Title Development of Synthetic Routes of Oligosaccharide UnitsRelated to Molecular Recognition, Employing Glycosidase‐mediated Transglycosylation( 内容の要旨 ) Author(s) 村田, 健臣 Report No.(Doctoral Degree) 博士(農学) 乙第019号 Issue Date 1998-03-13 Type 博士論文 Version publisher URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/2264 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏 名(本籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 学 位 論 文 題 目 審 査 委 貞 村 田 健 臣 (滋賀県) 博士(農学) 農博乙第19号 平成10年3月13日 学位規則第4粂第2項該当
Development of Synthetic Routes of
Oligosaccharide Units Related to Xolecular Recognition,Enploying Glycosid8Se-Aediated Tran$glyco$ylation 主査 静 岡 大 学 教 授 副査 静 岡 大 学 教 授 副査 岐 阜 大 学 教 授 副査 信 州 大 学 教 授 副査 静 岡 大 学 助教授 市 三 治 義 和 泰 完 宏 明 洋 水 田 藤 野 岸 堆坂 加 細 河 論 文 の 内 容 の 要 旨 近年複雑な生体成分の分離･分析技術の進歩により､生物化学の研究対象が 細胞レベルまで広がり､細胞表層の糖タンパク質や糖脂質を構成するオリゴ糖 鎖が細胞相互の情報伝達の深く関わっていることが明らかになってきている｡ しかしながら､このようなオリゴ糖鎖の果たす役割を明らかにするために､研 究に必要な十分量のオリゴ糖鎖を得るための効率的な合成研究を確立する必要 がある｡このような背景の下で､本研究は複合糖質のオリゴ糖鎖における重要 オリゴ2∼3糖を糖質水解酵素の有する特異な糖鎖交換反応(糖転移反応)を駆 使して実践的合成法の開発を目指したもので､内容は次のように3部に要約さ れる｡ 1.ガラクトシル2糖 βad〃uβdん血刀β由来のβ一D-ガラクトシダーゼのガラクトシル基転移反応 を用い生成したp一ニトロフェニル基をアグリ_コンに持つβ-1,3､β-1,4､β-1,6 結合ガラクトシルーグルコシド(Gal-GIc)2糖配糖体3種類を同時にゲルろ過ク ロマト操作により分離･調製できることを示した｡この際､結合形成速度は1,4 >1,3≫1,6の順であることから反応時間を制御することでそれぞれの異性 体の選択的合成が可能あることを明らかにした｡次に､ブタ精巣由来のβ-D-ガ ラクトシダーゼの位置選択的ガラクトシル基転移反応を利用しラクトⅣ-ビオ
ースⅠ配糖体(Galβl-3GIcNAcβ一OC6H4NO2一山トおよびGalβ1-3GalNAcβ-OCGH4NO2-pの従来では達成し得ない合成法を開発した｡このように本酵素は､ 高選択的にガラクトシルβ-1,3結合形成を触媒する特異な酵素であることを実 証している｡ 2.ルアセチルグルコサミニル3糖 ポリラクトサミン系糖鎖を含有する3糖単位(GIcNAcβ1-3Galβ1-4GIcNA() の合成を目的として､Ⅳ-アセチルラクトサミン単位への位置選択的Ⅳ-アセチ ルグルコサミニル基転移反応を行っている｡凡)毘dia ode血aユf5由来のβ-Ⅳ一 アセチルへキソサミニダーゼ(β-NAⅡase)を用い､供与体基質であるぺⅣ'-ジ アセテルキトビオースからの受容体基質ルアセチルラクトサミン2糖配糖体 (Galβ1-4GIcNAcβ-OC6H4NO2-b)へのCncNAc転移反応を行うと目的化合物で ある GkNAcβ1-3Galβ1-4GIcNAcβ-OC6H4NO2-P(1)とその構造異性体 GIcNAcβ1-6Galβ1-4GIcNAcβ-OC6H4NO2-P (2)と Galβ1-4(αcNAcβ1- 6)GIcNAcβ-OC6H4NO2-P@)とを生成した｡この反応において受容体基質とα-サイクロデキストリン(0卜CD)との包接複合体形成を利用すると基質濃度が著 しく(約4倍)上昇し､高濃度基質下での反応が可能となるばかりか3の生成 を著しく抑制し目的化合物1の生成比および収率をも向上させる効果を有して いることを見出している｡