Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法によるメタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子の迅速・簡易検出の検討

(1)

Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法によるメタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子の迅速・簡易検出の検討

1）栄研化学株式会社生物化学研究所，^2）国立感染症研究所細菌第二部

小島禎

^１）

柴田尚宏

^２）

池戸正成

^１）

荒川宜親

^２）

（平成 17 年 12 月 27 日受付）

（平成 18 年 3 月 24 日受理）

Key words : Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), metallo-β-lactamase, rapid diagnosis

要旨

Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法は，特定の遺伝子を簡易・迅速に検出する新しい方法として注目されている．今回，IMP-1 型及び VIM-2 型メタロ-β-ラクタマーゼ（MBL）遺伝子保有株を対象に，各々の MBL 型特異的プライマーを作成し LAMP 法にて，遺伝子型別を行い，同時に特異性，感度に関する検討を行った．さらに蛍光目視検出に関する検討も行った．LAMP 法は，63℃ 恒温下で 1 時間以内に遺伝子増幅が確認できた．特異性試験のために，MBL 産生株を LAMP 法及び PCR 法で測定したところ，全例で遺伝子型が一致した．LAMP 法の最小検出感度は，リアルタイム濁度測定装置を用いた場合，IMP- 1型 MBL 産生株で 30cfu! test，VIM-2 型 MBL 産生株で 3cfu! testであった．さらに，蛍光目視検出でも陰性検体を明瞭に区別でき，同一の検出感度を示した．これらの成績から，LAMP 法を用いることにより MBL 産生菌の遺伝子型の判定が特別な装置を用いず迅速・簡易に行える事が確認された．

〔感染症誌 80：405〜412，2006〕

序文

近年，日本国内でのカルバペネムなどの広域 β ラクタム剤を分解する IMP-1 型メタロ-β-ラクタマーゼ産生性のグラム陰性菌間で高い分離頻度であるが，イタリア，フランス，韓国などで報告の多い VIM-2 型メタロ- β -ラクタマーゼ産生菌も我が国で検出の報告がなされている

^１）^２）

．メタロ-β-ラクタマーゼは，活性中心に亜鉛を持ち，この亜鉛原子に結合した活性状態の水分子が β-ラクタム環を加水分解する

^３）

ことによって，ESBLs や AmpC 型セファロスポリナーゼには安定なセファマイシンやカルバペネムなども分解・不活化できる

^４）

．また，メタロ-β-ラクタマーゼは，染色体性の L1，GOB-1，IND-1 型メタロ-β-ラクタマーゼなどとプラスミド性の IMP-型や VIM-型が知られてい

る

^{５）〜７）}

．なかでも医療施設では，種間を越えて伝達す

る恐れがあるプラスミド媒介性メタロ-β-ラクタマーゼを監視する必要がある

^８）

．メタロ-β-ラクタマーゼ産

生菌を検出する方法として，メタロ- β -ラクタマーゼ活性を抑制する試薬を利用したディスク拡散法

^{９）〜１１）}

があるが，β-ラクタマーゼ活性を測定するので，メタロ- β-ラクタマーゼが染色体性か，あるいは，IMP-型なのか VIM-型なのかなどを鑑別できない．プラスミド性メタロ- β -ラクタマーゼを鑑別するためにメタロ- β -ラクタマーゼを対象とした PCR 法

^１２）

が用いられているが，PCR 装置と電気泳動装置が必要であり，また，

その操作法にある程度熟練を要し，さらに検査コストなどの理由で，未だ医療現場へ普及するにいたっていない．

Notomi et al. は，迅速かつ特異性が高く，特殊な装置が不要で，簡便，迅速に遺伝子の増幅と検出を可能とする LAMP 法を確立した

^１３）

が，その特徴は，標的遺伝子の 6 つの領域に対して 4 種類のプライマーを設定し，サンプルとなる遺伝子，鎖置換型 DNA 合成酵素，基質等を混合し，一定温度（65℃ 付近）で保温することによって反応が進み，検出までの工程を 1 ステップで行うことである

^１４）

．さらに，遺伝子増幅過程でピロリン酸マグネシウムが析出するまで生成される

原著

別刷請求先：（〒329―0114）栃木県下都賀郡野木町大字野木 143

栄研化学（株）生物化学研究所小島禎

(2)

