Mem,InstituteofAdvancedTechnology,KinkiUniversityNo.6:15〜24(2001) 15
ウ サ ギ ・イ ン タ ー.α.ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー 重 鎖2お よ び 3前 駆 体 を コ ー ドす るcDNAの ク ロ ーp・ 一 一.ン 化 と塩 基 配 列 の 決 定
鈴 木 淳 夫1、 加 藤 博 己1、 入 谷 明1'2
要 約
ウ サ ギ 肝 臓 か ら 、 イ ン タ ー 一α一ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー(ITI)重 鎖2お よ び3前 駆 体(HC2,HC3)を コ ー ドす るcDNAを 、RT‑PCR(reverse‑transcriptionpolymerasechainreaction}法 お よ びRACE(rapidamplify‑
icationofcDNAend)法 を 用 い て 単 離 し、 そ の 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 単 離 し たcDNAは そ れ ぞ れ947、904 残 基 の ア ミ ノ 酸 翻 訳 領 域 を 含 む3,122、2,823塩 基 対 で あ っ た 。HC2の ア ミ ノ 酸 配 列 を ヒ ト、 マ ウ ス お よ
び ハ ム ス タ ー のHC2の そ れ と比 較 し た と こ ろ85、84,83%の 同 一 性 を も っ て い た 。 同 じ よ う な 結 果 は HC3で も 得 ら れ た 。 す で に 報 告 し た ウ サ ギHC1で も 同 様 で あ っ た 。 し か し 、 同 種 の 鎖 間 す な わ ちHC1と HC2、HC1とHC3、HC2とHC3で は 、40、52,40%と 低 い 同 一 性 を 示 し た 。 こ の こ と は 、 重 鎖 そ れ
ぞ れ が 独 自 に 進 化 し 、 そ れ ぞ れ 独 自 の 機 能 を 持 っ て い る こ と を 示 唆 し て い る 。
緒 言
イ ン タ ー 一α一 ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー(ITI)フ ァ ミ リー は 、 血 漿 中 に 存 在 す る プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の 一 つ で あ る(1 ‑2)。ITIフ ァ ミ リー は 翻 訳 後 複 雑 な 修 飾 を 受 け て 多 様 な 複 合 体 を 形 成 す る(3‑4)。 ヒ ト の 場 合 、ITIは1本 の 軽 鎖(HI‑30)と2本 の 重 鎖(HC1とHC2)が 、1本 の コ ン ドロ イ チ ン 硫 酸 鎖 を 介
した 複 合 体 を 形 成 し て い る 。 別 の 複 合 体 と し て プ レ ーα一ト リ プ シ ン ヒ ビ タ ー(Pα1)が あ り 、 これ は1本 の 軽 鎖(HI‑30)と1本 の 重 鎖(HC3}と1本 の コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸 鎖 で 構 成 さ れ て い る(5‑7)。 し か し、 ウ シ のITIはHC2とHC3と コ ン ドロ イ チ ン 硫 酸 鎖 か ら な り、 ウ シPα1はHC2と コ ン ド ロ イ チ ン 硫 酸 鎖 か ら な る(8)。 こ の よ う に 種 に よ っ て 異 な っ た ペ プ チ ド鎖 構 成 を も つ(9)。HI‑30鎖 は2個 のKunitz型 ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー ドメ イ ン か ら な り 、ITIの 名 前 の 由 来 で あ る プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 活 性 能 は これ に 起 因 す る 。 そ の 構 造 か らHI‑30鎖 を ビ ク ニ ン(bikunin)と も 呼 ぶ(5‑7)。
ITIフ ァ ミ リー と し て も う ひ と つ 重 鎖(HC4}が あ り、 こ れ は 複 合 体 を 形 成 せ ず に 単 独 で 存 在 し て お り、
