杜仲葉 杜仲葉 杜仲葉

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熊本大学学位学位学位論文学位論文論文論文

杜仲葉 杜仲葉 杜仲葉

杜仲葉の の の抗肥満作用 の 抗肥満作用 抗肥満作用 抗肥満作用と と と有効成分 と 有効成分 有効成分に 有効成分 に に に関 関 関 関する する する する研究 研究 研究 研究

２０１１ ２０１１ ２０１１ ２０１１ 平田 平田

平田 平田 哲也 哲也 哲也 哲也

Studies on anti-obesity effect and active compounds of Eucommia ulmoides leaves

Tetsuya Hirata

Studies on anti-obesity effect and active compounds of Eucommia ulmoides leaves

Tetsuya Hirata

Eucommia ulmoides Oliv. belongs to a single species and genus in the plant family Eucommiaceae. The bark has been used traditionally in analgesics, tonics and hypotensives in China. Moreover, the Chinese medical book “Bencao gangmu” describes fresh Eucommia leaf as “consumed as a vegetable.” The product “Tochu-cha” available on the Japanese market is the roasted Eucommia leaf, which has also been used in beverages containing geniposidic acid and asperuloside among the iridoid glucosides, and chlorogenic acid, a coffeic acid derivative, as major ingredients. From Eucommia leaf powder (ELE), eight iridoids were isolated, together with 14 known compounds. Spontaneously hypertensive rats (SHR) fed Eucommia leaf extract exhibited a dose-dependent anti-hypertensive effect. Moreover, follow-up studies have confirmed that Eucommia leaf extract decreases systolic blood pressure (SBP) in humans after long-term intake, and these anti-hypertensive effects are presumed to be due to the activity of geniposidic acid, a so-called Eucommia leaf glycoside. The extract from Eucommia leaves containing Eucommia leaf glycoside is used as the food supplement for the food for specified health uses (FOSHU).

Obesity, which can lead to metabolic syndrome, has recently gained attention as a factor that dramatically increases the risk of arteriosclerotic disease. According to Japanese diagnostic criteria, obesity and metabolic syndrome (MS) are considered conditions requiring prevention and/or treatment due to the high risk of complications, including hyperglycemia, hyperlipemia and hypertension, based on accumulation of visceral fat. In short, various beneficial and harmful adipocytokines excreted from visceral fat have been found to be involved in MS. In this paper, based on the hypothesis of mediation of anti-obesity effects of Eucommia leaves by decrease in amount of visceral fat induced by intake of Eucommia leaves and reanalysis of research data, use of Eucommia leaves for MS was planned. Initially, the anti-obesity effects of Eucommia materials with different procedures of processing were examined and their mechanisms of action were clarified. Next, the ingredients of Eucommia green leaf which exhibited strong effects were determined, and pharmacological studies were conducted to indentify active compounds, which led to interesting findings. The findings obtained are summarized below:

In the studies described in the 1^st chapter, the author used a MS-like rat model, produced by feeding a 35% high-fat diet (HFD), to examine potential anti-obesity and anti-metabolic syndrome effects and mechanisms of effects of chronic administration of ELE or Eucommia green leaf powder (EGLP). Eighty rats in ten groups were studied for 90 days. Both forms of Eucommia leaves minimized increases in body weight and visceral fat in dose-dependent fashion. Our results showed that ELE and EGLP have strong protective effects against the obesity caused by HFD, and also exert weak effects upon normal diet-fed rats.

Increases in plasma levels of triglyceride (TG) and free fatty acids (FFA) and insulin resistance secondary

levels and suppression of plasma resistin and TNF-α levels were confirmed. Real-time PCR studies showed that both forms of Eucommia leaf enhanced metabolic function in several organs, including diminution of ATP production (white adipose tissue), acceleration of β-oxidation (liver) and increase in the use of ketone bodies/glucose (skeletal muscle), all of which may exert anti-obesity effects under HFD conditions. These findings suggest that chronic administration of either form of Eucommia leaves stimulates the metabolic function of several organs in rats. The anti-obesity and anti-metabolic syndrome activity in this rat model may be maintained through secretion and regulation of adipocytokines that depend on the accumulation of visceral fat to improve insulin resistance or hyperlipemia.

In the studies described in the 2^nd chapter, detailed investigation of the constituents of EGLP led to the isolation of six iridoids (asperuloside, asperulosidic acid, scandoside 10-O-acetate, deacetyl asperulosidic acid, geniposidic acid, aucubin), five flavonoids (isoquercitrin, quercetin 3-O-sambubioside, rutin, astragalin, kaempferol 3-O-rutinoside) and chlorogenic acid. Three additional new iridoids were obtained, and 2 of them (eucomoside B and

eucomoside C) were isolated by condensation of geniposidic acid and amino acids (phenylalanine and tryptophan, respectively), while the

other (eucomoside A) was an acetal compound with a linkage from C-3 of the iridoid to C-2 of the glucose unit, each of which was the first natural compound.

