59 日立評論2004.10
733 Vol.86 No.10
サブマイクロリットルの微量サンプルを高分離，高感度で分
析するHPLC〔High-Performance Liquid
Chromatogra-phy：キャピラリー（マイクロ）高速液体クロマトグラフィー〕の 研究は，1970年代後半に日米欧の3グループによってスター トし，約30年の歴史がある1）∼3） 。中でも，名古屋大学の石井
はじめに
1
2003年は，ヒト ゲノム シーケンスが終了し，生命科 学にとって記念すべき年となった。また，その翻訳によ り，生体内で合成されるタンパク質や代謝系を網羅的 に解析する「プロテオーム（グライコプロテオームやメ タロームを含む。）」や「メタボローム」の新たな幕開け ともなった。ハイスループットDNA（Deoxyribonucleic Acid）シーケンサがゲノム解析に大きな役割を果たし たのと同様に，複雑で極微量の試料を対象とするプ ロテオーム解析やメタボローム解析では，ナノ高速液 体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析法（ナ ノHPLC-ESI MS）への期待が高まっている。 日立グループが開発したナノ流量グラジエント装置 は，このような研究ニーズに対応するものである。この 装 置は，複 雑な生 体 試 料 の 高 感 度 ，高 分 離ナノ HPLC-ESI MSシステムの構築と，安定で再現性のよ いプロテオームやメタボローム解析に不可欠となるも のと期待されている。出口喜三郎 Kisaburô Deguchi 吉 岡 信 二 Shinji Yoshioka 伊 藤 伸 也 Shin'ya Itô 緒方いずみ Izumi Ogata
ナノ高速液体クロマトグラフィー・質量分析法の
ナノ流量グラジエント装置の開発
Development of Nanoflow Gradient Generator for Nano High-Performance
Liquid Chromatography Mass Spectrometry
ナノHPLC/MSを用いたプロテオーム解析の流れ
生体試料から電気泳動で分離した個々のタンパク質スポットを切り出し，消化酵素でペプチドへ断片化する。これをナノ流量の液体クロマトグラフで分離し，質量分析計で検出する。 得られたデータをタンパク質のマス スペクトル データベースで検索し，目的のタンパク質を同定する。
注：略語説明 HPLC（High-Performance Liquid Chromatography；高速液体クロマトグラフィー），MS（Mass Spectrometry；質量分析法）
バイオテクノロジーの最新技術と動向 特集 タンパク質の分離（電気泳動） タンパク質同定 タンパク質の酵素消化 タンパク質切り出し ナノHPLC/MS分析 データ解析 前処理 データベース検索 データベース 保持時間 信号強度 ナノ高速液体クロマトグラフ 質量分析計
60 日立評論2004.10 734 Vol.86 No.10 大道教授が率いるグループが果たした役割は大きい。当時 のUV（Ultraviolet Ray）吸収検出器や蛍光検出器をベー スとしたマイクロHPLCを「第一世代」とすれば，汎用性の高 いESI（Electrospray Ionization：エレクトロスプレーイオン 化法）4） が開発された後のMS（Mass Spectrometry：質量 分析法）と結合したマイクロ・ナノHPLC-ESI MSは「第二世 代」と言えると考える。後者は，今や複雑で極微量の生体成 分（核酸，タンパク，ペプチド，糖鎖，脂質など）の分析には 必要不可欠になりつつある。しかし，ルーチン的に使用でき る成熟した分析装置の域にはまだ到達しておらず，幾つか の解決すべき技術的課題が残っている。その一つが，ナノフ ロー領域（nL/min）での安定したグラジエント（こう配）の実現 である。 ここでは，このような研究課題にこたえるために日立グルー プが開発した，新たなナノ流量グラジエント装置の原理，特 徴，性能，ナノHPLC-ESI MSへの応用，および今後の展望 について述べる。 低マイクロ流量やナノ流量域でも，多成分を効率よく分離 するためには，複数の溶媒やバッファ組成を時間とともに変え ながらキャピラリー（マイクロ）カラムに送液する，いわゆるグラ ジエント溶出法が必要である。それをどのように行うかは， 「第一世代」からの大きな懸案であった。当時，幾つかの原 理的方法が提案され，「第二世代」でも，それらの方法がそ のままの形や，少し改良された形で使用されている。中でも， スプリット法は，最も簡便な方法として現在でも多用されてい る。しかし，キャピラリーカラムなどの圧力変動がそのまま流 量変動となるため，再現性のよいデータを連続して収集する には不安がある。そのために，スプリッタに頼らない新たな方 法が長年求められてきた。 ナノ流量グラジエント装置を用いたキャピラリーHPLCの構 成を図1に示す。点線枠で示した部分が，今回開発した