この場合の3の生成比の減少は､受容体基質のα-CD 包接複合体形成による立体障害によりGIcNAc残基OH-6への転移確率が減少 するものと結論づけている｡ 3.ムチン型オリゴ糖鎖1型および2型 ムチン型糖鎖1型の基本単位は3-0一β-ガラクトシルーⅣ-アセチルガラクトサ ミンがα一括合でセリンやスレオニンの水酸基に結合し､2型はこの1型の Ga皿c残基にβ-1,6結合でGkN血が付加した分岐3糖をコア構造として有し､ 0型糖鎖として広く分布している｡本研究は､このムチン型糖鎖1から2型の 全合成を行ったものである｡ ブタ精巣由来のβ-D-ガラクトシダーゼのpニトロフェニルα-ルアセチルガ ラクトサミニド(GalNAcβ-OC6H4NO2-b)へのOH-3位への高位置選択的ガラ クトシル基転移反応を利用し､コア1型のミミック糖鎖p-ニトロフェニル3-0-β一ガラクトシルーα-N-アセチルガラクトサミニド 叫,Galβ1-3GalNAcβ-OC6H4NO2-Pを得た｡次にN.0鹿nね鮎由来のβ-NAHaseを用い上記合成し た化合物4を受容体基質として糖転移反応を行うと受容体2糖のOH-6>OH6' >OH-3の順にGIcNAc転移し､その結果､目的のコア2型構造を有する Galβ1-3(GIcNAcβ1-6)GalNAcα一OC6H4NO2-Pが主生成物として得られること を見出した｡この様に2種類の酵素の逐次糖付加反応を活用することでムチン
-135-型糖鎖コア1型から2型の逐次合成が比較的容易に達成できることを明らかに した｡ 以上のように､本研究はグリコシダーゼを活用し生体内とは異なった極限状 態で糖転移反応を行わせることで､複合糖質オリゴ糖鎖の分子認識に関わると される重要2∼3糖を中心とした実践的合成法を確立している｡このことはオリ ゴ糖鎖の分野においてさらなる多彩な合成法の開発の可能性を示唆するもので ある｡さらにこの種のオリゴ糖の量産技術の開発は十分量のオリゴ糖のが可能 となることにより､糖鎖工学において様々な利用法が期待されるム 審 査 結 果 の 要 旨 本論文は､複合糖質オリゴ糖鎖の分子認識に関わるとされる重要2∼3糖のグ リコシダーゼの極限状態で発現する糖鎖交換反応(糖転移反応)を活用した従 来では達成し得ない実践的酵素合成法の成果をまとめたものである｡その内容 は緒論に続き第1章では酵素機能制御によるガラクトシル2糖の位置選択的合 成法､第2章は､ポリラクトサミン系糖鎖が有する3糖単位の特異な合成､第3 章は､連続した逐次糖付加反応によるムチン型オリゴ糖鎖のコア1型から2型 の全合成をそれぞれまとめたものである｡ 1)βad〃u5dl℃血刀β由来のβ-D-ガラクトシダーゼの糖転移反応を利用しβ一 ラクトシド配糖体とその(1→3)､(1→q結合異性体を一段階で調製する方法を 考案した｡糖転移生成物の生成頻度は､反応初期において(1→弔>(1→3)> (1→6)の順であるが､反応後期ではこの生成比の関係は逆転し(1→6)結合2糖 が増大した｡このことから､反応時間をコントロールするととで希望するガラ クトシル2糖を合成できることを実証した｡次に､ブタ精巣由来のβ一D-ガラク トシダーゼの高位置選択的なガラクトシルβ(1→3)結合形成能を活用しラクト ールビオースⅠ配糖体(Galβ1-3GIcNAcβ-OC6H4NO2-b)の合成法を確立した｡ 2)自然界に広く分布しているポリラクトサミン系糖鎖が含有するルアセチル グルコサミニル3糖(GIcNAcβ1-3Galβ1-4GIcNAdの合成を目的とした｡ ∧bαけd元=ガ壷Ⅶ血如来由来のβ-Ⅳアセチルへキソサミニダ｣ゼ(β一帖Hase)■を 用い､供与体基質である凡Ⅳしジアセチルキトビオースからの受容体基質ルア セチルラクトサミン2糖配糖体(Galβ1-4GldNAcβ一OC6H4NO2-EDへのGIcNAc 転移反応により目的化合物であるGIcNAcβ1-3Galβ1-4GIcNAcβ-OC6H4NO2-P (1)とその構造異性体GIcNAcβ1-6Galβ1-4GIcNAcβ一OC6H4NO2-P(2)とGalβ1-4(GIcNAcβ1-6)GIcNAcβ-OQH4NO2-p(3)とを得ている｡本反応を行う際､受容 体基質とα一サイクロデキストリンの包接複合体を形成させながら反応を行うと 高濃度で反応を行えるばかりか化合物3の生成を著しく抑制し目的化合物1の 位置選択性の増大と収率の向上をもたらすことを見出した｡
