸います。 はじめにサンプル必要量(サンプルの添加容量 ＋ 20 μl)を吸い取 り、チップの先をサンプルチューブから抜き出し、5 μl 目盛りを 移動させ、air を吸います。さらに、チップの先を再びサンプルチ ューブのサンプルにつけ、5 μl 目盛りを移動させ、サンプルを吸 います。再びチップの先をサンプルチューブから抜き出し、5 μl 目盛りを移動させ、air を吸います。 希釈の少ないサンプルの吸い仕方
＝(サンプルの添加 Volume + 20 μl ) + ( air 5 μl ) + (サンプル 5 μl ) + ( air 5 μl )
上記のいずれかの方法でサンプルを吸ったオートピペットをコネクターブロッ
クのサンプル添加ポジション(3 つの穴の中央)にまっすぐ差し込み、試料をすべ
て添加します。
(注)オートピペットは 1 段階押した状態でロードします。2 段階目まで押し込む
10 3.基本操作
(BIAmaintenance Kit 中の BIAtest solution 10 μl を添加した例)
さらに試料溶液がある場合は、3-2 の操作を繰り返し行います。 添加した試料溶液を回収する場合は(補足 2)を参照ください。 (注)サンプルロードは、インジェクトボックス(3-2 のボックス)を画面上に出して から行ってください。 (補足 4) サンプルの回収 添加したサンプルの回収はオートピペット用チップをコネクターブロックの左 端のリカバリーポジションに入れて行います。 チップをリカバリーポジションにセットする前に、あらかじめ回収容量分の水 等を吸い、チップのどの位置まで吸い上がるか印をつけておきます。 試 料 溶 液 添 加 後 、 画 面 中 の S t a t u s w i n d o w 中 の サ ン プ ル 添 加 容 量 が 10 μl になったと同時に印をつけたピペットを回収ポジションに差し込みます。 溶液がチップの印をつけたところまで上昇した時点で、ピペットの上部を指先 で押さえ、別のチューブに回収します。
3.基本操作 11
3-3. 測定の終了
もしくは Run → Stop Sensorgram をクリックします。
Yes をクリックして、測定を終了します。
3-4. レポートポイントの記録
レポートポイントをとることで、センサーグラム上の任意の時間のレスポンス (RU)をセンサーグラム下のレポートポイントテーブルに表示させます。
もしくは View → Reference Line をクリックします。
ポインターを Reference Line の縦軸上に移動するとポインターが左右に開いた
矢印の形に変わります。この時点でポインターをドラッグしレポートポイント をとりたい位置に移動します。もしくは、センサーグラム上でレポートポイン トをとりたい位置でダブルクリックします。
12 3.基本操作
もしくは Edit → Add Report Point をクリックします。
Add Report Point のダイアログボックスの Id にコメントを入力し、OK をクリッ
クすると、センサーグラム下のレポートポイントテーブルにその時点でのRU 値
が記録されます。もし、その時点でのレポートポイントを基準(相対値を 0 RU)
としたい場合は、Add Report Point のダイアログボックスの□Baseline にチェッ
クを入れます。
さらにレポートポイントの記録を行う場合は、再びReference Line を移動後、
もしくはEdit → Add Report Point を繰り返し行います。
必要なレポートポイントの記録終了後、 もしくは View → Reference Line
3.基本操作 13
3-5. データの保存
File → Save As をクリックします。
Save in:の▼を使用し、保存先である自分のフォルダー(C:/Bia Users/各自のフォ
ルダー等)を指定し、File name:にファイル名を入力した後、Save をクリックし
ます。
3-6. データのクローズ
14 4.リガンドの固定化
4.リガンドの固定化
相互作用を検討する分子間で、センサーチップ表面に固定化する分子をリガン ドと呼びます。リガンドの精製度は、相互作用検討時における結合の特異性や キャパシティーに大きく影響しますので非常に重要な要因となります。90%以 上の精製度のリガンドを使用します。 リガンドの化学結合による固定化方法(CM5 を使用)には、以下のような方法があ ります。 アミンカップリング リガンドの表面に存在するアミノ基(N 末端アミノ基あるいはリジンの ε アミノ 基)を利用して固定化する方法。 チオールカップリング ①リガンドチオールカップリング リガンドの表面に存在する遊離型チオール基を用いて固定化する方法。 ②サーフェイスチオールカップリング センサーチップ表面にチオール基を導入し、リガンドのカルボキシル基を介し て固定化する方法。 アルデヒドカップリング 糖鎖の非還元末端をメタ過ヨウ素酸により解裂させアルデヒド基を作成し、ヒ ドラジンでアミノ基を導入したセンサーチップにシッフ塩基で固定化する方法。 大量の糖鎖を持つムチンタンパク質等の固定化に使用します。4.リガンドの固定化 15 この章では、アミンカップリングについて解説を行います。 アミンカップリングとは、センサーチップ表面のCM デキストラン中のカルボキ シル基をNHS/EDC 混合液を反応させ NHS 活性化し、アミノ基を持つリガンドと 結合させる方法です。リガンドとの結合後、残存活性NHS 基をエタノールアミ ンでブロッキングすることで固定化が完了します。 (例)IgG の場合 NHS 活性化 IgG のカップリング ブロッキング (アミンカップリングキットの調製) アミンカップリングキットには、以下の試薬が含まれています。 