Fig. 1 Primer sequences for LAMP ofblaIMP-1

ので，その濁りを目視で判定が可能である

^１５）

．現在，

LAMP 法は，このような特徴があることから，畜産

^１６）

，漁業

^１７）

，環境

^１８）

，臨床

^１９）^２０）

など多分野で応用されている．

そこで，今回我々は，LAMP 法によりメタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子を検出する方法を確立し，その感度・特異性に関し検討を行ったので報告する．

材料と方法

1．試験菌株

1）特異性試験

試験菌株は，sodium mercaptoacetate（SMA）法

^２１）

でメタロ-β-ラクタマーゼ産生を疑われたカルバペネム耐性グラム陰性桿菌を対象とした．菌種としては，

Pseudomonas aeruginosa ，Pseudomonas putida ，Acine- tobacter baumannii ， Alcaligenes xylosoxidans ， Enterobac- ter cloacae ， Proteus mirabilis の 6 菌種 71 株を用いた．

遺伝子増幅試験に際しては，プラスミドの脱落を防ぐために，菌接種した平板培地に CAZ（ceftazidime）

ディスクを置き，その周辺に発育したコロニーを精製水に McFarland No.1（約 2.4×10

⁸

cfu! mL）となるように懸濁した．さらに，TE 緩衝液（10mM Tris-HCl，

1 mM EDTA，pH8.0）で希釈し，100℃10 分間熱処理し，急冷後，13,000rpm 5 分間遠心し，その上清をサンプルとした．

2）感度試験

IMP-1 型検出用 LAMP 及び VIM-2 型検出用 LAMP については，それぞれ国立感染症研究所保存株 Klebsiella pneumoniae MKD115，P. aeruginosa NCB 326 を対象として，感度試験を行った．特異性試験と同様に培養し，McFarland No.1 となるように懸濁した．この菌懸濁液を TE 緩衝液で 10 倍段階希釈し，

その各段階の希釈液を 100℃10 分間熱処理し，急冷後，13,000rpm 5 分間遠心し，その上清をサンプルとした．

2．プライマー設計

(3)

Table 1 Components ofreaction mixture for LAMP 2X Reaction Mix

mM 40 Tris-HCL（pH8.8）

mM 20 KCl

mM 16 MgSO4

mM 20

（NH4）2SO4

% 0.2 Tween 20

M 1.6 Betain

mM each 2.8 dNTPs

μL 12.5 2X Reaction Mix

2.0 μL pmol

40 Forward inner primer

pmol 40 Backward inner primer

pmol 5 Forward outer primer

pmol 5 Backward outer primer

pmol 20 Loop primer-F

pmol 20 Loop primer-B

μL 7.5 Distilled Water

μL 1.0 BstDNA Polymerase

μL 2.0 Sample

μL 25.0 Total

券献献犬献献鹸

Fig. 2 Primer sequences for LAMP ofblaVIM-2

対象とした遺伝子型は，過去に我々が報告した調査結果

^２）

から，国内において分離頻度の高い IMP-1 型及び VIM-2 型とし，それぞれの遺伝子配列については，

bla

IMP-1

は GenBank accession No. S71932， bla

VIM-2

は GenBank accession No.AY204637 を使用した．

LAMP プライマーは，bla

IMP-1

は下流領域，bla

VIM-2

は

上流領域の 250bp 前後の長さで，基本プライマーであるインナープライマー及びアウタープライマー，並びに増幅を速める効果のあるループプライマーを設計した（Fig. 1，2）．

3．LAMP 測定

LAMP 反応は，反応基質の dNTPs と硫酸マグネシウム及び pH 緩衝剤を処方した Reaction Mix に各 LAMP プライマーと鎖置換型の Bst DNA Polym- erase を含む反応溶液にサンプルを添加し（Ta- ble 1），生成したピロリン酸マグネシウムの白濁を 650 nm 発光ダイオード光源の透過光をフォトダイオードによって検出するリアルタイム濁度測定装置 LA-200

（テラメックス社）を用いて 63℃ で 60 分間行った．

4．PCR 測定

Shibata らの PCR 法

^２）

に従って，操作した．bla

IMP-1

プライマーは，F1（5ʼ-ACC GCA GCA GAG TCT TTG CC-3ʼ）及び R1（5ʼ-ACA ACC AGT TTT GCC TTA CC-3ʼ）を用いて，587bp の増幅産物を確認した．さらに，bla