-137-3.Kawashima,H.,Murata.T.,Yamamoto,K,Tateishi,A.,Ⅰrimura,T.,and Osawa,T.(1992)Asimplemethodforthereleaseofasparagine-hJiked oligosaccharidesfromaglycoproteinpurifiedbySDS-POlyacrylamidegel electrophoresis,JIBiochem.,111,620-622. 4.Usui,T.,Murata.T.,YAbuuchi,Y,andOgawa,K(1993)Transglycosy-1ationreactionofmaltotriose-formingamylasefromStrppto叩eS gnβeuβ,伽bo血刀正月eβ.,250,57-66･ 5.捏塾組邑保田織恵,河内全(1994)糖鎖の解析,pp.171-179.,嶋田哲也 坐坦陛邑青木一正,細胞膜表面糖鎖の解析,pp.115-117.,田沼靖一監修, アポトーシス実験プロトコール,秀潤社,東京. 6.Usui,T.,Morinoto,S.,Hayakawa,Y.,Eawaguchi,M･,Murata･T･, Matahira,Y,andNishida,Y.(1996)RegioselectivityofP-D-galactosyl-disaccharidefornationusingtheβ-D･galactosidasefromBacillus drcu血刀β,伽わdげdr.Reβ.,285,29-39. 7.碓氷泰市,捏星組臣(1996)オリゴ糖鎖ライブラリーの作製,有機合成化学 協会誌,54(勺,607-615. 8.Zhuang,C.,独∬ata.T.,Usui,T.,Kawagishi,H･,andKobayashi,K(1996) PurificationandcharaCteriヱationofalectinfromthetoxicmushroom A皿a∫】血pa刀班e血a,風加血血.且叩み卵.Ac晩1291,40-44･ 9.Kawagishi,H.,Wasa,T.,迦ata,T.,Ustd,T･,Kimura,A･,andChiba,S･ (1996)Twoルacetyl-D･galactosamine-SperCi&clectinsfromPhaeol印iota aurea,勒∝ムe血β吻41(勾,1013-1016･ 10.Eawa由5軋H.,MitsⅦnaga,S.-Ⅰ･,Yamaw揖MリIdo,M･,Shmada, A,Kinoshita,T.,坦urata.T.,U8ui,T.,Ⅸimura,A,and Chiba,S･ (1997)Alectinfrommyceliaofthefungus Ganodema)ucidum, 蝕〆Ode皿ゴβ叫う44(1),7-10･ 11.坦urata.T.andUsui,T.(1997)Preparationofoligosaccharideumits libraryanditsutili2;ation,且osci･Biotech･且ochem･61,1059-1066･ 12.Yasuno,S,Murata.T.,私立ubo,K,andKamei,M･(1997)Two.mode analysisbyhigh-performanCeliquidchromatgraphyofp-aminoben2;Oic ethyle$ter-derivatizedmonosaccharides,Biosci･Biotech･Biochem･61, 1944･1946. 13.Murata.T.,Shibatsuji,M.,Hara,H.,Yasun0,S･,Yamaguchi,T･, K,Hoshino,0.,Tanuma,S･,Moriya,H･,Sweely,C･C･,andIkekita･M･ (1997)StruCturalcharacteri2iationofsialylatedandneutralルhnked oligosaccharideslabeledwithp-aminobenzoicacidoctylesterbyhigh performandeliquidchmmatographyandfastatombombard皿entmaSS
spectrometry,Res.Commn.Biochem.CellMb).Biol.acceptedfor publication. 14.Murata,T.,Yasuda,0.,Shimada,T.,Shinomiya,T.,Yasuno,S., YamaguChi,T.,Tanuma,S.,Ikekita,M.(1997)StruCturalalterationof ceusurfaceoligosaccharidesonHL-60RGceusunde曙0ingapoptosis, Res.Commn.Biochem.CeHMb).Bio).acceptedforpublication. -139一
