Title
Inhibition of inducible isoforms of cyclooxygenase and nitric
oxide synthase by flavonoid hesperidin in mouse macrophage cell
line( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
坂田, 佳子
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第563号
Issue Date
2004-03-25
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14563
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氏 名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 坂 田 佳 子(東京都) 博 士(医学) 甲第 563 号 平成16 年 3 月 25 日 学位規則第4条第1項該当
Inhibition ofinducibLeisoforms of cyclooxygenase and nitric oxide Synthase by flavonoid hesperidinin mouse macrophage ce=line
(主査)教授 森 秀 樹 ■ (副査)教授 森 脇 久 隆 教授 小 澤 修 論文内容の要旨 はじめに ヘスペリジンは,主にかんきっ類に含まれるフラボノイドである｡ヘスペリジンはラットを用いた動物実験で 単独もしくはジオスミンと共に飼料投与することにより,舌,大腸,食道および勝胱において発がん抑制作用が あることが示されてきた｡そのがん予防のメカニズムを追求することは,本物質を化学予防物質としてヒトへの 応用をはかる際に重要となる｡ヨーロッパで発売されたDaflon⑧は,ヘスペリジンとジオスミンを1:9の割合 で配合したものであるが,抗炎症作用があることがわかっている｡がん発生の危険性と慢性炎症の相関性につい
ての報告や,発がん過程において炎症に寄与する酵素cyclooxygenase-2(COX-2)やinducible nitric oxide
Synthase(iNOS)が関与しているとの報告が多数ある｡COX-2はアラキドン酸カスケードを通してプロスタグラ ンジンE2(PGE2)を産生し,また,iNOSは一酸化窒素(NO)を産生する｡ 今回,ヘスペリジンのがん予防メカニズムを探るため,マウスのマクロファージ細胞株に1ipopolysaccharide (LPS)を投与してCOX-2の代謝産物であるPGE2,iNOSの代謝産物NOから派生する安定した化合物であるNO2 の濃度がヘスペリジンによって抑制されるかどうかを検討した｡さらに,COX-2とiNOSの蛋白量がヘスペリジ ン投与によって抑制されるかをウエスタンプロット法にて検討した｡ 対象および方法 1)マウスマクロファージ細胞株RAW264.7に150FLMまでヘスペリジンを投与し,MTSアッセイ法にてヘスペ リジンの細胞毒性を検討した｡ 2)RAW264･7にLPSを投与してPGE2とNO2の濃度が上昇することを確認した(positivecontrol)｡ 3)ヘスペリジンをDMSOで溶解して10,20,30FLMとし,LPS投与の30分前に培地内に混合してLPSによる PGE2とNO2の濃度抑制効果を検討した｡PGE2の濃度は酵素抗体法を用いて測定し,また,NO2の濃度は Griess reagentを用いて測定した｡ 4)ヘスペリジンおよびLPSを投与したRAW264.7から蛋白を抽出し,COX-2およびiNOS蛋白発現抑制の程度を, positive controlに対して相対評価した｡ 結果 1)検討した濃度範囲内では,ヘスペリジンの細胞毒性は認められなかった｡ 2)RAW264･7にLPSを0･2FLg/mlを投与することにより(陽性コントロール群)PGE2は8.8±1.O ng/ml(陰性
コントロール群では3.5±0.3ng/ml),NO2は6.03±0.08FLM(陰性コントロール群では0.82±0.13FLM)と 有意な濃度上昇が認められた｡ 3)ヘスペリジンを10から30FLMの範囲内で投与することによりLPSによって誘導されるPGE2はヘスペリジン 10〟Mでは7.0±1.4ng/ml,20FLMでは4.3±0.9ng/ml,30FLMでは3.9±0.8ng/mlと濃度依存性に抑制 した｡ 4)また,ヘスペリジン投与によりLPSによって誘導されるNO2はヘスペリジン10FLMで4.48±0.07pM,20FLM で3.21±0.07〟M,30〝Mで3.21±0.07〟M,と抑制した｡ 5)ヘスペリジンはLPSによって誘導されるCOX-2蛋白の発現を抑制しなかったが,iNOS蛋白の発現は濃度依存 性に抑制した｡ 考察 本研究では,植物由来のフラボノイド,ヘスペリジンについてその抗炎作用機序について検討しCOX-2蛋白 およびiNOS蛋白,またそれら蛋白が生成するPGE2とNO2が抑制されることを確認した｡ヘスペリジンはこれ まで抗炎症作用のはかラットを用いた動物実験において,種々の発がんを抑制することが確認されている｡本研 究によりそのがん予防作用機序のひとつとして,ヘスペリジンによるiNOS発現,PGE2とNO産生の抑制が関与 することが示唆された｡ 論文書査の結果の要旨 申請者 坂田佳子は,植物由来のフラボノイドであるヘスペリジンを用いてその抗炎症作用のメカニズムの 一部を明らかにし,がんの化学予防メカニズムの一部である可能性を示唆した｡本研究は,植物由来フラーボノイ ドによるがん化学予防研究の発展に少なからず寄与するものと認める｡ 〔主論文公表誌〕 Inhibitionofinducibleisoformsofcyclooxygenaseandnitricoxidesynthasebyflavonoidhesperidinin
mouse macrophage cellline
Cancer Letters199,139-145(2003).
