学位論文の要旨
Molecular and Enzymatic Characterization of XMRV Protease
by A Cell-Free Proteolytic Analysis
(無細胞合成技術を用いたタンパク質分解解析法による
XMRV プロテアーゼの酵素学的特性の評価)
Satoko Matsunaga
松永 智子
Department of Microbiology and Molecular Biodefense Research
Yokohama City University Graduate School of Medicine
横浜市立大学 大学院医学研究科 分子生体防御学
（
Doctoral Supervisor：Akihide Ryo, Professor ）
学位論文内容の要旨
Molecular and Enzymatic Characterization of XMRV Protease
by A Cell-Free Proteolytic Analysis
(
無細胞合成技術を用いたタンパク質分解解析法による
XMRV プロテアーゼの酵素学的特性の評価
)http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874391912004241 1. 序論
ヒト免疫不全ウイルス(Human Immunodeficiency Virus; HIV)や異種指向性マウス白血病ウ イルス関連ウイルス(Xenotropic murine leukemia virus-related virus; XMRV)が属するレトロウ イルスは、ウイルスゲノム内にプロテアーゼ (protease; PR)をコードしており、自身のカプ シドタンパク質であるGag を切断することで、感染性粒子を形成する。レトロウイルスが 保有するプロテアーゼ(rvPR)は、活性中心にアスパラギン酸を持ち、二量体形成により活性 を獲得する。rvPR の切断配列は、基質である Gag タンパク質切断部位からみると指向性は あるものの多様であり、立体構造上、rvPR 二量体により形成される親和性ポケットに適合 することが必要である(Brik and Wong, 2003)。一方、このような分子構造は、宿主タンパク 質も保有しており、いくつかの宿主タンパク質がin vitro において rvPR により切断される ことが示されている(Balvay et al., 2007)。しかし、ウイルスプロテアーゼの標的となる宿主 タンパク質の知見は少なく、rvPR による宿主タンパク質の切断がウイルス複製や病原性発 現にどのように関与するかについては不明な点が多く残されている。rvPR の解析が十分進 んでいない理由として、ウイルスプロテアーゼは細胞毒性が強く、発現細胞において細胞 死を誘導するため、従来の生きた細胞を用いたタンパク質発現法では酵素活性をもつプロ テアーゼを作製、精製することが困難であることが挙げられる。したがって、活性化rvPR を用いたタンパク質切断反応を網羅的に測定することは容易ではない。 また、近年のヒトレトロウイルス感染症の治療において、薬剤耐性を有する変異型rvPR が出現しており、多剤併用療法 (Antiretroviral Therapy; ART)における適切かつ有効な治療薬 の選択が必須となっている。現在実施されている薬剤耐性検査法は、ウイルスゲノム配列 を解析しデータベースから薬剤感受性を間接的に評価する遺伝子型解析法(Genotype 法)と 患者由来のウイルスを分離、培養し薬剤存在下において実際のウイルス増殖能を評価する 表現型解析法 (phenotype 法)の二種類がある(Bansi et al., 2011)。しかしながら、前者では、 多数の蓄積した変異を評価できない点、また後者においては実際の感染細胞を用いるため、 操作が煩雑であり費用が嵩むなど問題点が多い。したがって、より迅速にかつ簡便にrvPR
の酵素活性の測定や薬剤感受性を検査できるツールの開発が必要である。 本研究では、コムギ無細胞タンパク質合成系と化学増幅型ルミネッセンスプロキシミテ ィホモジニアスアッセイ(AlphaScreen 法) を組み合わせた rvPR の酵素活性を指標としたア ッセイ系を構築し、rvPR に対する薬剤スクリーニングおよび薬剤耐性 PR の薬剤感受性試 験を行なった。また、rvPR の新規基質タンパク質同定に向けた宿主タンパク質の網羅的探 索を行い、rvPR によるヒトレトロウイルス感染症の病態関与について考察した。 2. 実験材料と方法 XMRV および HIV-1 由来 rvPR 及びレポータータンパク質は、コムギ無細胞タンパク質合 成系を用いて作製した。これらrvPR とレポータータンパク質を混合し切断反応を行った後、 AlphaScreen ビーズを加えルミネッセンスシグナル（AlphaScreen signal）を測定することで 切断活性を算出した。さらに、2 色イムノブロット法を用いて、rvPR の基質となる宿主タ ンパク質の網羅的探索を行なった。 3.結果と考察 本アッセイ系を活用し、新規ガンマレトロウイルスであるXMRV PR の性状解析および 薬剤感受性の解析を行なった結果、既存の抗HIV-1 薬では、アンプレナビル (APV)とダル ナビル(DRV)が XMRV PR の活性を阻害することを示した。また、XRMV 感染症における 病態発現のメカニズムを解明するため、rvPR の標的となる宿主タンパク質を網羅的に探索 し、PTEN や BAX を含めた複数種類のがん抑制遺伝子由来の宿主タンパク質が XMRV PR により切断されることを明らかにした。 以上の結果から、本研究で構築したrvPR の酵素活性を指標とした基質切断アッセイ系は、 迅速かつ簡便にレトロウイルスの薬剤感受性試験を行うことができる大変有用なツールで あることが示された。また、rvPR を中心としたウイルス−宿主タンパク質相互作用を明らか にすることでヒトレトロウイルス感染症における様々な病態機構の解明に繋がることが期 待される。
引用文献
Balvay, L., Lopez Lastra, M., Sargueil, B., Darlix, J.L., and Ohlmann, T. (2007). Translational control of retroviruses. Nat Rev Microbiol 5, 128-140. doi: 10.1038/nrmicro1599.