VIM-2

プライマーは，F4（5ʼ-ATG TTC AAA CTT TTG AGT AAG-3ʼ）及び R4（5ʼ-CTA CTC AAC GAC TGA GCG-3ʼ）を用いて，801bp の増幅産物を確認した．PCR は，TaKaRa Taq polymerase を用いて，

サーマルサイクル条件（1）denature 94℃2 分間，（2）

(4)

Fig. 3 Detection sensitivity ofLAMP for metallo-β-lactamase genes Table 2 LAMP and PCR typing ofgenomic determinants for metallo-β-lactamase

LAMP SMA PCR

Bacterialstrains

VIM-2 IMP-1

18 20

38 Pseudomonas aeruginosa

5 7

12 Pseudomonas putida

0 13

13 Acinetobacter baumannii

0 3

3 Alcaligenes xylosoxidans

0 4

4 Enterobacter cloacae

0 1

1 Proteus mirabilis

23 48

71

denature 94℃1 分間，annealing 55℃1 分間，extension 72℃1 分 30 秒（30 サイクル），（3）extension 72℃5 分間，（4）4℃ で反応させた．PCR 反応後，0.5％アガロースにて，電気泳動を行い，PCR 産物の有無とサイズを確認した．

5．蛍光目視検出法の検討

Loopamp 蛍光・目視検出試薬（栄研化学）の主成分であるカルセインは，マンガンイオンと結合し消光

しているが，LAMP 増幅時に生成されたピロリン酸イオンにマンガンイオンを奪われると蛍光を発する

^２２）

．この蛍光目視検出試薬を LAMP 反応用の試薬に 1.0µL を追加し，目視判定用の反応試薬とした．材料と方法 3．LAMP 測定と同一操作を行った後に，

チューブに紫外線ランプ（365nm）を照射して，蛍光

発光の有無を観察した．

(5)

Fig. 4 Detection sensitivity ofLAMP for metallo-β-lactamase genes

成績

1．特異性試験

ディスク拡散法でメタロ-β-ラクタマーゼ産生が確認された 71 菌株を用いて LAMP 法及び PCR 法の判定を比較したところ，LAMP 法及び PCR 法ともに，

IMP-1 型 48 株，VIM-2 型 23 株であり，その成績は完全に一致した（Table 2）．さらに，ディスク拡散法でメタロ-β-ラクタマーゼ非産生株と判定した 23 株を LAMP 法及び PCR 法に供試したところ，いずれも陰性であった．

2．感度試験

IMP-1 型メタロ-β-ラクタマーゼ産生株 K. pneumo- niae MKD115 を IMP-1 型検出用 LAMP で測定したところ．30cfu! testまで LAMP 増幅が認められた．

同様に，VIM-2 型メタロ- β -ラクタマーゼ産生株 P.

aeruginosa NCB326 を VIM-2 型検出用 LAMP で測定したところ，3cfu! testまで LAMP 増幅が認められた

（Fig. 3）．

3．蛍光目視検出法の検討

感度試験と同一サンプルを蛍光目視検出法での判定を行ったところ，IMP-1 型保有株で 30cfu! test，VIM- 2 型保有株で 3cfu! testまでのメタロ-β-ラクタマーゼにおいて明瞭な蛍光が認められ，0 cfu! test と明確に区別することができ，濁度測定法と同一の成績を示した（Fig. 4）．

考察

カルバペネム系抗菌薬に耐性を示すメタロ- β -ラクタマーゼ産生菌は，院内感染の対策する上で監視する必要がある．1994 年に Osano ら

^６）

は，IMP-1 型メタロ- β-ラクタマーゼを産生する IPM 耐性 S. marcescens の臨床分離株をはじめて報告した．日本国内では，IMP- 1 型メタロ-β-ラクタマーゼの bla