In the studies described in the 3^rd chapter, the author examined the anti-obesity effects of EGLE divided into five fractions with high porous polystyrene gel, and of the compounds isolated, geniposidic acid, asperuloside and chlorogenic acid. A metabolic syndrome-like clinical model in mice was generated by feeding a 40% high-fat diet to examine the anti-obesity effects of chronic

administration of test substance. After 4 weeks, body weight, white adipose tissue weight, plasma triglyceride levels and total cholesterol levels in the model mice were significantly inhibited by the 30% MeOH fraction (which contained much higher levels of asperuloside than the other fractions), and these effects were similar to those

of EGLE. Chronic administration of isolated asperuloside in Eucommia leaves suppressed increases in model mouse body weight, WAT weight, plasma TG levels and FFA levels. Chronic administration of asperuloside enhanced the basal metabolic rate in rats fed a HFD and decreased respiratory quotients significantly more than in the HFD control group, suggesting acceleration of lipid metabolism.

Our animal studies, based on previous research on Eucommia leaf, clarified the anti-obesity effects of the Eucommia green leaf, and isolated asperuloside as the main active compound of the Eucommia green leaf. Our study is the first to indicate the anti-obesity effects of asperuloside as iridoids. Our study findings

O

OGlc H

H O

AcO

O

Asperuloside

論文要旨

杜仲葉の抗肥満作用と有効成分に関する研究 平田哲也

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）は中国中央部起源の 1 属 1 種の落葉性木本類で、樹高は 20 m に達 する中高木である。樹皮は生薬・杜仲で、中国最古の薬物書である「神農本草経」に、長く服用しても副 作用がなく長寿を助ける「上品」に分類・収載されている。また、数百年前に出版された「本草綱目」には、

高血圧症など具体的な疾患に対する有効性が記載されているほか、葉を「野菜として食する」とする記述 がある。一方、我が国では葉を焙煎により茶用として 1970 年代に発案された「杜仲茶」が、健康維持の目 的で幅広く飲用されている。近年、葉について成分探索の研究が進み、乾燥葉および焙煎葉など原葉の 成分検索が行われ、geniposidic acid を含む 8 種のイリドイド化合物のほか、14 種の化合物が得られてい る。さらに、薬理試験が進み、副交感神経を介した血圧降下作用が明らかとなり、geniposidic acid を主 成分とする杜仲葉配糖体飲料が、「血圧が高めの方に適した食品」の表示許可を得、特定保健用食品と して市販されるに至っている。一方、欧米型中心の食事と標準的な摂取カロリーを超える食生活の変化 に伴い、我が国ではメタボリックシンドローム（MS）が問題視されている。高血圧、脂質代謝異常、耐糖能 異常を伴う動脈硬化易発症病態を包括的に捉えた疾患観念である MS は、病態の基盤に内臓脂肪蓄 積が存在するとされている。すなわち、内臓脂肪より分泌される善悪の様々なアディポサイトカインが MS に関与することが解明されてきている。本論文では、杜仲葉の食経験と研究データの再解析から導き出さ れた内臓脂肪減少による抗肥満作用の仮説に基づき、杜仲葉の MS に対する保健用途への適合を計 画した。先ず、加工方法の異なる杜仲葉原料について、抗肥満作用に対する有効性の確認および作用 機序を明らかにし、次に、効果の高かった杜仲緑色葉の成分探索および有効成分を特定する薬理試験 を行い興味深い知見を得た。以下に得られた知見を概説する。

第 1 章では、先ず、加工方法の異なる杜仲葉の抗肥満試験を実施した。採取した生葉を乾燥・焙煎後 に熱水抽出処理した杜仲 葉エキス（ELE）および生 葉を乾燥処理 後に粉末 にした杜仲緑色葉粉末

（EGLP）を被験物質として、高脂肪食（HFD）および普通食（ND）に混餌し、それぞれを４週齢の SD 雄 性ラットに 90 日間の経口投与を実施した。その結果、HFD にELE および EGLP を混餌して摂取するこ とにより体重および白色脂肪組織（WAT）重量の増加を有意に抑制し、その効果はいずれも用量依存的 であった。一方、ND 混餌群ではこれらを抑制する効果がみられなかったことから、HFD が起因する肥満 に対して杜仲葉は、高い効果があることが示唆され、ND においては影響が少ないことが考えられた。