血 漿 カ リ ク レイ ン に よ っ て2分 子 に 分 解 さ れ や す い 性 質 を も つ(10)。
ITIの 生 理 作 用 と して 、 卵 の 成 熟(11)、 胎 児 の 着 床(12)、 ガ ン の 浸 潤 ・転 移 、 関 節 炎(13‑14)な ど に 関 与 し て い る と い わ れ て い る が 、 い ま だ に 重 鎖 の 役 割 が 明 確 で は な い(15)。 そ こ で 重 鎖 の 生 理 機 構 を 明 ら か に す る 目 的 で 、 今 回 、 ウ サ ギ 肝 臓 全RNAか ら 、RT‑PCR法 、5'‑RACE法 、3'一 ・RACE法 を 用 い て 重 鎖(HC2, HC3)の ク ロ ー ニ ン グ を お こ な い 、 そ れ ぞ れ の 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 す で に 報 告 し たHCl(16)を 含 め て 重 鎖 の 重 要 性 を 考 察 し た 。
材 料 お よ び 方 法
ウ サ ギ 肝 臓 か ら の 全RNAの 抽 出 、RT‑PCR法 、3'‑RACE法 、5'‑RACE法 、 塩 基 配 列 の 決 定 法 に つ い て は す で に 報 告 し た(16)。 今 回 ク ロ ー ン 化 に 使 用 し た プ ラ イ マ ー を 以 下 に 記 す 。
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HC2前 駆 体 の ク ロ ・・一一ン 化
(i)RT‑PCR=プ ラ イ マ ー は ヒ ト と マ ウ ス のHC2間 で 相 同 性 の 最 も 高 い 領 域 部 分 を 参 考 に し て 設 計 し た 。 ア ン チ セ ン ス 鎖 と し て5'‑TGCtACCACgATCTCgGAgCC‑3'(Fig.1に 二 重 下 線 で 示 す 。)を 用 い た 。 セ ン ス 鎖 と して5'‑AGATAtcAGAGAAGCCTTCC‑3'(Fig、1に 二 重 下 線 で 示 す 。)を 用 い た 。 小 文 字 は 実 験 で 決 定 した 塩 基 と 異 な っ て い た こ と を 表 す 。
(ii)3'‑RACE:セ ン ス 鎖 と し て5℃AGCTGGTGGTGATGTATGA‑3'(Fig.1に 一一重 下 線 で 示 す 。)と プ ラ イ マ ー シ フ トPCR(nestedPCR)用 セ ン ス 鎖 と し て5'‑ATCAGTAACAGACGTCACTC‑3'(Fig.1に 一 重 下 線 で 示 す 。)を 用 い た 。 こ れ ら の 配 列 は 、(i)のRT‑PCRで 得 ら れ た 配 列 を 基 に 設 計 し た 。 ア ン チ セ ン ス 鎖 と し て 、RNALAPCRkit(Takara)に 付 い て い る 、Olio(dT)20‑M4とM4を 用 い た 。 (iii)5t‑RACE:ア ン チ セ ン ス 鎖 と し て5'‑TTACCAGTTTGCTCTGGATG‑3'(Fig,1に 点 線 で 示 す 。)と
nestedPCR用 ア ン チ セ ン ス 鎖 と し て5'‑GAGAAGTAATAGTGGACTG(}‑3'(Fig。1に 点 線 で 示 す 。) を 用 い た 。 こ れ ら の 配 列 も 、(i)で 得 ら れ た 配 列 を 基 に 設 計 し た 。 セ ン ス 鎖 と し て01igo(dT)20‑M4 とM4を 用 い た 。
HC3前 駆 体 の ク ロ ー ン 化
(i)RT‑PCR:ア ン チ セ ン ス 鎖 と し て5'‑atcGTGaGATAGGCCCAcAG‑3'と
nestedPCR用 と し て5'‑tGcTACCACGATCTCGGAGCC‑3'を 用 い た 。 セ ン ス 鎖 と し て 5'‑AAACGGAGCCTcCCgGAAGG‑3'を 用 い た 。
(ii)3'‑RACE:セ ン ス 鎖 と し て5'‑CAATTACAACTTCCTGGAGA‑3'と 5'‑AGCTACCAGCACTTCTACGAを 用 い た 。
(iii)5'‑RACE=ア ン チ セ ン ス 鎖 と し て5'‑TGGACCTTGAGGTACATCTC・ ・3'と 5'‑GTAGATCTCAATGCCGTTGA‑3'を 用 い た 。
こ れ ら の プ ラ イ マ ー はFig,1と 同 じ く 、Fig.2に 二 重 下 線 、 一 重 下 線 、 点 線 と し て 示 す 。