EDC(N-ethyl-N‘-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochroride)粉末 NHS(N-hydroxysuccinimide)粉末 1M Ethanolamine hydrochroride 溶液,pH8.5 EDC,NHS は、10 ml の超純水に溶解し、直ちに 200μl ずつ分注して、使用直前ま で遮光冷凍(-20℃以下)保存します。1M Ethanolamine hydrochroride は 4℃保存で す。 (リガンドの調製) ① タンパク質、ぺプチドリガンド 終濃度10～100 μg/ml になるよう 10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液に希釈します。 希釈する10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液の pH は、リガンドの等電点(pI)よりも 1 ～2 低く調製したものを使用します。リガンドの等電点が不明な場合には、10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液の至適 pH の選択を行います(4-1 参照)。 (注) 求核性物質(アジ化ナトリウム等)は、固定化を妨げます。この場合、十分に 希釈倍率を上げるか、もしくはあらかじめバッファー交換が必要になることが あります。 ② ぺプチド、低分子リガンド
終濃度100 μg/ml 以上になるよう Borate 8.5 (10 mM disodium tetraborate pH8.5, 1M NaCl)に希釈します。
16 4.リガンドの固定化 4-1. リガンド希釈用緩衝液の至適 pH の選択 プレコンセントレーションとは？ 固定化操作において、センサー表面のCM デキストランに存在するカルボキシル 基は非常に重要です。リガンドを正に荷電した状態で添加すると、負に荷電し ているCM デキストランとの間に静電気的な相互作用が生じ、リガンドをデキス トラン中に濃縮することができます。この方法を用いることで固定化効率を上 昇させることができます。したがって、リガンドは等電点よりも低いpH の緩衝 液に希釈し、リガンドを正に荷電させる必要があります。等電点が既知のサン プルの場合は、リガンドの等電点よりも0.5～2 低い pH 条件を使用すれば良い のですが、等電点が不明な場合には、「プレコンセントレーションの検討」を 行って、固定化に適するpH を調べることができます。この操作では、何も処理．．．． していないフローセル．．．．．．．．．．を使用し、各pH におけるセンサー表面へのリガンドの濃 縮程度を見るものです。 サンプル調製例 リガンドを最終濃度で10～100 μg/ml になるよう各緩衝液で希釈します。 ・10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5） 100 μl ・10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5） 100 μl ・10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.0） 100 μl この操作によりリガンドは固定化されることはありません．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。添加終了後、ラン ニング緩衝液に置換された後に、速やかに解離します。しかし、リガンドがデ キストランに非特異的吸着を起こすこともあるため、操作終了後、50 mM NaOH を30 秒間添加し、洗浄を行います。プレコンセントレーションに使用したセン サーチップは洗浄後固定化に利用することができます。
4.リガンドの固定化 17 サンプル調製例 マウスIgG を最終濃度で 20 μg/ml になるよう各緩衝液で希釈します。 ・10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6） 100 μl ・10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5） 100 μl ・10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4） 100 μl
アイコン（ ）あるいは Run → Run Sensorgram…をクリックします。
使用する流路を選択し、OK をクリックします。 ↓ 流速を5 μl/min に設定し、OK をクリックします。 ↓ センサーグラムがスタートします。 アイコン（ ）あるいはCommand → Inject…をクリックします。
18 4.リガンドの固定化
リガンド溶液ロード後、Start Injection をクリックします。
↓
引き続き、残りのサンプルも同様に添加します。
↓
アイコン（ ）もしくはRun → Stop Sensorgram をクリックし、測定を終了
します。 ↓ File → Save As をクリックします。 保存先を指定し、Save をクリックします。 (補足 5)プレコンセントレーションの評価 プレコンセントレーション効果は、希釈緩衝液のpH を下げれば増加します。しかし、 低いpH 環境下では、活性型 NHS 基とアミノ基とのカップリング効率は減少します。上 記のセンサーグラムの場合、pH4 の方が 5 比べ速い速度でプレコンセントレーションし ていますが、必ずしもpH4 の固定化量が多いとは限りません。また、タンパク質の安 定化のためにはできるだけ高めのpH を使用すべきです。したがって、濃縮効果のある、 一番高いpH 条件を使用します。上記の場合、pH5 で十分です。 p H 6 p H 5 p H 4