「AT10PV（Asymptotic Trace 10-Port Valve）ナノグラジ
エント装置」と呼んでいるものの構成である5） 。この装置は， （1）マイクロ流量の低圧（または高圧）グラジエントポンプ，（2） ナノ流量のイソクラテック（シリンジ）ポンプ，（3）10方バルブ（2 インジェクションループと背圧用コイルも含む。），および（4）コ ントローラで構成している。 グラジエント溶液は，マイクロ流量の低圧グラジエントポンプ で作製されてから，10方バルブに送られる。図1の流路では， インジェクションループAにロードされた後，背圧用コイルを 通ってドレーンに排出される。この間，インジェクションルー プBにロードされていた混合液は，ナノ流量のイソクラテック （シリンジ）ポンプにより，キャピラリーカラムに送り出されている。 ここで10方バルブを切り替えれば，今までインジェクションルー プAにロードされていた混合液が送り出され，インジェクション ループBには，新たな混合液がロードされる。10方バルブの 切り替えを一定時間（例えば，1∼2分）ごとに繰り返すことに より，ナノ流量でのグラジエントが実現できる。図1右上の カーブは，その様子を模式的に示したものである。 実線はマイクロ流量の低圧グラジエントポンプで作製される グラジエントカーブであり，点線は，ナノ流量でキャピラリーカ ラムに送り出されるグラジエントカーブである。すなわち，10方 バルブの切り替え時間（図1では2分）ごとにステップ状で元の グラジエントカーブに追随していくことになる。もし，切り替え 時間間隔をさらに短くすれば，元のグラジエントカーブに「漸 近的に（Asymptotically）追随（Trace）」していくことは容易 に理解できる。一方，背圧用コイル（またはカラム）の役割は， 10方バルブの切り替え時の圧力ショックによるナノ流量の変動 を最小限にすることである。 元のグラジエントカーブへの追随性がどの程度あり，また， 再現性があるのかについて，実際のデータを使って以下に述 べる。 AT10PVナノグラジエント装置 AT10PVの動作原理 時間（min） 0 5 10 15 20 50 100 %B A B C ミキサ コントローラ マイクロ流量 グラジエント ポンプ ナノ流量 シリンジ ポンプ インジェクション ループ B 背圧コイル ドレーン インジェクション ループ A 10方 バルブ サンプル インジェクタ キャピラリーカラム 検出器 （UV/MS） 図1 ナノ流量グラジエント装置を用いたキャピラリーHPLC（高速 液体クロマトグラフィー）の概略構成 右上部のAT10PVナノグラジエント装置の動作原理図では，元のマイクロ流量の グラジエントカーブ（実線）と，それをステップ状で追随するナノ流量グラジエントカーブ （点線）を模式的に示している。
注：略語説明 AT10PV（Asymptotic Trace 10-Port Valve）， UV（Ultraviolet Ray），MS（Mass Spectrometer）
ナノ流量グラジエント装置の性能
4
研究ニーズ
2
ナノ流量グラジエント装置の
原理と特徴
3
61 日立評論2004.10 ナノ高速液体クロマトグラフィー・質量分析法のナノ流量グラジエント装置の開発 735 Vol.86 No.10 低圧グラジエントポンプによって流量100 L/minで作製し たグラジエントカーブと，流量500 nL/minと200 nL/minで追 随したナノグラジエントカーブを重ね，比較したものを図2に示 す。同図の挿入部分は，30分付近を拡大したものである。 500 nL/minのカーブには 上述の「ステップ」が見えるものの， 200 nL/minの低流量では，拡散効果によって「ステップ」は 完全に消失し，元のグラジエントカーブ並みにスムーズである。 しかし，この「ステップ」も，10方バルブ切り替え時間を1分か ら0.5分に早めることで完全に消失する。 流量50 nL/minでのナノグラジエントカーブの再現性を調 べた結果を図3に示す。同図の挿入部分は，25∼30分付近 を拡大したものである。6回の連続したデータを重ねていても， 流量50 nL/minでのグラジエント再現性が非常によいことが わかる。