結 果 お よ び 考 察
HC2前 駆 体 は 、3,122塩 基 対 か ら な り947残 基 の ア ミ ノ 酸 翻 訳 領 域 を 含 ん で い た(Fig,1)。 一 方HC3 前 駆 体 は 、2,823塩 基 対 か ら な り904残 基 の ア ミ ノ 酸 翻 訳 領 域 を 含 ん で い た(Fig.2)。
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Fig.1.NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofthecDNAencodingtheHC2 precursorofrabbitITLThenucleotideandpredictedaminoacidresiduesare numberedontherightandleft,respectively.Nucleotidesprecedingthestart codonarepresentedaslowercaseletters,andnし1mberednegatively.Thenucleo‑
tidesequencescorrespondingtotheprimersusedfortheRT‑PCRaredoub工y underlined.Theprimersusedforthe3'‑and5'‑RACEaresinglyunderlined anddottedunderlined,respectively、AnasteriskshowsthestopcodonIimiting theopenreadingframeandtheensuinguntranslatednucleotidesareshownas IOWerCaSeletterS
Fig.2.NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofthecDNAencodingtheHC3
precusorofrabbitITI,Thenumberingofnucleotldesandaminoadds、aswellas thesymbolsandunderlinesarethesameasinFig.1.
HC2の ア ミ ノ 酸 配 列 を ヒ ト(17)、 マ ウ ス(18)お よ び ハ ム ス タ ー(19)のHC2の そ れ と 比 較 し た と こ ろ 85、84,83%の 同 一 性 を も っ て い た 。 同 じ よ う な 結 果 はHC3で も 得 ら れ た 。 す で に 報 告 し た ウ サ ギHC1 で も 同 様 で あ っ た 。
Fig.3.AminoacididentitiesinthethreeHl‑,H2‑andH3‑chainprecursors:comparison betweenchalnsandbetweenspecies.Thenumberofidenticalaminoacids sharedbyapairofpolypeptidesisgivenasapercentageofthetotalnumberof reslduesinthelongestpolypeptldecomparedineachpair,r,rabbit;h,human.
Fig、4,AlignmentoftheaminoacidsequencesofthethreerabbitHCs.Aminimum numberofgaps,indicatedbyhyphens,havebeenintroducedtomaximizethe alignment.Arrowsunderthesequencesindicatedthebordersofthethreeseg‑
ments:Nsegment,betweenarrowsland2;Msegment,betweenthearrow2and 3;andCsegment,betweenarrow3and4、Anarrowheadindicatestheprobable C‑terminalcleavagepointsharedbythematureHCschains。Abrokenunderline indicatesavonWilebrandtype‑Adomain.Underlinesindicateapotentialmulti‑
copperoxidasedomain,TheresiduesidenticalwithinthethreeHCsareshaded.