HFD の実験において、血中脂質は、いずれの被験物質でも中性脂肪（TG）濃度が減少した。血糖は、い ずれの投与群でグルコース値を正常値に維持しながらインスリン濃度の低下を示し、インスリン抵抗性の 改善が確認された。アディポサイトカインは、アディポネクチン濃度の上昇、ＴＮＦ-α およびレジスチンの 低下と、MS に関与する生理活性物質のバランスが整うことが示唆された。これらの抗肥満作用は、加工 方法の異なる被験物質に共通性があることから、どちらにも共通して含有する成分が関与していることが

の増減より、脂質、糖質の代謝メカニズムを予測した。ELE および EGLP を摂取することによって、肝臓 における β 酸化（carnitine palmitoyltransferase 1α、および2の mRNA 発現増加）の活性化が認められ た。また、その作用は ND および HFD いずれでも維持された。このことから、生成されたケトン体は骨 格筋で積極的に利用（succinyl-CoA synthetaseおよびperoxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase の mRNA 発現増加）されているとことが示唆された。また、骨格筋において糖を利用した TCA サイクル（isocitrate dehydrogenase 3 (NAD^＋) αおよびdihydrolipoamide succinyltransferase の mRNA 発現増加）と電子 伝達系（NADH dehydrogenase flavoprotein 1および 5： Comp. IおよびComp. Vの mRNA 発現増加）

の活 性化 を認 め、この作用 は EGLP では HFD 負 荷下 でも維 持された。腎 周囲 WAT に対する ELE および EGLP の効果は、被験食の脂質負荷状態によって異なり、HFD 条件下は WAT 細胞内に TG の貯蔵を増加させ、大きな脂肪細胞を形成させる。一方、ELE および EGLP は脂肪細胞での ATP 産生を低下（Comp. I、Vの mRNA 発現低下）させ、大きな脂肪細胞の形を維持するのに必要なATP不 足による脂肪細胞の崩壊を誘導していることが推測された。以上の結果、杜仲葉は全身レベルでの代謝 を活性化（肝臓や白色脂肪組織での脂質代謝の促進及び骨格筋での糖の利用促進）し、内臓脂肪の蓄 積抑制により、内臓脂肪を小型化させ肥満を改善していると推察された。

第２章では、抗肥満作用が確認された成分未検索の EGLP の分離精製を行い、6 種のイリドイド化合 物（asperuloside、asperulosidic acid、scandoside 10-O-acetate、deacetyl asperulosidic acid、geniposidic acid、aucubin）、5 種のフラボノイド化合物（isoquercitrin、quercetin 3-O-sambubioside、 rutin、 astragalin、

kaempferol 3-O-rutinoside）および chlorogenic acidを含む 12 種の既知化合物ならびに 3 種の新規イリド イドを得た。そのうち 2 種（eucomoside B、eucomoside C）は、イリドイドのカルボン酸とアミノ酸のアミノ基が 縮合した化合物、1 種（eucomoside A）

は、イリドイドの 3 位とグルコースの 2 位がアセタール結合を持つ、何れも天 然物最初の例である。

第３章では、EGLP を熱水抽出し、エキスを high porous polystyrene gel によるカラ ムクロマトにより５つに分画、各画分の抗肥満試験を実施した。その結果、30％ MeOH 画分に強い抗肥満効果が認められ、その効果は、エキスに類似していた。また、この画 分 の 主 要 物 質 は イ リ ド イ ド 化 合 物 asperuloside で あ っ た 。 次 に 、 単 離 精 製 さ れ た

asperuloside を HFD 負荷マウスに投与すると強い体重および内臓脂肪蓄積抑制効果

が確認された。さらに、asperuloside を HFD 負荷ラットに投与すると、基礎代謝量増加

および脂肪燃焼亢進が高められたことから、脂肪を積極的にエネルギーとして消費していることが示唆さ れた。

以上、これまでの杜仲研究の集大成として、杜仲緑色葉の抗肥満作用を動物実験で明らかにし、有効 成分として杜仲緑色葉の主要成分 asperuloside を同定した。本研究で asperuloside に抗肥満作用が 認められたことはイリドイド化合物として最初の例である。本研究の知見は、特定保健用食品として開発さ

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OGlc H

H O

AcO

O

Asperuloside

略語集 略語集略語集 略語集

本論文において次の略語を使用した。

ATP : adenosine 5’-triphosphate

ASP : asperuloside

BAT : brown adipose tissue testicular circumference

BMR : basal metabolic rate

C: M: W : CHCl

: MeOH: H

O

13

C-NMR : carbon-13 nuclear magnetic resonance Comp. I : NADH dehydrogenase flavoprotein 1

