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論文の内容の要旨
氏名：齋 藤 五 月
博士の専攻分野の名称：博士（歯学）
論文題名：口腔扁平上皮癌細胞におけるウアバインのシグナル伝達について
口腔癌（
oral squamous cell carcinoma; OSCC
）の大部分は扁平上皮癌であり，恒常的な転写因子の活 性化により種々のサイトカインが構成的に産生されている。これらのサイトカインは腫瘍の進展・増 殖に関与するため，その産生を抑制することは，OSCC
の浸潤増殖を抑止する有効な手段となりえる。強心配糖体は，構造的に共通のステロイド骨格を有する物質であり，様々な生物学的効果を発揮す る。ウアバインは強心配糖体に属し，強心作用を有するのに加え抗癌作用があることが報告された。
この報告以後，様々な癌細胞への感受性が検討されてきたが，
OSCC
に対する効果は未だ明らかにさ れていない。本研究では，OSCC
に対するウアバインの抗癌作用について検索する前段階として，そ のシグナル伝達経路について検討を行った。本研究には，ヒト口腔扁平上皮癌由来株化細胞である
HSC3
を用いた。細胞はRoswell Park Memorial Institute 1640
（RPMI 1640; Thermo Fisher Scientific
）に，10%
ウシ胎児血清（fetal calf serum: FCS
）お よび1% penicillin-streptomycin
（Sigma
）を添加した10% FCS-RPMI
を用いて，5% CO
2，37°C
の条件下 で培養した。IL-8
およびIL-1α
濃度の測定は，HSC3
細胞を0
，30
，60
および120 μM
のウアバイン存 在下で1
時間培養し，培養上清を回収し，enzyme-linked immunosorbent assay
（ELISA
）により行った。BAPTA-AM
（10μM
）及びL-glutathione
（10μM
）の前処理は1
時間行った。Real-time polymerase chain reaction
（PCR
）による遺伝子発現解析は，RNeasy mini kit
（QIAGEN)
を用いてtotal RNA
を抽出し，complementary DNA
はSuperscript III reverse transcriptase
（Invitrogen
）を用いて作製した。発現の強度 はハウスキーピング遺伝子であるβ-actin
の増幅量で補正し，相対的な比率として求めた。Luciferase assay
に用いるreporter vector
は，IL-8
遺伝子の非翻訳領域（untranslated region: UTR
）（TATA box
上流1 kb
）を，HSC3
由来のゲノムDNA
を鋳型としてPCR
により増幅し，このfragment
をpGL4 vector
（
Promega
）にサブクローニングし作製した（NF-κB-long vector
）。増幅された領域は2
つのNF-κB
結 合部位を含んでおり，上流結合部位を欠失したNF-κB-short vector
をsite-directed mutagenesis
により作 製した。NF-κB
およびAP-1
レポーターvector
はStratagene
社より購入したものを用いた。HSC3
細胞 を5
時間transfection
し，30 μM
のウアバイン存在下または非存在下で1
時間刺激した。その後，細胞 溶解液を回収し，Dual-Luciferase Reporter Assay System
（Promega
）にてルシフェラーゼ活性測定を行 った。Western blotting
はHSC3
細胞を30 µM
のウアバインで1
時間刺激した後，10% FCS-RPMI
によ り洗浄後，新しい培地により0
，15
，30
および60
分間培養した。その後細胞を回収し，総タンパク質 量100 µg
を10% SDS-PAGE
によって泳動後，分離したタンパク質をImmobilion
膜（Millipore
）に転 写した。一次抗体により室温で1
時間反応させた。用いた一次抗体はウサギ抗ヒトp65
抗体（Santa Cruz
）， ウサギ抗ヒトp50
抗体（Santa Cruz
），ウサギ抗ヒトc-Jun
抗体（Santa Cruz
），ウサギ抗ヒトc-Fos
抗体（
Santa Cruz
），およびウサギ抗ヒトGAPDH
抗体（Santa Cruz
）であり，それぞれ1% BSA-PBST
（0.1%
tween-20/PBS
）で1,000
倍に希釈して用いた。その後，horse radish peroxidase
（HRP
）標識ヤギ抗ウサ ギIgG
（H+L
）抗体（Jackson Immuno Reserch
）（1% BSA-PBST