^IMP-1

遺伝子を持つ臨床分離株がほとんどである

^１）

．さらに，1999 年に Lauretti ら

^７）

が，VIM-1 型メタロ-β-ラクタマーゼを産生するカルバペネム耐性 P. aeruginosa の臨床分離株を報告した． bla

^VIM

遺伝子は，当初ヨーロッパでの報告が多かったが，日本でも bla

^VIM-2

遺伝子を持つ P. aeruginosa 臨床分離株を Arakawa ら

^２３）

が報告した．また，Shibataら

^２）

の 2001 年から 2002 年において，国立感染症研究所に提出されたメタロ- β -ラクタマーゼ産生菌の中で bla

^IMP-1

遺伝子は 83％，bla

VIM-2

遺伝子は 15％であり，圧倒的

に bla

IMP-1

遺伝子の検出頻度が高い．bla

VIM-2

遺伝子は国

内での報告がある

^{２４）〜２６）}

が，両遺伝子のアミノ酸相同性は 31％である

^７）

ため，両者は別グループとして監視が必要と考えられる．

メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌の検出は，メタロ-β-

ラクタマーゼを阻害するメルカプト酢酸や EDTA を

含有したディスクと CAZ ディスクを組み合わせた

ディスク拡散法，抗菌薬とメルカプト酢酸を組み合わ

せた microdilution 法やメタロ-β-ラクタマーゼに反応

(6)

する発色基質とキレート剤を組み合わせたテストストリップ法がある．特異性に優れ，簡易なメルカプト酢酸と CAZ を組み合わせたディスク拡散法は国内の臨床現場で広く利用されている．これらの方法は，bla 遺伝子の phenotype を確認できるが，遺伝子型を識別するには，PCR による遺伝子増幅法が用いられている．しかし，PCR は，高価なサーマルサイクラーを必要とし，さらに数時間の増幅サイクルの終了後に，電気泳動を行う必要がある．新たな遺伝子増幅技術の一つである isothermal and chimeric primer- initiated amplification of nucleic acids（ICAN）法を応用した IMP-1 型メタロ-β-ラクタマーゼ検出法が報告されている

^２７）

．この方法は DNA と RNA のキメラプライマーを用いて，等温で遺伝子増幅が可能であるが，特異遺伝子検出がテストストリップによる 2 ステップのハイブリダイゼーションであり，PCR より簡便ではあるものの，かなり手間を要するのも事実である．

一方，LAMP 法は，6 領域のプライマーを設定し，

迅速且つ特異性が高い方法であり，さらに，遺伝子増幅効率が高いために生成副産物であるピロリン酸塩が，液中のマグネシウムイオンを結合，析出し，遺伝子増幅を肉眼で鑑別することを 1 ステップで行うことができた．

今回，我々は bla

^IMP-1

及び bla

^VIM-2

遺伝子に特異的な LAMP プライマーを設計する上で，両遺伝子はホモロジーが低いことから，両遺伝子を個別に検出することが可能と判断した．また，メタロ-β-ラクタマーゼ産生株の出現を早期に発見し，さらにそれらによる院内感染発生時の疫学調査及びその後の経緯の監視のために大きく貢献するものと考え，研究を実施した．

今回，特異性試験において，対照としたディスク拡散法および PCR の成績が一致し，CAZ やカルバペネム系抗菌薬に耐性を示した菌株の発育コロニーから LAMP 法により bla

^IMP-1

及び bla

^VIM-2

遺伝子を検出・識別するが十分可能で実用的であることが確認された．

さらに，蛍光目視検出試薬の添加によって，63℃ を維持できる加熱装置だけで検出が可能であることも確認されたことから，サーマルサイクラーなどの特殊な装置が設置されていない一般の検査室でも，メタロ-β- ラクタマーゼの遺伝子の検出と識別を簡便に実施することが可能となった．高度医療が進みつつある現在，

LAMP 法によりメタロ- β -ラクタマーゼ産生菌の検出と識別が簡便に実施可能となったことにより，本試験法は，今後，実効ある院内感染対策の推進や適正な抗菌薬の選択において重要な情報を提供する，非常に有用な試験法の 1 つとして普及するであろうことが期待される．

検出感度試験成績をみると IMP-1 型産生菌株30cfu!

test,VIM-2 型産生菌株 3cfu ! testであった．この成績から，検体（2µL）中に 1.5×10

³

cfu! mLから 1.5×10

⁴

cfu

! mLの産生菌株が存在すれば bla 遺伝子を検出することが可能であると考えられた．メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌が分離される検体は，尿検体や痰検体であり，多くがカテーテルを施行している．カテーテル装着の場合，その接合部に菌が clonization を起こした場合，その菌数は多く，さらに，細菌尿は 10