Comp. V : ATP synthase, H

transporting, mitochondrial F1 complex, delta subunit

Cpt1

: carnitine palmitoyltransferase 1

Cpt2 : carnitine palmitoyltransferase 2

Cs : citrate synthase

DMEM : Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose

DMSO : dimetyl sulfoxide

ELE : Eucommia leaf extract

EGLE : Eucommia green leaf extract

EGLP : Eucommia green leaf powder

FA : fatty acid

FATP : fatty acid transport protein

FFA : free fatty acid

Fig. : figure

Fr. : fraction

Gck : glucokinase

glc : glucose (glucopyranose)

GLUT4 : solute carrier family 2 member 4

HFD : high-fat diets

HFD-Cont. : high-fat diets control

HMBC : heteronuclear multiple bonds correlation HMQC : heteronuclear multiple quantum coherence

1

H-NMR : proton-1 nuclear magnetic resonance HPLC : high performance liquid chromatography

HR negative ESI-MS : high resolution negative electrospray ionization mass spectroscopy HR positive FAB-MS : high resolution positive ion fast atom bombardment mass spectrometry HR positive ESI-MS : high resolution positive electrospray ionization mass spectroscopy

HSL : hormone-sensitive lipase

ICR : Institute of Cancer Reseach

Idh3

: isocitrate dehydrogenase 3 (NAD

)

ND : normal diets

ND-Cont. : normal diets control

NOE : nuclear overhauser effect spectroscopy Ogdh : dihydrolipoamide succinyltransferase P3KCoT : peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase

Pk : pyruvate kinase

Positive ESI-MS : positive electrospray ionization mass spectroscopy

Positive FAB-MS : positive ion fast atom bombardment mass spectrometry PPAR

: peroxisome proliferator activator receptor

rha : rhamnose (rhamnopyranose)

RQ : respiratory quotients SBP : systolic blood pressure

SCoS : succinyl-CoA synthase

SE : standard error

SHR : spontaneously hypertensive rats

TG : triglyceride

TLC : thin-layer chromatography

TNF

: tumor necrosis factor

UCP : uncoupling protein (ATP synthase)

UV : ultra-vaiolet

WAT : white adipose tissue

WATr : white adipose tissue renal circumference WATt : white adipose tissue testicular circumference

xyl : xylose (xylopyranose)

本論文は、学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである。

1）

Studies on the chemical constituents of green leaves of Eucommia ulmoides Oliv.

Chika Takamura, Tetsuya Hirata, Yasuyo Yamaguchi, Masateru Ono, Hiroyuki Miyashita, Tsuyoshi Ikeda, Toshihiro Nohara

J. Nat. Med., 61 , 220–221 (2007).

2）

Iridoids from the Green Leaves of Eucommia ulmoides.

Chika Takamura, Tetsuya Hirata, Taro Ueda, Masateru Ono, Hiroyuki Miyashita, Tsuyoshi Ikeda, Toshihiro Nohara

J. Nat. Prod., 70 , 1312–1316 (2007).

3）

Chronic administration of Eucommia leaf stimulates metabolic function of rats across several organs.

Takahiko Fujikawa, Tetsuya Hirata, Atsunori Wada, Naomi Kawamura, Yasuyo Yamaguchi, Katsuyuki Fujimura, Taro Ueda, Yutaka Yurugi, Hideaki Soya, Sansei Nishibe

Br. J. Nutr., 104 , 1868–1877 (2010).

4）

Anti-obesity compounds in green leaves of Eucommia ulmoides.

Tetsuya Hirata, Takeo Kobayashi, Atsunori Wada, Taro Ueda, Takahiko Fujikawa,

Hiroyuki Miyashita, Tsuyoshi Ikeda, Sachiko Tsukamoto, Toshihiro Nohara

Bioorg. Med. Chem. Lett., 21 , 1786–1791 (2011).

目次目次 目次目次

序論序論序論

序論 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

1

本論 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

5

第 第

第 １１１章１章章章 杜仲葉杜仲葉杜仲葉杜仲葉 ののの抗肥満作用の抗肥満作用抗肥満作用 と抗肥満作用ととと機序機序機序機序 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

5

1-1

5

1-2 ELE

EGLP

6

1 -2 -1

6

1 -2 -2

6

1-2-3

7

1-2-4

7

1 -2 -5

8

1 -2 -6

8

1-2-6-1 ND-Cont.

HFD-Cont.