Bansi, L., Smith, C., Phillips, A., Kirk, S., Geretti, A.M., Johnson, M., Mackie, N., Post, F., Gazzard, B., Dunn, D., Sabin, C., Study, U.K.C.H.C., and The, U.K.C.G.O.H.I.V.D.R. (2011). The impact of HIV drug resistance testing on changes to treatment. AIDS 25, 603-610. doi:
10.1097/QAD.0b013e32834403a0.
Brik, A., and Wong, C.H. (2003). HIV-1 protease: mechanism and drug discovery. Org Biomol Chem 1, 5-14.
論文目録
Ⅰ. 主論文
Molecular and Enzymatic Characterization of XMRV Protease by A Cell-Free Proteolytic Analysis
Satoko Matsunaga, Tatsuya Sawasaki, Hirotaka Ode, Ryo Morishita, Ayako
Furukawa, Ryuta Sakuma, Wataru Sugiura, Hironori Sato, Masato Katahira, Akifumi Takaori-Kondo, Naoki Yamamoto and Akihide Ryo
Journal of Proteomics. 75(15): 4863-73: 31 August 2012
Ⅱ. 参考論文
A cell-free enzymatic activity assay for the evaluation of HIV-1 drug resistance to protease inhibitors
Matsunaga S#, Masaoka T#, Sawasaki T, Morishita R, Iwatani Y, Tatsumi M, Endo Y,
Yamamoto N, Sugiura W*, Ryo A*.
Front Microbiol. 2015; 6:1220. doi: 10.3389/fmicb.2015.01220. #These authors contributed equally to this work.
*These authors are corresponding authors.
Molecular dissection of HBV evasion from restriction factor tetherin: A new perspective for antiviral cell therapy.
Miyakawa K, Matsunaga S, Watashi K, Sugiyama M, Kimura H, Yamamoto N, Mizokami M, Wakita T, Ryo A.
Oncotarget. 2015 Sep 8;6(26):21840-52.
ASK1 restores the antiviral activity of APOBEC3G by disrupting HIV-1 Vif-mediated counteraction.
Miyakawa K, Matsunaga S, Kanou K, Matsuzawa A, Morishita R, Kudoh A, Shindo K, Yokoyama M, Sato H, Kimura H, Tamura T, Yamamoto N, Ichijo H, Takaori-Kondo A, Ryo A.
Wheat germ cell-free system-based production of hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein of human parainfluenza virus type 3 for generation and characterization of monoclonal antibody.
Matsunaga S, Kawakami S, Matsuo I, Okayama A, Tsukagoshi H, Kudoh A, Matsushima Y, Shimizu H, Okabe N, Hirano H, Yamamoto N, Kimura H, Ryo A. Front Microbiol. 2014 May 13;5:208. doi: 10.3389/fmicb.2014.00208. eCollection 2014. Involvement of hepatitis C virus NS5A hyperphosphorylation mediated by casein kinase I-α in infectious virus production.
Masaki T, Matsunaga S, Takahashi H, Nakashima K, Kimura Y, Ito M, Matsuda M, Murayama A, Kato T, Hirano H, Endo Y, Lemon SM, Wakita T, Sawasaki T, Suzuki T. J Virol. 2014 Jul;88(13):7541-55. doi: 10.1128/JVI.03170-13. Epub 2014 Apr 23.
Development of oligomannose-coated liposome-based nasal vaccine against human parainfluenza virus type 3.
Senchi K, Matsunaga S, Hasegawa H, Kimura H, Ryo A.
Front Microbiol. 2013 Nov 26;4:346. doi: 10.3389/fmicb.2013.00346. eCollection 2013. Biotinylated-sortase self-cleavage purification (BISOP) method for cell-free produced proteins.
Matsunaga S, Matsuoka K, Shimizu K, Endo Y, Sawasaki T. BMC Biotechnol. 2010 Jun 4;10:42. doi: 10.1186/1472-6750-10-42.
