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生体ナノテク第4回_穴なし

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Academic year: 2021

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(1)

金曜1限

生体ナノテクノロジー特論

(高分子合成論)

2014年10月31日

第4回:ナノスケールを観る手法(続)

ナノスケールにアプローチする材料

次週、11月7日は休講です。

(2)

これまでのまとめ

· 光学顕微鏡の歴史!

· 各種観察法の特徴:暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察、蛍光観察!

· レーザーの導入と発展:共焦点レーザー顕微鏡、単分子イメージング、


!!

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 超解像顕微鏡

→3次元像取得、高速スキャン、高分解能が可能になってきた。  →・レーザーを使う場合について、褪色の問題。!   ・超解像の場合には試料の動きの問題(撮像時間とのかねあい)。!    (ブラウン運動。動物などではそもそも呼吸や拍動などの影響が出る。)!   ・生体の表面から深い部分は見られない。   →細胞など基板にはりついたサンプルが有利。

固定化した試料が相手であれば、電子顕微鏡も捨てたものではない。

· TEMによる構造観察(切片、凍結)、3次元構造解析(トモグラフィ)、 生きたままの観察! · SEM, AFMを用いた生物試料の観察! · 蛍光観察との組み合わせ

(3)

参考文献

最先端材料システム One Point! 『イメージング』 (共立出版) 『非侵襲・可視化 技術ハンドブック』 (NTS) 『実験がうまくいく  蛍光・発光試薬の
 選び方と使い方』! (羊土社) 『講義と実習 生細胞蛍光
 イメージング』 (共立出版) 『よくわかる生物電子 顕微鏡技術』(共立出版)

(4)

-

光イメージング(蛍光/生物発光など)!

-

MRI(磁気共鳴イメージング)!

-

X線!

-

核医学(放射線)イメージング(PET/SPECT)!

-

超音波

生体(in vivo)イメージング

in vivo: 生体(内)の

in vitro: 試験管内の

ex vivo: 生体外での

→生体内を”生のまま”イメージングしたい。

種々のモダリティ(撮像手段)

(5)

(原理/非侵襲性) (プローブ/造影剤の必要性) (空間分解能/深さ/3次元画像) (感度・時間分解能) (情報の多重性・定量性) ! (現状での臨床応用)

光イメージング

主として蛍光・発光のシグナルを用いて情報を取得。非侵襲。 蛍光の場合は色素と励起光、発光の場合は基質が必要。 標本表面の分解能は高い。深部に弱い。3次元は未熟。 概ね高いが色素に依存。 種々の色素が選べるが、生体では長波長のものが有利。 定量可能。 基本的に小動物などに限定的。

例) Maestro

TM 前臨床用 (小動物用)

(6)

光の生体組織透過性

主に、水と血液(ヘモグロビン)が問題。  

600  nm後半∼900  nm程度までが透過性の高い光と言える。  

optical  window;  生体の窓、などと言われる。)

(7)

生体内を直接観る:内視鏡の活用

→内視鏡に共焦点方式を組み込むことで、高解像度(0.5–5  µm)で、ある程度の 高速スキャン(2  fps以上)での蛍光画像取得が可能。 『共焦点内視鏡』   (丹羽、後藤、日本レーザー医学誌、2009、46-­‐53) 光ファ イバー

W.  Piyawattanametha,  et  al.,  Adv.  Drug  Deliv.  Rev.   74,  53-­‐74  (2014) 自家蛍光による結腸直腸がんのイメージング

正常組織

がん組織

スコープ部 スコープ先端

(8)