4.リガンドの固定化 19 4-2. マクロプログラムの実行 マクロプログラムは、センサーチップCM5 を使用してリガンドの固定化を行う 際に、固定化手順を誘導してくれるプログラムです。センサーチップCM5 を使 用する固定化法には、アミンカップリング、チオール(リガンドチオール,サーフ ェイスチオール)カップリング、アルデヒドカップリングがあります。
Tools → Surface Preparation Procedures…をクリックします。
目的にあった固定化方法を選択し、Start…をクリックします。ここでは Amine
20 4.リガンドの固定化
Amine Coupling を実行するにあたり、準備する試薬等を記載したダイアログボッ
クスが表示されます。確認後、Continue をクリックします。
4.リガンドの固定化 21
次に流速を指定します。固定化は、通常5-10 μl/min で操作します。ここでは流
速を5 μl/min に設定し、Continue をクリックします。
装置が動きはじめセンサーグラムがスタートします。続いてNHS 活性化のため
のボックスが開きます。SURFACE ACTIVATION(活性化)に使用する NHS と EDC を
添加直前に溶解し、1:1 に混合します。目的にあわせた添加容量を入力します。
ここでは、Volume に 35 μl(接触時間 7 分)を入力し NHS/EDC 混合液をロードし、
Continue をクリックします。(サンプルロードの方法については、補足 3 を参照
22 4.リガンドの固定化 NHS/EDC の混合液添加終了後、下記のボックスが表示されます。リガンドを 10 ～100 μg/ml となるよう 10 mM 酢酸ナトリウム緩衝液で希釈します(4-1 参照)。 目的にあわせたリガンドの添加容量を入力します。ここでは、Volume に 35 μl(接 触時間7 分)を入力し、調製したリガンドをロードし、Continue をクリックしま す。 リガンド添加終了後、下記のボックスが表示されます。目的にあわせたエタノ ールアミンの添加容量を入力します。ここでは、Volume に 35 μl(接触時間 7 分) を入力し、1 M Ethanolamine hydrochroride をロードし、Continue をクリックし ます。
4.リガンドの固定化 23
Amine Coupling 終了のダイアログボックスが表示されたら OK をクリックします。
4-3. センサーグラムの終了
もしくは Run → Stop Sensorgram をクリックします。
4-4. レポートポイントの設定
固定化実験の場合、通常NHS/EDC の添加前とエタノールアミン添加後でレポー
トポイントをとります。低分子リガンドの場合は、リガンド添加前後でレポー トポイントをとります。両ベースラインの差を、リガンドの固定化量とします。
もしくは View → Reference Line をクリックします。
NHS/EDC 添加 10 秒程度前に Reference Line を移動します。 もしくは Edit → Add Report Point をクリックします。
Add Report Point のダイアログボックスの Id に Baseline 等のレポートポイントの
24 4.リガンドの固定化
再びエタノールアミン添加後30～60 秒のところに Reference Line を移動後、
もしくは Edit → Add Report Point をクリックします。Add Report Point の
ダイアログボックスのId にサンプル名等のレポートポイントのコメントを入力
しOK をクリックします。
もしくは View → Reference Line をクリックします。
センサーグラムからReference Line を消去します。
1000 RU の変化量で約 1 ng/mm2の質量変化に相当します。上記の場合、固定化
操作前後のRU の変化は、882.8RU、したがってリガンドは 882.8 pg/mm2固定化
できたことになります。(なお、1 つのフローセルの面積は 1.2 mm2です。)
4.リガンドの固定化 25
4-5. データの保存
File → Save As をクリックします。
Save in:の▼を使用し、保存先である自分のフォルダー(C:/Bia Users/各自のフォ
ルダー等)を指定し、File name:にファイル名を入力した後、Save をクリックし ます。 4-6. データのクローズ File → Close をクリックします。 (補足 6)アミンカップリングの標準プロトコール マクロプログラムを使用せず、基本操作にしたがってって固定化することもで きます。アミンカップリングの標準固定化プロトコールでは、流速 5μl/min を 用い、以下の添加量が必要となります。 NHS/EDC による活性化 35 μl(7 min) リガンドのカップリング 35 μl(7 min) エタノールアミンによるブロッキング 35 μl(7 min) 各操作段階での接触時間は、7 分間です。