8

1-2-6-2

9

1-2-6-3 WAT

11

1-2-6-4

12

1-2-6-5

14

1-2-6-6

17

1-2-7

20

1-3 ELE

EGLP

22

1-3-1

23

1-3-2

23

1-3 -3

23

1-3-4

23

1-3-5

23

1-3-5-1

23

1-3-5-2 RNA

23

1-3-5-3

24

1-2-6-4 ∆∆Ct

24

1-3-6

24

1-3-7

26

1-3-7-1

26 1-3-7-2

29 1-3-7-3

29 1 -3 -7 -4 PPAR

2 9 1-3-7-5

30 1-3-8

30

1

34

第 第

第 ２２２章２章章 杜仲章 杜仲杜仲杜仲 緑色緑色緑色緑色 葉葉葉葉 のののの成分研究成分研究成分研究成分研究 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

36

2-1

36

2-2

37

2 -3

3 8

2-3 -1 EU-1

1

38

2-3 -2 EU-2

2

38

2-3 -3 EU-3

3

39

2-3 -4 EU-4

4

40

2-3 -5 EU-5

5

40

2-3 -6 EU-6

6

41

2-3 -7 EU-7

7

43

2-3 -8 EU-8

8

43

2-3 -9 EU-9

9

44

2-3 -10 EU-10

1 0

45

2-3 -11 EU-11

11

4 6

2-3 -12 EU-12

1 2

48

2 -4

4 8

2-4 -1 EU-1 3

13

48

2-4 -2 EU-1 4

14

50

2-4 -3 EU-1 5

15

54

2 -5

6 0

2-5-1

60

2-5-2 3D HPLC

61

第第

第第 ３３３３章章章章 杜仲葉杜仲葉杜仲葉 の杜仲葉ののの抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用抗肥満作用 ににに関与に関与関与 する関与するするする成分成分成分成分 ののの特定の特定特定特定 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

63 3 - 1

6 3 3-1-1

64 3-1-2

64 3 - 1 -3

6 4 3-1 -4

64 3-1 -5

65 3-1-6

65 3-1-7

6 5 3 - 2

7 0 3-2-1

70 3-2-2

70 3-2 -3

70 3-2 -4

71 3-2-5

71 3-2-6

7 1 3-3

75 3-3-1

75 3-3-2

75 3-3 -3

75 3-3 -4

76 3 -3 -5

76 3-3-6

7 6

78

総括総括

総括 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

79

実験実験

実験 のののの部部部 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 部

83

引 用 文 献引 用 文 献

引 用 文 献 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

99

謝辞謝辞

謝辞 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

103

序論序論 序論序論

杜仲

( Eucommia ulmoides Oliv.)

1

本類で ¹⁾、樹高は

20m

あり、花 被 が風 媒 受 精 のため存 在 せず、花 糸 、葯 および子 房 が側 枝 の腕 芽 部 分 より 新 芽と同 時 に直 接 分 化 する。種子は受 精 後、子 房 部 位 が成 長 し、風 による飛 散 のた め遡 果 となっている。杜 仲 は被 子 植 物 の中 では比 較 的 初 期 に発 生 したと考 えられて おり、各国の化石の発掘から鮮新世の初期 には世界中にトチュウ属が存在していたと 推定されている ¹⁾。現存種のみに衰退したのは、度重なる氷河期が原因と考えられて おり、メタセコイアなどと同じく中国中央部に残存したものと考えられている ²⁾。

杜仲樹皮 の薬用 ・食 用経験 は、中国 をたどると約

2000

(

(Fig. 1)。

我 が国 における杜 仲 の伝 来 は、遣 唐 使 の取 り扱 った木 簡 に記 述 が見 られることや 正倉 院の薬 物保 管庫 から杜仲 が発 見 されていることから、この時代 に伝わったと考え られている ²⁾。現在、我が国における杜仲の利用は、その利用部位により大きく分けて 樹皮と葉に大別 される。無承認医薬品の「