⁴

cfu! mL 以上の濃度と考えられるので，LAMP によって直接検体から bla 遺伝子を検出することが可能と考えられる．したがって，次のステップとして，臨床検体から直接的にメタロ-β-ラクタマーゼの遺伝子を検出・識別可能な試験・検査法の条件等を検討する予定である．

文献

1）Nishio H, Komatsu M, Shibata N, Shimakawa K, Soeyoshi N, Ura T,

et al.：Metallo-

β-lactamse-producing gram-negative Bacilli：laboratory-based surveillance in cooperation with 13 laboratory in the Kinki region of Japan. J Clin Microbiol 2004；42：5256―63.

2）Shibata N, Doi Y, Yamane K, Yagi T, Kurokawa H, Shibayama K,

et al.：PCR typing of genetic

determinants for metallo-beta-lactamases and in- tegrases carried by gram-negative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron. J Clin Microbiol 2003；41：5407―13.

3）Sabath LD, Abraham EP：Zinc as a cofactor for cephalosporinase from

Bacillus cereus

569. Bio- chem J 1966；98：11C―3C.

4）Bush K：Metallo-β-lactamase：A class apart.

Clin Infect Dis 1998；27（Suppl 1）: S48―53.

5）荒川宜親：広域β-ラクタム薬耐性に関与するβ- ラクタマーゼの特徴と遺伝子的相関．日本臨床微生物学雑誌 2003；13：150―60.

6）Osano E, Arakawa Y, Wacharotayankun R, Ohta T, Horii T, Ito H,

et al.：Molecular charac-

terization of an enterobacterial metallo-β- lactamase found in a clinical isolate of

Serratia marcescens

that shows imipenem resistance. An- timicrob Agents Chemother 1994；38：71―8.

7）Lauretti L, Riccio ML, Mazzariol A, Cornaglia G, Amicosante G, Fontana R,

et al.：Cloning

and characterization of

bla

VIM, a new integron-borne metallo-β-lactamase gene from a

Pseudomonas aeruginosa

clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother 1999；43：1584―90.

8）Senda K, Arakawa Y, Nakashima K, Ito H, Ichi- yama S, Shimokata K,

et al.：Multifocal outbrea-

ks of metallo-beta-lactamase-producing

Pseudo-

monas aeruginosa

resistant to broad-spectrum beta-lactams, including carbapenems. Antimi-

(7)

crob Agents Chemother 1996；40：349―53.

9）Arakawa Y, Shibata N, Shibayama K, Kurokawa H, Yagi T, Fujiwara H,

et al.：Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds. J Clin Microbiol 2000；38：40―3.

10）Yong D, Lee K, Yum JH, Shin HB, Rossolini GM, Chong Y,

et al.：Imipenem-EDTA disk method

for differentiation of metallo-β-lactamase-producing clinical isolates of

Pseudomonas

spp. and

Acinetobacter

spp. J Clin Microbiol 2002；40：

3798―801.

11）中村竜也，内田幸子，田中敬一郎，佐野みゆき，

中田千代，平城均，他：基質試薬 HMRZ-86 を用いたβ-ラクタマーゼ検出試薬による Extend- ed-spectrum β-Lactamase および Metallo-β-lactamase の検出に関する検討．臨床微生物迅速診断研究会誌 2004；15：15―20.

12）Senda K, Arakawa Y, Ichiyama S, Nakashima K, Ito H, Ohsuka S,

et al.：PCR detection of metallo

-beta-lactamase gene (blaIMP) in gram-negative rods resistant to broad-spectrum beta-lactams. J Clin Microbiol 1996；34：2909―13.

13）Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yoneka- wa T, Watanabe K, Amino N,

et al.：Loop-me-

diated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acid Res 2000；28：e63.

14）納富継宜，長谷哲：新規遺伝子増幅法（LAMP

法）の原理と応用．月刊バイオインダストリー 2001；18：15―23.

15）Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T, No- tomi T：Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun 2001；289：150―4.

16）陰山聡一，平山博樹：新しい遺伝子増幅法

（LAMP 法）による牛胚の性判別．日本胚移植学雑誌 2003；25：136―40.