自家蛍光の源泉の一つ:ミトコンドリア

マトリックス クリステ 膜間部 外膜 内膜 実際は豆粒状の形態だけでなく、多様性に富む 好気的代謝の舞台:内膜、及び内膜で囲まれた空間(マトリックス)で行う。
 好気代謝以外の役割:アミノ酸・鉄・脂質の代謝、カルシウム濃度の維持、アポトーシス 誘導(シトクロムc放出による誘導)などの役割も持つ。 外膜:ポリンという膜タンパクを介して分子量10,000以下程度の物質を透過できる。! 膜間部:サイトソルの物質がここまで浸透して来られる。! 内膜:膜タンパク質を多量に含む物質透過性の低い膜 (O2やCO2は透過)。好気的代謝に必 要なタンパク質複合体や、物質輸送用タンパク質が埋まっている。! マトリックス:水分量が50%以下のゲル状空間。溶存酵素多数。ミトコンドリア固有の 環状DNAも存在(ただし、ミトコンドリアタンパクの95%は核の染色体に存在。) 透過電顕像

ミトコンドリア模式図

(9)

呼吸の経路に関わるフラビンが原因物質の一つ

マトリックス 内膜 外膜 サイトソル

主にここにいる!

(フラビンタン

パク質など)

✦還元通貨から取り出した電子を4つのタン パク質複合体が主として伝達。! ✦I→III→IV、あるいは、II→III→IVの経路で 伝達。! ✦正味では、NADHなどをO2で酸化している ことに相当。(以前のQuiz参照) I II III IV H+ Cyt c NADH + NAD+ FADH2 FAD O2 Q マトリックス NADH 複合体I O2 + 2H+ H+ 4 4 H+ H+ 複合体III 複合体IV H2O 1 2 ミトコンドリア 内膜 膜間部 I→III→IV 2 2e– 2e FMN FeS Q FeS e– e– e e– NAD+ + H+ + 2e– → NADH! O2 + 2H+ + 2e– → H2O! ! 半反応式を2つ合わせて、! ΔE = (0.815) – (–0.315) = +1.13 (V)! ΔG = –2·96485·1.13 = –218 kJ/mol 1 2

(10)

フラビンなどが自家蛍光を出す

FMN

(フラビンモノヌ クレオチド) FMN (酸化型) FMNH2 (還元型) FMNH· (ラジカル型) [H·] [H·]

ミトコンドリアに多い。!

特に、酸化型フラビンが緑の蛍光を

示すそうです。

FAD

(11)

超偏極

MRI

(原理/非侵襲性) (プローブ/造影剤の必要性) (空間分解能/深さ/3次元画像) (感度・時間分解能) ! (情報の多重性・定量性) (現状での臨床応用) ラジオ波を用いた1H  NMRに基づくため非侵襲。緩和時間を計測。 造影剤を使うことでイメージングの効果が高まる。 高い(25-­‐300  µm)。断層画像の取得に強い。 感度に難あり(高濃度の造影剤必要)。高速化は発展中。   血流などの流れを定量・可視化できる。 基本は単色だが、ケミカルシフトの活用が発展中。 普及している。 臨床用MRI! (1-3 T) 前臨床用MRI! (高磁場7T MRI)! 空間分解能が高い 画像提供:! 放射線医学総合研究所! 青木 伊知男 博士 ヒト頭部
 冠状断像 ラット頭部
 冠状断像 T2 T2 T1

(12)

ラジオ波で励起して


プロトンの磁化ベクトルを倒す。

(13)

『非侵襲・可視化技術ハンドブック』p. 28

含水量、脂肪量に対応

(14)

MRI撮像原理

(縦緩和時間T1)励起で得たエネルギーが、熱の形で周りに散逸(スピン-格子緩和) (横緩和時間T2)スピン-スピン緩和。 っていた位相が乱れたり、励起準位間のエネ ルギー移動などによりエネルギーが失われてシグナルが消失。

http://www.mb.ccnw.ne.jp/sfujii/satuei/satuei.html

(電脳入門書 画像工学・X線撮影技術学 より) - 水の場合、自由な環境にいる ほど緩和時間が長い。 純水で長く、ゲルや固体で短い。 - 脂肪(炭化水素)に含まれる プロトンは、緩和時間が水より 短い。

(15)

タイトルテキスト

本文レベル1! 本文レベル2!