BSA（Bovine Serum Albumin）（150 fmol）のトリプシン
消化ペプチドを，キャピラリーカラム〔ODS（オクタデシル基），
75 m×150 mm〕を使用し，流量200 nL/minで分析した
UVクロマトグラムを図4に示す。ここでも連続6回のデータを 重ねて比較しており，同図の表に主なピークの保持時間の
再現性をまとめたものを示す。流量200 nL/minでのRSD
（Relative Standard Deviation：相対標準偏差）0.3％以下
は，通常のマイクロ流量でのHPLCの再現性結果と比較して
も，まったく遜（そん）色がないと言える。
1章に述べたように，1984年にESIが開発されてすぐに，
ESIはLC（Liquid Chromatography）とMSを結ぶ有力なイ
ンタフェースになるであろうと期待された4） 。すなわち，「第二 世代」の幕開けである。その後，いっそうの高感度化を目指 してマイクロ・ナノESIが開発され6）, 7） ，今やマイクロHPLC-MS が主流になりつつある。前述のナノ流量グラジエント装置をマ イクロ・ナノESI MSに応用した例について以下に述べる。 BSA（150 fmol） をトリプシン消化後，キャピラリーHPLC-ESI MSで分析した例を図5に示す。使用したキャピラリーカ ラムは，ESIニードルを一体化させたNewObjective社製 ProteoPep C18（ODS，75 m×50 mm：先端径15 m）で
ある。TIC（Total Ion Chromatogram）やBIC（Base Ion
Chromatogram）からわかるように，UVでは検出できない多 くのピークが見られる。主なピークのMS（質量スペクトル）とペ プチドシーケンス帰属を図6に示す。このように感度（SN比） のよいMSスペクトルが得られるのと同時に，1価イオンよりも2， 3価イオンが強く検出されるのもナノESIの特徴である。大腸 菌（E.coli）プロテオーム解析で流量を50 nL/minにすること により，同定されるタンパク数が4，5倍増加するという最近の 報告がある8） 。この装置でも，流量50 nL/minにおいて保持 時間の再現性のよい（RSD 1％以下）データが得られている9） 。 0 −20 140 120 100 80 60 40 20 0 85 80 75 70 65 60 20 30 32 34 40 60 時間（min） 時間（min） 信号強度 （m V） 信号強度 （m V） 80 100 B：500 nL/min B：500 nL/min C：200 nL/min C：200 nL/min A：マイクロ流量グラジエント A：マイクロ流量 グラジエント 分析条件 ： 溶離液A ： 水, B ： 0.2％アセトン溶液 ； グラジエントプログラム（％B）： 0（0.0min）→100（40 min）→
100（80 min）→0（80.1 min）→0（105 min） ； 検出波長 ： 250 nm ； 10方バルブ切り替え周期 ： 1 min 図2 ナノ流量グラジエントの追随性と性能 Aはマイクロ流量グラジエントポンプによって流量100 L/minで作製した元のグラ ジエントカーブを，BとCは，AT10PVナノグラジエント装置で作製された流量 500 nL/minと，200 nL/minでのナノ流量 グラジエントカーブをそれぞれ示す。 0 50 100 150 信号強度 （m V） 0 10 20 30 40 50 60 保持時間（min） ピーク保持時間の再現性 データ番号 RT（Pk1） RT（Pk2） RT（Pk3） RT（Pk4） RT（Pk5） 1 2 3 4 5 6 27.19 27.20 27.39 27.15 27.23 27.25 35.84 35.89 36.00 35.89 35.92 36.03 37.49 37.52 37.63 37.49 37.52 37.63 45.52 45.52 45.56 45.49 45.57 45.60 49.15 49.17 49.33 49.20 49.23 49.28 平均（min） RSD（％） 27.235 35.928 37.55 45.558 49.23 0.30 0.20 0.17 0.13 0.14 図4 BSAトリプシン消化ペプチド分析の再現性