により10,000
倍希釈）により室温で30
分間反応させた。Immobilion
膜をClarity Western ECL Substrate
（Bio-Rad
）に浸漬して発光反応を行っ たのち，Chemi Doc XRS
（Bio-Rad
）で撮影した。免疫蛍光染色は細胞をウアバイン30 µM
の存在下ま たは非存在下で6
時間培養した。一次抗体はウサギ抗ヒトp65
抗体（Santa Cruz
），ウサギ抗ヒトp50
抗体（Santa Cruz
）を1% BSA-PBS
で100
倍希釈し，室温で1
時間反応させた。二次抗体はgreen
fluorescence protein
（GFP
）標識ヤギ抗ウサギIgG
（H+L
）抗体（Jackson Immuno Reserch
）を1% BSA-PBST
で10,000
倍に希釈し，室温で30
分間反応させた。その後，蛍光顕微鏡BZ-X700
（Keyens
）にて撮影 した。蛍光強度はImage J
（National Institutes of Health
）を用い，核および細胞質内の輝度を測定した。2
ELISA
の結果，HSC3
はIL-8
（585 ± 33.3 pg/mL
）およびIL-1α
（93 ± 7.2 pg/mL
）を恒常的に産生し ていた。次いで，HSC3
をウアバインで刺激したところウアバイン濃度依存的にIL-8
産生を低下させ た。IL-8
産生は30 μM
のウアバインで299 ± 45.8 pg/mL
まで低下した。一方，IL-1α
産生はウアバイン 刺激により122 ± 4.59 pg/mL
まで増加した。またウアバインによるIL-8
産生抑制はBAPTA-AM
及びL-glutathione
により解除された。これらの変化が転写レベルで調節されている可能性についてreal-time PCR
により検討した。ウアバインの非存在下でのmRNA
発現レベルを1
とした場合，IL-8 mRNA
発 現は30 μM
で0.153 ± 0.05
に抑制された。対称的に，IL-1α mRNA
発現は，ウアバイン刺激3
時間後に1.14 ± 0.04
に増強された。Luciferase assay
では，NF-κB
およびAP-1
を用いて検索したところ，ウアバ イン刺激によりNF-κB
活性はコントロールと比較して47%
まで低下し，逆にAP-1
活性は333%
まで 増加した。IL-8
遺伝子調節領域におけるNF-κB
結合部位の関与について調べるために，NF-κB-long vector
およびNF-κB-short vector
を用いて検討を行った。その結果，NF-κB-short vector
では，ウアバイ ン刺激によりルシフェラーゼ活性に変化を示さなかったのに対しNF-κB-long vector
では，ルシフェラ ーゼ活性の低下を示した。Western blotting
の結果，ウアバイン刺激によるNF-κB
サブユニットのリン 酸化には変化が認められなかったのに対して，c-Jun
およびc-Fos
のリン酸化はウアバイン刺激15 ~ 30
分後に有意に増加した。ウアバイン刺激前後のNF-κB p65
，p50
サブユニットの細胞内局在を免疫蛍 光染色により検索した。p65
，p50
サブユニットは共に，未刺激の細胞では主に核内で検出されたのに 対し，ウアバイン刺激によりp65
は細胞質中により強い蛍光が認められた。一方，p50
では変化は認 められなかった。本研究の結果，ウアバインは転写因子
NF-κB
とAP-1
に対し相反する効果を発揮することが明らか になった。IL-8 mRNA
の転写誘導は，主にNF-κB
によって調節され，その結合部位はIL-8 5'-UTR
内の
TATA
ボックス150 bp
上流までの領域に位置するとされている。しかし上述のデータから，TATA
ボックスのさらに上流
1 kb
に位置するNF-κB
結合部位がウアバインによるIL-8 mRNA
発現抑制に大 きく関与することが示され，ウアバインの効果が既知のメカニズムとは異なったシグナル伝達経路を 経由する可能性が示唆された。ウアバインは
AP-1
のコンポーネントであるc-Jun
およびc-Fos
のリン酸化を亢進し，AP-1
を活性化 することが明らかとなった。Luciferase assay
で用いた5'-UTR
領域には，AP-1
結合部位も存在するこ とから，HSC3
においてはAP-1
の効果が限定的である可能性が考えられた。NF-κB
に対する抑制効果 のメカニズムを追求するために蛍光免疫染色により検討したところ，ウアバイン刺激によりp65
サブ ユニットの核移行はわずかに抑制されることが明らかとなった。この結果がp65
サブユニットの核移 行の阻害なのか，あるいは核からの移行促進によるものなのか，そのメカニズム解明についてはさら なる検討が必要と考えている。以上の結果から，ウアバインは