17）Konoa T, Ram S, Saka M, Itami T：Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop- mediated isothermal amplification. J Virol Meth- ods 2004；115：59―65.

18）安中敏光，吉野学，百田隆祥，根本二郎，砂田亜津子，小島禎，他：Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法によるレジオネラ属菌の検出．日本臨床微生物学雑誌 2003；13：

19―25.

19）Parida M, Posadas G, Inoue S, Hasebe F, Morita K：Real-Time Reverse Transcription Loop-Me- diated Isothermal Amplification for Rapid De- tection of West Nile Virus. J Clin Microbiol 2004；42：257―63.

20）Hong TC, Mai QL, Cuong DV, Parida M, Minek- awa H, Notomi T：Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Clin Micro- biol 2004；42：1956―61.

21）中島一弘，池戸正成，荒川宜親，柴田尚宏：メルカプト化合物を用いた IMP-1 型メタロβ-ラクタマーゼ産生グラム陰性桿菌の簡易検出法．日細菌誌 2000；55：368.

22）富田憲弘，森安義，納富継宣：ユビキタス遺

伝子検査法の実現に向けた簡易検出法（2）金属指示薬を用いた LAMP 増幅結果の簡易目視検出．第 26 回日本分子生物学会年会プログラム・

講演要旨集 2003；777.

23）Arakawa Y, Shibata N, Kurokawa H, Doi Y, Shi- bayama K：A-101 Detection of VIM-2 metallo-β- lactamase producing

Pseudomonas aeruginosa

by thiol compounds in Japan. 101st General Meet- ing of American Society for Microbiology. Ab- stracts 2001；24.

24）神田成夫，大石和伸，柴田尚宏，荒川宜親：尿より検出された VIM-2 型メタロ-β-ラクタマーゼ産生緑膿菌の一例．日本臨床微生物学雑誌 2003；13：118.

25）Yatsuyanagi J, Saito S, Harata S, Suzuki N, Ito Y, Amano K,

et al.：Class 1 integron containing

metallo-beta-lactamase gene

bla

VIM-2 in

Pseudo- monas aeruginosa

clinical strains isolated in Ja- pan. Antimicrob Agents Chemother 2004；48：

626―8.

26）高野さかえ，常松範子，斉木由美子，柴田尚宏，

荒川宜親：関東で初めて検出された VIM-2 型メタロ-β-ラクタマーゼ産生

Pseudomonas fluo- rescerns

の 1 症例．日本臨床微生物学雑誌 2003；14：163.

27）坂入和宏，大塚広樹，大國壽士：カルバペネム

剤耐性菌検出キットを用いた IMP-1 型メタロ-β- ラクタマーゼ（blaIMP）遺伝子の迅速検査．感染症誌 2003；77：932―3.

(8)

Development and Evaluation of Novel Loop-Mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of bla

IMP-1and

bla

VIM-2Genes

Tadashi KOJIMA

^１）

, Naohiro SHIBATA

^２）

, Masanari IKEDO

^１）

& Yoshichika ARAKAWA

^２）

1)Biochemical Research Laboratory, Eiken Chemical Co., Ltd,²⁾Department of Bacterial Pathogenesis and Infection Control, National Institute of Infectious Diseases

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) amplifies a target gene with high specificity and rapid-

ity under isothermal conditions. LAMP assays were developed for the rapid detection of metallo-β-lactamase

(MBL) genes such as bla

IMP-1and

bla

VIM-2. We initially designed specific primers to detect MBL genes for LAMP assays and evaluated the specificity and sensitivity of these assays. LAMP assays amplified MBL genes under a con- stant temperature of 63℃ within 1 hour, and were compared to PCR in MBL-producing strains. The results of MBL genes typing by LAMP assays agree completely with PCR results . The lower detection limits of

bla

IMP-1- and

bla

VIM-2- LAMP assays using real-time turbidimeters were 30cfu!test and 3cfu!test, . After amplification, products were di- rectly observed by the naked eye with a fluorescent detection reagent. In conclusion, LAMP assays are convenient, rapid, and fully feasible for detecting MBL genes in ordinary clinical microbiology laboratories without special appara- tus.

Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法による メタロ-β-ラクタマーゼ遺伝子の迅速・簡易検出の検討