26 4.リガンドの固定化 (補足 7) 固定化全体における注意事項 実験の目的によって固定化量を調節する必要があります。特に、反応速度定数 (Kinetics parameter)の算出を目的に実験をする場合は、厳密に調整します。 ●特異的結合の確認実験 特異的な結合を確認する実験の場合には、アナライトのレスポンスが十分得ら れるような固定化量が必要となります。特に、アナライトが低分子物質の場合 は、リガンドの固定化量を高くしなければなりません。 リガンドの固定化量とアナライトの最大結合量の関係は、それぞれの分子量に よって決まり、リガンドの固定化量からアナライトの最大結合量(Rmax)を算出す ることができます。アナライトの最大結合量(RU)は、50 RU 以上を目安にしてく ださい。 リガンドの固定化量(RU) アナライトの最大結合量(Rmax) リガンドの分子量(Da) アナライトの分子量(Da) ●濃度測定の実験 濃度測定を行う場合には、固定化量はできるだけ多くします。リガンドの分子 量にもよりますが、タンパク質の場合はできるだけ10,000 RU 以上固定します。 ●反応速度定数(結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd))算出の実験 反応速度定数(Kinetics parameter)を算出する場合、固定化量はできるだけ抑える 必要があります。至適な固定化量は以下の式で得られる最小固定化量と最大固 定量の間の固定化量(RU)を目安にしてください。 最小固定化量 200 × 1/S × （リガンドの分子量／アナライトの分子量） 最大固定化量 1000 × 1/S × （リガンドの分子量／アナライトの分子量） S はリガンドの結合部位数 厳密に固定化量を調整したい場合、リガンドの添加時にマニュアルインジェク ションモードを使用します。マニュアルインジェクションにつては、補足8 を 参照ください。
4.リガンドの固定化 27 (補足 8) マニュアルインジェクションを用いた固定化量の調節 マニュアルインジェクションは、一度試料溶液をサンプルループに溜めてから 小刻みに試料溶液を添加する方法です。厳密に固定化量を調整したい時の有効 なツールです。マクロプログラム実行中は使用できません。通常リガンド添加 時のみに使用します。
アイコン（ ）あるいは Run → Run Sensorgram…をクリックします。
使用する流路を選択し、OK をクリックします。 ↓ 流速を5 μl/min に設定し、OK をクリックします。 ↓ センサーグラムがスタートします。 アイコン（ ）あるいはCommand → Inject…をクリックします。
Volume に添加量(35 μl)を入力し、NHS/EDC 混合液をロードし、Start Injection を
28 4.リガンドの固定化
↓
アイコン（ ） もしくは Command → Inject をクリックし、Type:Normal の
▼をクリックし、Manual Injection を選択します。 適当量(100μl 以下)の試料溶液をサンプルループにロードし、 をク リックします。 Manual を選択します。 10000 11000 12000 13000 14000 15000 16000 17000 18000 19000 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Tim e s R e sp o n se RU
4.リガンドの固定化 29
Start をクリックすると添加を開始し、Stop をクリックすると添加は止まります。
センサーグラムを見ながら、レスポンスが目的の結合量に到達するまで、Start、
Stop の操作を繰り返します。
(固定化量の確認)
もしくはView → Reference Line でリファレンスラインを画面に表示しなが
ら上記の操作をすると、その時の結合量を確認することができます。リファレ ンスラインをリガンド添加前に設定後、View → Baseline をクリックすると、 リガンド添加前のレスポンス(RU)が 0RU になります。 続いて、現在の位置にリファレンスラインを移動すると、Status window 中に結 合量が表示されます。 レスポンスが目的の結合量に達したら、Exit をクリックします。
30 4.リガンドの固定化
OK をクリックし、マニュアルインジェクションを終了します。
最後に、1M Ethanolamine の添加を NHS/EDC 混合液添加と同様に通常の Inject
コマンドで添加（添加量35 μl, 所要時間 7 分）すると、固定化は終了です。
Ti R
5. アナライトとの相互作用測定 31
5. アナライトとの相互作用測定
アナライトの調製 固定化されたリガンドに対し相互作用の測定を行う分子をアナライトと呼びま す。アナライトは、必ずしも精製されている必要はありません。血清や培養上 清等のクルードなサンプルも使用することができます(不溶性の粒子は、遠心等 で取り除いておく必要があります)。正確な反応速度定数を算出する場合には、 精製されたアナライトを用いることをおすすめします。 アナライトの調製には、ランニング緩衝液を用います。必要がある場合には、 アナライトをランニング緩衝液に緩衝液交換するか、ランニング緩衝液をアナ ライト溶解液にあわせます。ランニング緩衝液とアナライト溶液が著しく異な る条件では、センサーグラム上に溶液効果(Bulk Effect)が現れます。また、反応速 度定数の算出を目的とする実験は結合領域と解離領域で緩衝液組成が異なりま すので、おすすめできません。 アナライトの濃度は、アナライトの分子量やアフィニティーの強さに依存しま すが、通常10-100 μg/ml 程度に希釈します。あらかじめリガンドとアナライト の解離定数(KD)が予測できる場合は、解離定数(KD)前後の濃度に調製します。反 応速度定数等の算出を行う場合、アナライトの濃度は 5 段階以上調製し、測定 を行います。32 5.アナライトとの相互作用測定 再生条件の検討 結合したアナライトを強制的に解離させる操作を再生(Regeneration)操作といい ます。再生操作は、再生溶液を30 秒～1 分間添加することで行います。十分再 生されない場合は、この短時間の添加を繰り返し行います。 一般的に再生溶液として、次のページのようなものがあります。結合したアナ ライトが完全に再生され、かつ固定化したリガンドの活性が保持される条件を 選ぶ必要があります。