1-a」に収載 される樹皮は、江戸時代からつ

1970

杜仲の含有成分に関 する研究は、樹皮について出山 ³⁾によって同定され、リグナン 配糖体やイリドイド配糖体の存在が証明されている。一方、葉については

Bianco

の

eucommiol

フェノール類を、野原 ら ⁸⁾のグループは

geniposidic acid、中村ら

杜仲の薬 理研 究 は、樹皮に滋 養強 壮 、血 圧降 下、更 年期 障害 などの薬理効 果 が 見出されている。近年 、葉の薬理研究が進み、血圧降下 ¹¹⁾、利尿促進、抗ストレス作 用 ¹²⁾、抗高脂血作用 13,14,15,16）など有効性が示されてきた。特に、血圧降下について はヒト臨床試験 により有効性 の確認 がなされ、さらに作用機序 が明らかとなり、杜仲葉 配糖体が有効成 分 として特定 されてきている ¹⁷⁾。この杜仲葉 の血圧降下 に関 して特 筆 すべき点 は、ヒト試 験 において正 常 高 値 血 圧 者 および軽 症 高 血 圧 者 で顕 著 な降 圧作用 ¹⁸⁾を示すのに対して、正常血圧者で変化がみられない ^18,19)、いわゆる血圧調 整機能である。これらの特徴は「食の第三次機能」で定義される「生体調節」を保健機 能として世 界 で始 めて導 入 がなされた「特 定 保 健 用 食品 制 度」の概 念 に適 し、「血 圧 が高 めの方 に適した食 品 」として杜 仲 葉 配 糖 体 含 有 食 品 が厚 生 省

(現 在 、表 示 許 可

)より最初に表示許可された食品となった (Fig. 2)。

さて、我が国の死因の第一位を占める心血管疾患(心筋梗塞、脳梗塞 など

)の主要

(生 活 習 慣 の乱 れからインスリン抵 抗 性 、そして心

)を総合的に簡便 に把握 する概念として「メタボリックドミノ」が提唱

のリスクが高 くなることを示した概 念 であるとも言える。これらのことからも、その上 流 に 位置する『生活習慣 の乱れ』による肥満症の発症前後 レベルでの予防及び治療の重 要性が示唆されている。2005 年

4

8

16

940

予備群者数が約

1,020

1,960

20

40

74

2

1

5

筆 者 は、杜 仲 葉 の食 経 験 と研 究 データの再 解 析 から導 き出 された内 臓 脂 肪 減 少 による抗肥満作用の仮説に基づき、杜仲葉 のメタボリックシンドロームに対する保健用 途 への適 合 を計 画 した。本 研 究 は、加 工 方 法 の異 なる杜 仲 葉 原 料 について抗 肥 満 作 用 に対 する有 効 性 の確 認 および機 序 を明 らかにするとともに、杜 仲 緑 色 葉 粉 末 の 成分探索および関与成分を特定する薬理試験を行った。

Tea (leaves) Beverages

Food for specified health uses (FOSHU

Dietary Supplement

Fig. 1. Eucommia ulmoides Oliv . Tree

Cortex (market of naturalmedicine)

Garden tree (health uses)

本論本論 本論本論

第 第第

第 １１１１ 章章章章 杜仲葉杜仲葉杜仲葉 の杜仲葉のの 抗肥満作用の抗肥満作用抗肥満作用 と抗肥満作用ととと 機序機序機序機序 についてについてについて について

11 1

1- -- -1 11 1 こ れ ま で の こ れ ま で の こ れ ま で の こ れ ま で の 杜 仲 葉 有 効 性 研 究 経 過 杜 仲 葉 有 効 性 研 究 経 過 杜 仲 葉 有 効 性 研 究 経 過 杜 仲 葉 有 効 性 研 究 経 過

我 が国 の死 因 の第 1 位 を占 める心 血 管 疾 患

(心 筋 梗 塞 、脳 梗 塞 など)の主 要 な原

杜 仲 葉 のメタボリックシンドロームに関 する有 効 性 研 究 は、

1970

(systolic

blood pressure: SBP)の低 下 を誘 発 することを確 認 している。これらの抗 高 血 圧 作 用

Metori

(3 g

6 g /kg-体 重 /

)を与 えた 12%

(white adipose tissue: WAT)重 量 の減 少 を認 め

(15.5 mg/日 )を与 えたハムスターにおいて脂

C57BL/KsJ-db/db

11 1

1- -- -2 22 2 ELE 、 、 、 、 ELP および および および および EGLP の の長 期 投 与 の の 長 期 投 与 長 期 投 与 による 長 期 投 与 による による抗 肥 満 作 用 試 験 による 抗 肥 満 作 用 試 験 抗 肥 満 作 用 試 験 抗 肥 満 作 用 試 験

杜 仲 葉 は、我 が国 では焙 煎 品 が「杜 仲 茶 」として発 案 され、茶 葉 を煮 出 して飲 用 されている。一 方 、中 国 では 生 葉 を 食 用 としていた背 景 がある。本 試 験 では 、杜 仲 葉 の抗 肥 満 作 用 に着 目 し、加 工 方 法 が異 なる杜 仲 葉 の影 響 について検 討 した。す な わ ち 、 採 取 し た 生 葉 を 乾 燥 ・ 焙 煎 後 に 熱 水 抽 出 処 理 し た 杜 仲 葉 エ キ ス