キャピラリーカラムを用いてBSA（Bovine Serum Albumin）のトリプシン消化ペプ チドを流量200 nL/minで分析したUVクロマトグラムを示す。 注：略語説明 RT（Retention Time；保持時間），Pk（Peak）， RSD（相対標準偏差）
キャピラリーHPLC-ESI MSへの応用
5
0 −50 0 50 100 150 200 250 90 80 70 60 50 40 20 30 29 28 27 26 25 40 60 時間（min） 時間（min） 信号強度 （m V） 信号強度 （m V） 80 100 分析条件 ： 溶離液A ： 水, B ： 0.05％カフェイン水溶液 ； 検出波長 ： 273 nm。 他の条件は図２と同じ。 図3 流量50 nL/minでのグラジエントカーブの再現性（N=6） 溶離液はAが水，Bが0.05％カフェイン水溶液，検出波長は273 nm，他の条件 は図2と同じである。挿入図は25∼30分付近の，6回のナノ流量グラジエントカーブ の拡大を示す。62 日立評論2004.10 736 Vol.86 No.10
参考文献
1）R. P. W. Scott, et al.：The Elusion Properties of Some Com-mercially Available Silicagels, J. Chromatogr., 251, 125（1976） 2）D. Ishii, et al.：A Study of Micro-High-Performance Liquid
Chromatography I, J. Chromatogr., 144, 157（1977）
3）T. Tsuda, et al.：Studies of Open-Tubular Micro-Capillary Liq-uid Chromatography II, J. Chromatogr., 158, 227（1978） 4）C. M. Whitehouse：Electrospray Interface for Liquid
Chro-matographs and Mass Spectrometers, Anal. Chem., 57, 675 （1985）
5）K. Deguchi, et al.：Nanoflow Gradient Generator for Capillary High-Performance Liquid Chromatography, Anal. Chem., 76, 1524（2004）
6）M. S. Wilm, et al.：Electrospray and Taylor-Cone Theory, Dole's Beam of Macromolecules at Last?, Int. J. Mass Spec-trom. Ion Process, 136, 167（1994）
7）M. R. Emmett, et al.：Micro-Electrospray Mass Spectrometry: Ultra-High-Sensitivity Analysis of Peptides and Proteins, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5, 605（1994）
8）T. Natsume, et al.：A Direct Nanoflow Liquid Chromatogra-phy―Tandem Mass Spectrometry System for Interaction Proteomics, Anal. Chem., 74, 4725-4733（2002）
9）S. Ito, et al.：Nanoflow Gradient Generator for Nanoscale LC/MS System, Proceeding of 52nd ASMS（2004）
吉 岡 信 二
1996年日立計測エンジニアリング株式会社入社，株式会社 日立サイエンスシステムズ 那珂カスタマーセンタ 所属 現在，LC/MSのアプリケーション開発に従事 日本分析化学会会員