再生溶液の検討時は、マイルドな溶液から試していきま す。 再生溶液の例 試薬 濃度あるいはpH (塩) NaCl ＜3M MgCl2 ＜4M (酸) 10 mM Glycine-HCl ＞pH 1.5 HCl ＜100 mM Formic acid ＜20% (アルカリ) 10 mM Glycine-NaOH ＜pH 12 NaOH ＜100 mM (キレート剤) EDTA ＜0.35M EGTA ＜0.35M (界面活性剤) Surfactant P-20(Tween 20) ＜5% Triton X-100 ＜5% SDS ＜0.5% Octylglucoside ＜40 mM (有機溶媒) Acetonitrile ＜20% DMSO ＜8% Ethyleneglycol in HBS buffer ＜50% Ethanol ＜20% Formamide ＜40% (変性剤) Guanidine-HCl ＜5M Urea ＜8M
5. アナライトとの相互作用測定 33
5-1. センサーグラムの開始
もしくは Run → Run Sensorgram をクリックします。
Detection Mode、Flow Path、コントロールとなる Reference Cell を選択して OK
をクリックします。 相互作用測定時はFc1-2 を選択します。リファレンス(コントロール)となるフロ ーセルをReference Cell に指定をしておくと、リガンドを固定化したセルのレス ポンスからリファレンス(コントロール)セルのレスポンスを自動的に引き算した センサーグラムを表示させることができます。 例えば、フローセル2 にリガンドを固定化し、1 をリファレンス(コントロール)
とする場合、Detection Mode で Multichannel を、Flow Path で Fc1-2 を選択しま
す。さらに、Reference Cell:の▼を使用し、Fc1 を指定して OK をクリックします。
34 5.アナライトとの相互作用測定 反応速度定数算出を実験目的とする場合は、以下の標準的流速を使用します。 相互作用検討の場合 20-50 μl/min 装置が動き出し、センサーグラムが表示され始めます。 (補足 9) センサーグラムの表示 Fc1-2 を使用し、Reference Cell の設定をしている場合には、はじめに自動的にリ ファレンス(コントロール)を差し引きしているデータ(黒色)が表示されます。 得られるデータは各フローセルのオリジナルカラーで表示されます。 Fc1：赤色 Fc2：緑色 Fc1-2：黒色 ①Fc1(赤色)や Fc2(緑色)等の別のセンサーグラムを見たい場合
Tool bar 右端の Curve リスト の▼で変
5. アナライトとの相互作用測定 35
②各センサーグラムを重ね書きしたい場合は
View → Overlay をクリックします。
5-2. アナライトの添加
もしくは Command → Inject をクリックします。
添加容量を入力します。Wash after injection ボックスの Delayed をクリックし、
解離時間を入力します。通常、添加終了後、流路の洗浄操作が自動的に入り、 一時的にセンサーグラムが乱れます。Delayed:に数値を入力することにより、入 力した時間だけ洗浄操作を遅らせることができます。特に、解離状態をモニタ リングする場合は、この設定を行います。 アナライトロード後、Start Injection をクリックします。アナライトを回収する 場合は、補足4 を参照ください。
36 5.アナライトとの相互作用測定
5-3. 再生溶液の添加
もしくは Command → Inject
添加Volume を入力します。この際、Wash after injection ボックスの選択は、
Normal にします。
再生溶液ロード後、Start Injection をクリックします。再生溶液に含まれるリガ
5. アナライトとの相互作用測定 37
5-4. レポートポイントの記録
相互作用測定の場合、通常アナライト添加前後と再生操作終了後でレポートポ イントをとります。解離速度が非常に速く、箱型のセンサーグラムになる場合、 アナライト添加終了前でレポートポイントをとる場合もあります。
もしくはView → Reference Line をクリックします。
アナライト添加10 秒程度前に Reference Line を移動します。
もしくは Edit → Add Report Point をクリックします。
Add Report Point のダイアログボックスの Id に Baseline 等のレポートポイントの
コメントを入力し、□Baseline をチェックして、OK をクリックします。
再び、Reference Line をアナライト添加後 10～20 秒程度のところに移動後、 もしくはEdit → Add Report Point をクリックします。Add Report Point のダ
イアログボックスのId にサンプル名,濃度等のレポートポイントのコメントを入
力しOK をクリックします。
再び、Reference Line を再生溶液添加後 10～20 秒程度のところに移動後、
もしくはEdit → Add Report Point をクリックします。Add Report Point のダ
イアログボックスのId に再生溶液名等のレポートポイントのコメントを入力し
OK をクリックします。
もしくは View → Reference Line をクリックします。センサーグラムから
38 5.アナライトとの相互作用測定
5-5. 新規サイクルへの変更
Run → Start New Cycle をクリックします。
新しく行う実験を同一ファイル中に保存する場合に行います。