超高磁場16.4-T MRI + 冷却コイル   マウス脳

画像提供: Bruker Biospin

20 µm空間分解能のマイクロイメージング (T1強調)

資料協力:放射線医学総合研究所 青木 伊知男 博士 注)高磁場のためにT2*短縮の影響、すなわち磁化率による黒の影響が強くなっている。

(16)

Colon-26

(2.5 × 10

5

cells/100 μl)

Balb-c nude

Subcutaneous transplantation

5 mm

5 mm

Method

画像提供:! 放射線医学総合研究所! 青木 伊知男 博士

(17)

Colon-26

50 µm,

3D MRアンギオグラフィー(血管造影)

Results 画像提供:! 放射線医学総合研究所! 青木 伊知男 博士 - 水の信号を白く残す撮像法! - 動脈瘤や血管閉塞の診断に活用可能! - 造影剤の利用で毛細血管も見えた!

(18)

perfusion(灌流) MRI

→MRIを用いて、血流の評価が可能。主に、脳で発展。

DSC (dynamic susceptibility contrast):造影剤の急速投与後、連続撮像。!

S/Nが高く、素早い撮像が可能。脳のほか、腫瘍、腎臓の機能評価に使われる。!

ASL (Arterial spin labeling):動脈血をスピン反転してラベル化し(黒くなる)、信号

の低下を観測。スピンラベルしない時との差から流量を求める。造影剤不要で非侵襲 だが、感度が悪く、撮像時間がかかる。3T以上必要。脳 塞、腫瘍などで有用。! ASL概念図 脳卒中, 32, 676 (2010). Innervision, 27, 46 (2012). 多系統萎縮患者での流量の可視化! (前頭側頭葉に比べて小脳の血流 が低下。) 小脳 前頭側頭葉

(19)

CEST (Chemical exchange saturation transfer)

→標的化合物中の交換可能なプロトンを選択的に飽和させ、プロトン交換を 通じて周囲の水のシグナルの低下を検出してイメージング。! →MRIで直接観察出来ない低濃度物質でも、バルク水の信号変化を通じて検 出が可能となる。 NMRスペクトル CESTスペクトル (z-スペクトル) バルクの水の測定である。 (九大院医)栂尾ら、Innervision, 27, 29-32 (2012).

(20)

Annu Rev Biomed Eng. 2008 ; 10: 391–411. A schematic representation of a gene therapy bundle of nucleic acids and cationic polymers. The RNA strand poly(rU) (left) has two sites that give rise to CEST. The amide

protons in cationic polymers, such as PLL (right), can also give rise to a CEST effect.

RNA(ポリウラシル) PLL(ポリ-L-リシン)

遺伝子送達用複合体 モデル

(21)

APT(Amide proton transfer)イメージング 生体内のタンパク:固体様の性質を持つ結合性タンパク質/ペプチド(T2が短い)と,
 自由度の高い可動性タンパク質/ペプチド(T2が長い;主に細胞質)の大きく分けて2つ。! APTイメージングでは、可動性タンパク質/ペプチド内に含まれるアミドの濃度,あるいは 交換速度に基づくコントラストを得ることができる。

CESTの応用例

腫瘍再発:APT画像で高シグナル! →可動性ペプチド/タンパクが増加 放射線壊死:放射線治療後数か月以降に生じる遅発性脳壊死であり,!  通常の画像的手法では再発との区別が困難。 放射線壊死:APT画像でシグナル増強なし。! →壊死を示唆。 T1 T1 膠芽腫の放射線化学療法後 脳腫瘍の放射線治療後 この他、がんの悪性度の判定にも応用可能との説あり。 (九大院医)栂尾ら、Innervision, 27, 29-32 (2012).