(Eucommia leaf extract： ELE)

(Eucommia green leaf powder： EGLP)を被 験 物 質 として高 脂 肪 食 (high-fat diets： HFD)および普 通 食 (normal diets： ND)に混 餌 し、それぞれを４週 齢 の SD

90

WAT

(triglyceride

(free fatty acid： FFA)を測 定 した。また、アディポサイトカインとして、アディポ

11 1

1- -- -2 22 2- -- -1 11 1 試 料 調 製 試 料 調 製 試 料 調 製 試 料 調 製

中 国 四 川 省 産 の 杜 仲

(Eucommia ulmoides Oliv.)

ELE

100～110℃で蒸 熱 処 理 し、熱 風 により水 分 量 を 10%以 下

130℃で 20～ 30

2 t

90 ℃の熱 水 10 t

18%)。EGLP

100

10%以 下 に乾 燥 後 、粉 砕 して緑 色 の粉 末 を得 た。

11 1

1- -- -2 22 2- -- -2 22 2 投 与 量 投 与 量 投 与 量 投 与 量

飼 料 の組 成 を

Table 1

(オリエンタル酵 母 )を基 本

5%

ND(ND-Control： ND-Cont.)

30%

Experimental group Based diet (Fat) EGLP

ND-Cont. MF (5%)

ND-ELE

ND-3% ELE MF (5%)

ND-9% ELE MF (5%)

ND-EGLP

ND-3% EGLP MF (5%) 3%

ND-9% EGLP MF (5%) 9%

HFD-Cont. MF (35%)

HFD-ELE

HFD-3% ELE MF (35%) HFD-9% ELE MF (35%) HFD-EGLP

HFD-3% EGLP MF (35%) 3%

HFD-9% EGLP MF (35%) 9%

(% of content) 9%

ELE

3%

9%

3%

HFD(HFD-Control

ELE

EGLP

3%あるいは 9%混 餌 して作 製

2-6 g/kg/day)

11 1

1- -- -2 22 2- -- -3 33 3 実 験 動 物 実 験 動 物 実 験 動 物 お よ び 実 験 動 物 お よ び お よ び お よ び 飼 育 方 法 飼 育 方 法 飼 育 方 法 飼 育 方 法

実 験 動 物 として４週 齢 の雄 性

SD

SLC

)を使 用 した。飼 育 は全

23-26℃、湿 度 50-65%、明 暗 周 期 12

(午 前 8

8

)

2

1 11

1- -- -2 22 2- -- -4 44 4 経 口 投 与 法 経 口 投 与 法 経 口 投 与 法 お よ び 経 口 投 与 法 お よ び お よ び 測 定 方 法 お よ び 測 定 方 法 測 定 方 法 測 定 方 法

予 備 飼 育 終 了 後 、体 重 を指 標 に各 群

8

90

90

WAT

(

)および精 巣 周 囲 (

Table 1. Composition of the diet.

adipose tissue epididymal： WATe

)を摘 出 して重 量 を測 定 するとともに、血 液 サンプルを

(3,000 rpm

15 min.)

-80

TG

FFA

TG

FFA

E-テストワコー(和 光 純

)

(森 永 乳 業 )

ELISA

)、血 中 TNF-

TNF-

)、血 中 レジスチンはレジスチン ELISA

ELISA

(LIC)を用 いて、ELISA

7180

(日 立 製 作 所 製 )を用 いて測 定 した。

本 実 験 全 ての事 項 について、「実 験 動 物 の飼 養 および保 管 ならびに苦 痛 軽 減 に 関 する基 準

(環 境 省 )」および「動 物 実 験 の適 正 な実 施 に向 けたガイドライン (日 本 学

)」を遵 守 したうえで行 った。

1 11

1- -- -2 22 2- -- -5 55 5 統 計 処 理 統 計 処 理 統 計 処 理 統 計 処 理

すべてのデータは平 均 値 ±標 準 誤 差

(SE)で表 した。統 計 処 理 は対 応 のない t-検

Tukey

5%

11 1

1- -- -2 22 2- -- -6 66 6 結 果 結 果 結 果 結 果 11 1

1- -- -2 22 2- -- -6 66 6- -- -1 11 1 ND-Cont. 群 群 群 群 お よ び お よ び お よ び お よ び HFD-Cont. 群 間 群 間 群 間 群 間 の の の 比 較 の 比 較 比 較 比 較

Table 2

ND-Cont.群 および HFD-Cont.群 間 の体 重 、WAT

ND

ND-Cont.群 および HFD

HFD-Cont.