Yes をクリックし、新しいサイクル(センサーグラム window)がスタートしたら、
次のアナライトに対する測定を開始することができます。5-2、5-3、5-4 を参考
5. アナライトとの相互作用測定 39 (補足 10) 同一ファイル内への保存 センサーグラム終了後、改めてセンサーグラムを開始する際に、前に得られた センサーグラムが画面上に残っている場合(センサーグラムを Close していない 場合)、以下のダイアログボックスが表示されます。もし、これから測定しよう とするセンサーグラムを画面上に残っているセンサーグラムと同一 File に別サ イクルとして保存したい場合はYes、別の File として保存したい場合は No を選 択します。 5-6. センサーグラムの終了
もしくはRun → Stop Sensorgram をクリックします。 5-7. データの保存
File → Save As をクリックします。
保存先である各自のフォルダーを選択し、File name にファイル名を入力した後、
40 5.アナライトとの相互作用測定
(補足 11) 複数のサイクルを持ったファイルの保存様式
もしくはFile → Open
目的のファイル(複数のサイクルを持ったファイル)を選択し、Open をクリックし
ます。
Tool bar 中の Cycle:▼で Cycle 番号を変更すると、別サイクルのセンサーグラム に切り替えることができます。
6.システムの終了 41
6. システムの終了
6-1-1. 2～3 日以内で継続して使用する場合
Tools → Working Tools → Continue をクリックします。
Continue は、センサーチップに 5 μl/min の流速で、ランニング緩衝液を最大 72
時間供給し続ける操作です。72 時間の Continue で使用するランニング緩衝液は、
約30 ml です。(Continue を終了する場合は、Continue のダイアログボックスの Stop をクリックし、Continue 操作を停止します。)
6-1-2. 電源を落として終了する場合
①Tools → Working Tools → Prime をクリックします。
ポンプやマイクロ流路系内を超純水で置換します。ランニング緩衝液ボトルを
超純水ボトルに置きかえ、実行します。所要時間は約3 分です。
②Tools → Working Tools → Close をクリックします。
Close は、サンプルループを水で洗浄後、マイクロ流路系内を air で置きかえる 操作です。①の操作終了後、画面の指示にしたがってい、超純水200 μl を 2 回 添加します。所要時間は約2 分です。 6-2. センサーチップの取り出し Command → Undock をクリックします。 インジケータのSensor chip の緑ライトが点灯から点滅に変わったら、センサー チップを抜き取ります。Undock 操作を行うと自動的に Dock ボックスが開きま す。Cancel をクリックします。
42 6.システムの終了
6-3. システムの終了
開いているファイルはすべてFile → Close し、立ち上がっているソフトウェア
はFile → Exit で閉じます。BIACORE システム、コンピュータ、モニター、プリ
ンター等の電源を落とします。ランニング緩衝液ボトルや廃液入れを片付け終 了します。 6-4. センサーチップの保存 ●乾燥法 A. センサーチップ全体をパラフィル ムで密閉し、4℃保存。 再使用の際は、室温に戻してから パラフィルムを外し装置に挿入し ます。 B. センサーチップ全体を 50 ml ふた つけプラスチックチューブに入れ、 4℃保存。 再使用の際は、室温に戻してチュ ーブから取り出し装置に挿入しま す。 ●緩衝液浸透法 センサーチップのカバーを外したシー トだけを、緩衝液を入れた50 ml ふたつ けプラスチックチューブに入れ、4℃保 存。再使用の際は、脱イオン水を湿らせ たキムワイプ等でリガンド固定化セン サー部分を除いたすべての部分の緩衝 液をよくふき取ります。リガンド固定化 部分は、細くとがらせたキムワイプ等を 四角の隅にあて、余分な緩衝液を吸い取 ります。シートをカバーに戻し装置に挿 入します。
7.メンテナンス 43
7. メンテナンス
システムのメンテナンスは、Tools:＼Working Tools 中のコマンドを用いて行いま
す。使用する試薬はすべてBIAmaintenance Kit に含まれます。
Tools → Working Tools → 各メンテナンスコマンド
各メンテナンスコマンドを選択後、Start…をクリックすると、操作内容が表示さ れます。その指示にしたがってってメンテナンスを行ってください。 Desorb、Sanitize は、必ず洗浄用センサーチップを使用してください。 ●日常のメンテナンス Flush マイクロ流路系をランニング緩衝液で簡単に洗浄します(所要時間 1 分間)。 Rinse マイクロ流路系をランニング緩衝液で洗浄します(所要時間 2.5 分間)。 Prime ポンプとマイクロ流路系をランニング緩衝液で洗浄します(所要時間 3 分間)。
44 7.メンテナンス
●毎週のメンテナンス
Desorb
サンプルループやマイクロ流路系等に付着したタンパク質等をBIAdesorb
solution1(0.5 % SDS)と BIAdesorb solution2(50 mM Glycine-NaOH)で洗浄