(22)

X線CT (Computed Tomography)

(原理/非侵襲性) (プローブ/造影剤の必要性) (空間分解能/深さ/3次元画像) (感度・時間分解能) ! (情報の多重性・定量性) (現状での臨床応用) X線の散乱・吸収に基づくコントラスト差。X線の被曝が問題。 軟部組織には造影剤を使う必要あり。 高い(50-­‐200  µm)。断層画像の取得に強い。 造影剤利用の場合、大量の投与が必要。血流などの流れを定量・ 可視化できる。 情報は単調。定量への利用は不詳。 広く普及している。 前臨床用X線CT(リガク)
 R_mCT2 臨床用X線CT(Siemens)! SOMATOM Definition Edge

最高300  µmの空間分解能

最高10  µmの空間分解能

皮下
 腫瘍

(23)

X線CT (Computed Tomography)

島津HPより →試料/検体を回転させる、あるいは、X線源と検出器を回転させて撮像。   →その後、画像を3次元再構築。  

X線顕微鏡

小さな試料のX線CTで、構造解析が可能。!< 1 µmの空間分解能。(リガクnano3DX) (おまけ)

(24)

『電子顕微鏡で読み解く 生命のなぞ』(p.91)

(25)

PET/SPECT (核医学イメージング)

(原理/非侵襲性) ! ! (プローブ/  造影剤の必要性) ! ! (空間分解能/深さ/3次元画像) (感度・時間分解能) ! (情報の多重性・定量性) ! (現状での臨床応用) PET:  放出された陽電子が電子と対消滅して発生する、2つのγ線 (180°方向)を検出。SPECT:  放射性同位体の出すγ線のシグナルを画像 化。プローブ(トレーサー)による被曝が問題。 PET:  ポジトロン核種  (11C,  13N,  15O,  18F;  極めて短寿命/半減期  2∼110  分)   SPECT:一般の放射性核種で標識された化合物が必要。
 核種の寿命が長い(6時間∼5日)。123I,  99mTc,  111Inなど。 あまり高くない(数  mm)。断層画像の取得可。 感度は極めて高い。血流などの流れを定量・可視化できる。   時間分解能はそこそこ。 PET:  基本は単色。定量性高い。SPECT:  複数核種の同時 使用可能。いずれも代謝の追跡に使われる。 SPECTはかなり普及している(日本で1700台以上)。PETはサイク ロトロンが必要で核種の寿命も短いので特殊といえる(国内台 数500台以下)。

PET: Positron Emission Tomography(陽電子放出断層撮影)!

SPECT: Single Photon Emission Computed Tomography (単一

(26)

PET/SPECT の例

18F-FDGを用いたPETがん診断

悪性腫瘍(がん):増殖が盛んに行われるために正常細胞よりも3∼8倍

のグルコースを取り込む。また、解糖系が活性化されている。

グルコース類縁体であるFDGがよく取り込まれる。

直腸がん診断画像の例 局所 転移 肝転移 肝転移 肝転移 肝転移 局所再発 日本メジフィジックス! FDGスキャン 紹介サイトより

(27)

超音波

(原理/非侵襲性) (プローブ/造影剤の必要性) (空間分解能/深さ/3次元画像) (感度・時間分解能) ! (情報の多重性・定量性) (現状での臨床応用) 超音波の反射を利用。極めて低侵襲。小型で低コストも魅力。 血流の可視化にマイクロバブルが使われている。 それなりの分解能と測定深さ。断層画像も得られる。 造影剤なしでも血流分布を実時間で可視化できる。   組織ごとの特性、微細構造変化を検出できる。 定量性低い。軟組織で強い吸収(深いと顕著になる)が影響。 広く普及している。日本発の技術が多い。 meddic.jpより Bモード法:超音波の照射・受信の位置をずら しながら、エコーの強さを輝度としてマッピン グする。 ドプラ法:動きのある反射物体(赤血球など) のドップラー効果を利用して、血流情報を得る。 パルスエコー法が利用される。 『非侵襲・可視化技術ハンドブック』(p.154)

(28)

生体組織の音響特性 生体組織内の音波の伝播速度 千原國宏『超音波』(コロナ社・p.27) 超音波診断で得られる情報 生体組織内の音波の伝播速度 超音波の反射係数は音響インピーダンスzの差で決まる。 組織性状診断の概念 触診の代わりに! K: 組織の弾性

z  =  c·∙ρ

音速

(29)

超音波画像の例

(千葉大) 山口 匡、Innervision, 26, 10 (2011). よく反射する(黒)、反射しない(白:液体など) 妊娠6ヶ月の胎児2D/3D! (岸村綾乃氏提供)