Fainal body weight (g/rat) 482.8 ± 17.9 548.6 ± 16.8 **

Food intake (g/day/rat) 38.3 ± 3.6 25.3 ± 3.0 * Weight of WAT (g/rat)

Perirenal 3.2 ± 0.3 9.9 ± 0.8 ***

Epididymal 5.3 ± 0.3 18.3 ± 0.7 ***

Glucose (mg/L) 1398.0 ± 42.0 1520.0 ± 57.0

Insulin (ng/mL) 2.9 ± 0.4 6.6 ± 0.5 ***

TG (mg/L) 1076.0 ± 132.0 2100.0 ± 532.0

Free fatty acid (µEq/L) 561.4 ± 44.7 610.4 ± 78.8 Total cholesterol (mg/L) 907.0 ± 36.0 780.0 ± 27.0 *

Adiponectin (µg/L) 39.0 ± 6.0 27.0 ± 3.0

TNF-α (pg/mL) 376.5 ± 45.8 178.5 ± 22.6 **

Resistin (ng/mL) 136.3 ± 12.1 187.6 ± 15.9 *

Leptin (ng/mL) 4.2 ± 0.8 6.8 ± 0.4 **

ND-Cont. HFD-Cont.

Item

群 を比 較 すると、90 日 間

HFD

また、

WAT

(WATp

WATe)は有 意 に増 加 した(それぞれ p<0.001)。血 液

ND-Cont.群 と比 較 すると、HFD-Cont.

(血 中 インスリン： p<0.001

p<0.05)。血 中 TG

FFA

ND-Cont.群 と比 較 すると、 HFD-Cont.群

TNF-

(

TNF-

p<0.01

p<0.05

p<0.01)

HFD

1 11

1- -- -2 22 2- -- -6 66 6- -- -2 22 2 体 重 体 重 体 重 体 重

ELE

EGLP

3%

9%

ND

Table 2. Comparison between ND-Cont. and HFD-Cont.

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from

ND-Cont., *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student's t-test).

Fig. 3. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on body weight in ND or HFD-fed rats. Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from ND or HFD, *

<0.05 (

). Significantly different from HFD-3%

EGLP,

).

Time (days) 0

100 200 300 400 500 600 700

0 30 60 90

(C)

HFD-Cont.

HFD-3% ELE HFD-9% ELE

*

*

*

*

*

*

Body weight (g)

0

Time (days) 0

100 200 300 400 500 600 700

0 30 60 90

(A)

ND-Cont.

ND-3% ELE ND-9% ELE

Body weight (g)

0

Time (days) 0

100 200 300 400 500 600 700

0 30 60 90

(B) ND-Cont.

ND-3% EGLP ND-9% EGLP

Body weight (g)

0

Time (days) 0

100 200 300 400 500 600 700

0 30 60 90

(D) HFD-Cont.

HFD-3% EGLP HFD-9% EGLP

*

*

*

*

*

*

#

Body weight (g)

0

(ND-3%ELE

群 と比 較 して観 察 期 間 中 の体 重 に有 意 な差 は認 められなかった

(Fig. 3 A、B)。

Table 3. Effects of 90-day administration of ELE and EGLP on WATp and WATe weghit in ND-fed rats.

Each value represent the mean ± SE (n=8). Significantly different from ND, not significantly different (

).

Experimental group

ND-Cont. 3.2 ± 0.3 5.3 ± 0.3

ND-ELE

ND-3% ELE 2.6 ± 0.3 4.7 ± 0.4

ND-9% ELE 2.3 ± 0.3 4.3 ± 0.3

ND-EGLP

ND-3% EGLP 2.7 ± 0.3 4.8 ± 0.3

ND-9% EGLP 2.3 ± 0.3 4.3 ± 0.3

WATp (g) WATe (g)

ELE

EGLP

3%

9%

HFD

(HFD-3%ELE

HFD-9%ELE

HFD-3%EGLP

HFD-9%EGLP)

HFD-Cont.

30

90

p<0.05、Fig. 3 C、D)。さらに HFD-9%EGLP

HFD-3%EGLP

60

90

Fig. 3 D)。自 発 行 動 量 および異 常 行 動 に著 しいものは認 められなかった。

11 1

1- -- -2 22 2- -- -6 66 6- -- -3 33 3 WAT 重 量 重 量 重 量 重 量

ND-3%ELE

ND-9%ELE

90

WATp

WATe

WAT

(Table 3)

ND-9%EGLP

90

WATp

WATe

WAT

一 方 、HFD-3%ELE 群 および

HFD-9%ELE

90