します(所要時間 21 分間)。実行後、超純水で Prime を数回行ってください。週に 1 度は行ってください。 (注意事項) ・ボトルベースは超純水をセットしてください。 ・BIAdesorb solution 1 は、室温で保存してください。 ・洗浄は、設定温度を20℃以下で行わないでください。 ●毎月のメンテナンス Sanitize 微生物や病原性のあるサンプルを使用した時の殺菌操作です。接液部分を BIAdisinfectant solution(殺菌剤)で殺菌します (所要時間 35 分間)。BIAdisinfectant solution は、1.5 ml を水 20 ml で希釈し使用します。実行後、超純水で Prime を
数回行ってください。月に1 度は行ってください。
●流路が詰まった場合のメンテナンス
Tools → Service Tools → Unclogging
この操作は、高流速で流路系内を洗浄する操作です。 流路が詰まった場合、添加した試料溶液が添加開始時間より遅れてセンサーチ ップ表面に流れこんだり、センサーグラムが不自然なカーブを描いたりします。 (例) (補足 12) コネクターブロックのメンテナンス 毎日の実験終了後、脱イオン水を入れた洗浄ビンで、コネクターブロックを洗 浄します。インジェクションポートやリカバリーポート等に、塩が析出すると 詰まる原因にもなります。特に、電源を落として終了させる場合は、しっかり 脱イオン水で洗浄してください。
8.システムチェック 45
8. システムチェック
ベースラインのドリフトなどシステムの調子が思わしくない場合、以下の方法 でシステムチェックを行います。また、長期間システムを使用しなかった場合
も、実験を開始する前に1 度実行することをおすすめします。
新しいCM5 センサーチップと HBS-EP buffer および BIAmaintenance Kit 中の BIAtest solution を準備します。
Tools → Test Tools
46 8.システムチェック
Continue をクリックします。
チェックをしたい項目(A,B,C)を選択します。
通常はC を選択後、指示にしたがってって 120 μl の BIAtest solution をロード後、 Start をクリックします。
8.システムチェック 47
System check 終了後、得られたセンサーグラムを保存します。
Tools → Test Tools → System check evaluation
Start…をクリックし、保存した System check センサーグラムを指定し、解析に
持ちこみます。
48 9.警告ボックス
9. 警告ボックス
9-1. コンプレッサーからのプレッシャーが足りない時 上記のような警告ボックスが現れた場合、一時的にIgnore で回避してください。 測定中、頻繁に上記の警告ボックスが現れるようでしたら、弊社技術サービス 部にご相談ください。 9-2. 定期的にメンテナンス(Desorb)が行われていない時 システムのメンテナンスコマンドの中でも、Desorb は良いデータを取るために 欠かせないメンテナンスです。定期的にDesorb が行われていない場合、上記の ような警告ボックスが、システムのスタートアップ時に現れます。適時、メンテナンスの必要があればWorking Tools を、必要がなければ Ignore を選択しま
10.データ管理 49
10. データ管理
個人のデータは、C:/BIA Users:/個人のフォルダー中に保存します。BIA Users 以外
に保存した場合、ソフトウェアの再インストール時に、消去される可能性があ ります。以下の手順にしたがってい、個人フォルダーを作成後、実験を開始し ます。 10-1.フォルダーの作成 ① Windows Explorer から行う場合 初期画面において
Start → Programs → Windows Explorer Bia［C:］中の Bia Users をクリックします。
File → New → Folder
右側のWindow に新しいフォルダーが作成されます。フォルダー名(名前等)を入
50 10.データ管理
② My Computer から行う場合
初期画面において、My Computer をダブルクリックします。
Bia(C)：をクリックし、BIA Users のフォルダーをダブルクリックして開きます。 File → New → Folder
Window 中に新しいフォルダーが作成されます。フォルダー名(名前等)を入力し
Enter キーを押すと完了です。
10-2. フロッピーディスク(2HD)への保存
フロッピーディスク(2HD)への保存には、Windows Explorer を使用します。 Windows Explorer 中でコピーしたいファイルをドラッグして 3 1/2 Floppy［A:］ に持っていくと、ドラッグしたファイルがフロッピーディスク(2HD)にコピーさ れます。
基本的な実験でのファイルの容量は、おおよそ以下のようになります。
固定化ファイル(アミンカップリング) 約20 kb
10.データ管理 51
11. 索引
［ア］ アジ化ナトリウム 15 アナライト 31 アナライトの調製 31 アミンカップリング法 14,15 アミンカップリング試薬 15 アルデヒドカップリング 14 インジェクトコマンド 8 インジケータ 1,3,41 ウィンドウ画面 2 温度設定 6 ［カ］ 回収 10 カイネティクスパラメーターの算出 26,34 解離速度定数 26 解離定数 31 重ね書き 35 緩衝液 1 緩衝液浸透法 42 乾燥法 42 クルード 31 結合速度定数 26 結合部位数 26 警告ボックス(→Warning message) 48 血清 31 検出モード（→Multichannel, Single） 7 固定化方法 14 固定化量 26 固定化量の調節 27 コネクターブロック 44 コンプレッサー 1,48 ［サ］ サイクル 39,40 再生操作 31,36 再生溶液 31,36 最大結合量（→Rmax） 