超音波顕微鏡

仁田、西條、医学のあゆみ, 186, 353 (1998). 組織の弾性/硬さなども測定可能。! 分解能は周波数に依存。 光学顕微鏡 超音波顕微鏡 減衰像 音速像

(30)

近赤外光の反射波をエコーのように利用。直接波と干渉させて断層イメージを得る。 生体表皮下1-2 mmの深さまで、10 µmの分解能でイメージング可能。 眼科でよく使われている。1990年に提案、1996年に実用化。

光コヒーレンストモグラフィ(OCT)

深さ 分解能 OCTの原理   (マイケルソン干渉計) (東大) 山下真司、次世代・ 最先端研究開発支援プログ ラム紹介ページより。 黄斑部 OCT像 医療法人・瞳会、ふなはし眼科HP、! 帝京大学、OCTによる眼底の観察より。 眼底検査

(31)

タイトルテキスト

本文レベル1! 本文レベル2!

イメージング法 空間分解能 深さ 感度 (mol/L) 時間分解能 定量性 ヒトへの適

応 被曝 コスト

PET 1 ~ 2 mm no limit 10 10秒~分 +++ yes yes $$$$

SPECT 1 ~ 2 mm no limit 10++ yes yes $$

蛍光 2 ~ 3 mm!顕微では
 < 1 µm< 1 cm 10 秒~分 + ~ ++ limited no $ ~ $$ 発光 3 ~ 5 mm 1~2 cm 10 (推定) 秒~分 + ~ ++ limited no $$ MRI! (ラジオ波) 25 ~ 100 µm no limit 10 秒~時間 ++ yes no $$$$ X線CT 50 ~ 200 µm no limit not well characterized not

applicable yes yes $$

超音波 50 ~ 500 µm mm ~ cm not well characterized 秒~分 + yes no $$

(Modified from Massoud TF and Gambhir SS, Genes Dev, 2003)

各種

生体イメージングモダリティの比較

まとめ

→つまるところ、直接ナノスケールを見られるmodalityはほとんどない。

 

(32)

生体を

よく

見るための材料開発

-

機能性の高いプローブ・造影剤の開発!

-

プローブ・造影剤を部位特異的に、かつ、非侵襲の

うちに必要量集積させるための材料の開発

(33)

プローブ開発 (modalityの種類に対応)

Modality プローブ 例 求められる性能 TEM 重金属 酢酸ウラニルなど、
 金コロイド(免疫染色) 原子番号大・高密度、! 低毒性 蛍光 蛍光色素/蛍光体! 蛍光タンパク質 種々の市販品、量子ドット! GFPをはじめ多数 高輝度/高量子収率、
 発光/吸収波長の自由度、
 光褪色耐性、低毒性 発光 発光酵素/基質! 合成色素 ホタルルシフェラーゼなど! ジオキセタン類 発光波長制御、高量子収率 MRI 陽性造影剤! 陰性造影剤 Gd-DTPA 酸化鉄( 高感度、高集積、低毒性 PET ポジトロン核種 核種を含む化合物 など 被曝の問題の解決 SPECT 放射性核種 123 物 被曝の問題の解決 X線CT 陽性造影剤! 陰性造影剤 硫酸バリウム、ヨード造影剤! 空気、炭酸ガス 原子番号大・高密度(吸収大)! 吸収小(陽性の補助) 超音波 造影剤 マイクロバブル 強い反射波の発生、! 超音波(高調波)発生

(34)

レポート課題(1)

生体内の階層構造の例を一つ調べ、構造の詳細と機能

の相関をレポートせよ。!

その際、その構造を示す図を必ず示し、どのようにそ

れが得られたかを解説すること。(A4 2-3枚程度)!

!

〆切:2014年11月21日まで!

提出先:メールが望ましい!

    kishimura@mail.cstm.kyushu-u.ac.jp!

(ウエスト3号館504号室まで岸村に直接提出しにきて

も良い。)

次週、11月7日は休講です。

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