E-mail：yoshioka-shinji @ naka. hitachi-hitec. com 出口喜三郎 1984年日立計測エンジニアリング株式会社入社，北海道大 学大学院理学研究科 特任助教授 現在，LC-MSによる糖鎖分析の研究に従事 理学博士 日本分析化学会会員，日本質量分析学会会員，アメリカ質 量分析学会会員
E-mail：deguchi @ glyco. sci. hokudai. ac. jp
緒方いずみ
2001年日立製作所入社，株式会社日立ハイテクノロジーズ ナノテクノロジー製品事業部 所属
現在，LC/MSの設計開発に従事
E-mail：ogata-izumi @ naka. hitachi-hitec. com 伊 藤 伸 也
1995年日立製作所入社，株式会社日立ハイテクノロジーズ ナノテクノロジー製品事業部 所属
現在，LC/MSの設計開発に従事
日本分析化学会会員，日本質量分析学会会員 E-mail：ito-shinya @ naka. hitachi-hitec. com
執筆者紹介 ここでは，日立グループが開発したナノ流量グラジエント装 置について述べた。 複雑で極微量のサンプルを対象とするプロテオーム（グライ コプロテオームやメタロームを含む。）解析やメタボローム解析 におけるキャピラリー（マイクロ）HPLC-ESI MSへの期待は， 今後さらに高まっていくものと考える。特に，ダイナミックレンジ が5けた以上にも及ぶ多成分サンプルを分析対象とするこの 分野では，キャピラリーカラムだけでなく，分離システム全体の 性能向上がいっそう重要になる。そのため，1種の分離モー ドから複数の分離モードを組み合わせた「多次元HPLCと
HPCE（High-Performance Capillary Electrophoresis）」
が分離分析科学の分野で盛んに議論されており，また，近い 将来，「第三世代」の到来を予感させるような勢いもある。日 立グループのナノ流量グラジエント装置がそれに貢献できるよ うに努めていく考えである。 TIC 200 nL/min BIC 保持時間（min） 相対強度 （％ ） 相対強度 （％ ） 0 8 16 24 32 40 0 8 16 24 32 40 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 1 3 2 45 6 7 8 分析条件： 溶離液A ： 0.1％ ギ酸水溶液, B ： 0.1％ ギ酢酸含むアセトニトリル溶液 ； グラジエントプログラム（％B）： 0（0.0 min）→0（4.0 min）→50（40 min）→100（40.1 min）→100（60 min）
図5 BSA（150 fmol）
トリプシン消化ペプチドのマイクロHPLC-MS分析例（流量200 nL/min）
TICとBICでUV（紫外吸収検出器）では検出できない多くのピークが見られる。 注：略語説明 TIC（Total Ion Chromatogram），BIC（Base Ion Chromatogram）
Peak No.1 LVTDLTK Peak No.2 FKDLGEEHFK Peak No.5 RHPEYAVSVLLR Peak No.6 KQTALVELLK Peak No.3 AEFVEVTK Peak No.4 HLVDEPQNLIK Peak No.7 KVPQVSTPTLVEVSR Peak No.8 LVNETEFAK 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 300 440 580 720 860 1,000 300 440 580 720 860 1,000 300 440 580 720 860 1,000 300 440 580 720 860 1,000 300 440 580 720 860 1,000 300 440 580 720 860 1,000 300 440 580 720 860 1,000 300 440 580 720 m/z m/z m/z m/z m/z m/z m/z m/z 860 1,000 ［M＋2H］2 ［M＋3H］3＋ ［M＋3H］3＋ ［M＋3H］3＋ ［M＋2H］2＋ ［M＋2H］2＋ ［M＋3H］3＋ ［M＋3H］3＋ ［M＋2H］2＋ ［M＋2H］2＋ ［M＋4H］4＋ 図6 BSA（150 fmol）トリプシン消化ペプチドのMSと同定例（図 5の8ピーク） 主なピークのMS（質量スペクトル）とペプチドシーケンス帰属例を示す。