26 最小固定化量 26 最大固定化量 26 サーフェイスチオールカップリング 14 サンプル回収 10 サンプルの添加法 8 サンプルロード 9 システムチェック 45 システムの初期化 3 システムの終了 41 システムの置換（→Prime） 4,41 システムのメンテナンス 43 シャットダウン 42 新規サイクルへの変更 38 センサーチップシート 42 センサーチップの種類 4 センサーチップの保存法 42 センサーグラム 7 ソフトウェアの起動 1 ［タ］ 低分子リガンドの固定化 15 チオールカップリング 14 データの保存 13,49 データのクローズ 13 電源 1 特異的結合 26 ［ナ］ 濃度測定 26 ［ハ］ 廃液ビーカー 1,42 培養上清 31 反応速度定数 26 プレコンセントレーション 16 フローパス（→Flow path） 7 フローセル 7 不溶性 31 分子量 26 ベースライン 11 ペプチドの固定化 15 ［マ］ マクロプログラム 19 マニュアルインジェクション 27 メンテナンス 43 ［ヤ］ 溶液効果 31 ［ラ］ ランニング緩衝液 1 リガンド 14 リガンドチオールカップリング 14 リガンドの希釈液 15 リガンドの調製法 15 リガンド希釈用緩衝液の至適pH 16 リファレンスセル（→Reference cell） 33 リファレンスライン 11 流速 7,21,34 レスポンス（RU） 23 レポートポイント 11 レポートポイントテーブル 11,1252 11.索引
［A］
Add report point 12
Amine Coupling 12 Aldehyde Coupling 14,15 ［B］ Baseline 11 BIAdesorb solution 44 BIAdisinfectant solution 44 BIAmaintainance Kit 43,45 BIAnormalize solution 6 BIAtest solution 45,46 Bia User Folder 49
Bulk Effect 31 ［C］ Close 13,41 CM5 4,14 Coupling scheme 14 Continue 41 Cycle 40 ［D］ Deactivation 22 Delayed(in inject command) 35
Desorb 44 Detection Mode 7 Dock 3 ［E］ EDC 15, Ethanolamine hydorochroride 15, Event log window 2
Exit 5,42 ［F］ File 13,49 Flow 7 Flow cell 7 Flow path 7 Flush 43 ［H］ HBS-EP 1 HBS-P 1 HBS-N 1 HPA 4 ［I］ Id 12 Inject(Delayed) 35 Inject 8,9 ［K］ ka 26 kd 26 Kinetics parameter 26 ［L］
Ligand Thiol Coupling 14 ［M］ Manual injection 27 Menu bar 2 Multichannel 7 My Computer 50 ［N］ Negative charge 15 NHS 15, Normalize 6 NTA 4 ［O］ Overlay 35 ［P］ Preconcentration 16 Prime 4,41 ［R］ Regeneration 31,36 Report point 11 Report point table 2,12
Reference Line 11,12 Reference cell 33 Rinse 43 Rmax 26 RU 24 Run（Run Sensorgram） 7 ［S］ SA 4 Sanitize 44 Save data 13 Sensorgram 7 Sensorgram window 2 Set Temperature 6 Shut down 42 Single 7
Start New Cycle 38
Status window 2,29 Stop（Stop Sensorgram） 11
Surface activation 21 Surfase Thiol Coupling 14
11.索引 53
Surface Preparation Procedures 19
System check 45 System check evaluation 46
［T］ Test Tools 45 Tool bar 2 ［U］ Unclogging 44 Undock 41 ［W］ Warning message 48 Wash after injection 35
Window 2
Windows explorer 49 Working Tools 4,6,41,43
Biacore X アイコン クイック ガイド
アイコン 操作内容 コメント
Run Sensorgram 測定の開始 Detection Mode,
FLOWPATH, FLOW の設定後測定開始 Stop Sensorgram 測定の終了 測定開始後使用可能 Start Injection 試料溶液の添加 インジェクションモー ドの選択可能 Stop Injection 試料溶液の添加終了 試料溶液の添加時のみ 使用可能 Flow 流速の設定 1～100 μl/min の設定が 可能 Stop Flow 送液の停止 Reference Line リファレンスライン
Add Report Point レポートポイント リファレンスラインの
の設定 設定後使用可能 (File) Open ファイルを開く Save データの保存 Notebook メモ用紙 Evaluation BIAevaluation 測定をしながら解析可 ソフトウェアを開く 能