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し か し、 同 種 の 鎖 間 す な わ ちHC1とHC2、HC1とHC3、HC2とHC3で は 、40、52、40%と 低 い 同 一 性 を 示 した(Fig3、4)。 こ の こ と は 、 重 鎖 そ れ ぞ れ が 独 自 に 進 化 し、 そ れ ぞ れ 独 自 の 機 能 を 持 っ て い る こ と を 示 唆 し て い る 。
Chanた ち は(17)、 マ ウ ス と ヒ トのHCs前 駆 体 を3部 分 に 分 け 次 の よ う な こ と を 示 し た 。(i)種 間 ・鎖 間 で 比 較 的 よ く 保 存 さ れ た シ グ ナ ル ペ プ チ ドを 除 く約550ア ミ ノ 酸 残 基 を 含 むN末 端 領 域 、(ii)ア ミ ノ 酸 組 成 や 長 さ も 異 な る 変 化 に 富 ん だ 約70ア ミ ノ 酸 残 基 を 含 む 中 間 領 域 、(iii)N末 端 領 域 と 同 じ よ う に 比 較 的 よ く保 存 さ れ た 約240ア ミ ノ 酸 残 基 を 含 むC末 端 領 域 。 こ のC末 端 領 域 は,HCsと グ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン 、HI30が 分 子 内 結 合 す る と き に 切 り離 さ れ る 部 分 で あ る 。 こ の 切 断 は ヘ プ タ ペ プ チ ドDPHFIIのArg702 とPro703〔 番 号 はHC2の ア ミ ノ 酸 番 号)と の 間 で 起 こ り、 こ の 配 列 は ウ サ ギ に も 存 在 し鎖 間 ・種 間 で も 完 全 に 保 存 さ れ て い た(Fig、4)。 この こ と は ウ サ ギ の3つ のHCs前 駆 体 も 、 分 泌 さ れ る 前 に 他 種 と 同 じ よ う な 方 法 で 切 断 さ れ 修 飾 を 受 け る こ と を 示 して い る 。
ウ サ ギ のHCsの そ れ ぞ れ をN末 端 領 域 、 中 間 領 域 、C末 端 領 域 を ヒ ト、 マ ウ ス 、 ハ ム ス タ ー で 比 較 し て み る と 、N末 端 領 域 、C末 端 領 域 で は 、80‑90%で 、 中 間 領 域 は60‑70%の 同 一一性 を 示 し た 。N末 端 領 域 に は 、 接 着 作 用 と 関 わ りの あ るvonWillebrandtype‑Adomainが ウ サ ギ に も み ら れ 種 を 越 え て 存 在 し て い る こ と が わ か っ た が 、 そ の 生 理 作 用 に つ い て は ま だ 十 分 に は 解 明 さ れ て い な い 。 ま た 切 り離 さ れ るC末 端 領 域 は 、 他 の 二 つ の 領 域 と は 異 な っ た 進 化 の 過 程 を 経 る と 考 え ら れ る に も か か わ ら ず 高 い 相 同 性 を 示 し て い る の は 、 何 ら か の 重 要 な 生 理 作 用 が あ る も の と 考 え ら れ る 。HC1、HC3のC末 端 領 域 に は 、 multicopperoxidasedomainが 種 を 越 え て 存 在 し て い る こ と が わ か っ た が 、 そ の 生 理 作 用 は ま だ よ く わ か
っ て い な い 。 中 間 領 域 の 相 同 性 が 比 較 的 低 い の は 、 こ の 領 域 が 生 理 作 用 を も つ と 考 え ら れ るN‑,C一 末 端 領 域 を つ な ぐ連 結 部 分 に 当 た り 、 切 断 過 程 が 種 独 自 に 進 化 し た の で は な い か と 考 え ら れ る。
今 後 は 、HCsの 生 理 作 用 を 明 ら か に す る た め に 、 組 織 化 学 的 な 研 究 が 必 要 と考 え る
参 考 文 献
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MemoirsofInstituteofAdvancedTechnology,KinkiUniversityNo.6(2001)
英文要旨
MolecularCloningandSequencingofcDNAsEncodingRabbit Inter一 α 一TrypsinInhibitorHeavy‑Chain2and3Precursors
AtsuoSuzukii,HiromiKatoi,andAkiraIritanii'2
Abstract
ComplementaryDNAencodingprecursorsofthetwoheavychains(HC2,HC3}oftheinter一 α 一trypsin
inhibitorwasamplifiedfromrabbitlivertotalRNAbyreverse‑transcriptionpolymerasechainreaction (RT‑PCR)andrapidamplificationofcDNAend(RACE),clonedandsequenced.ThecDNAsspannedastretch of3,122and2β23nucleotideswithopenreadingframecodingfor947and904aminoacidresidues respectively.ThededucedaminoacidsequenceoftheHC2precursorwas85,84,and83%identicalwith thoseoftheHC2precursorsfromman,mouse,andhamster,respectively.TheHC3andHC1,described previously,precursorsshowedsimilardegreesofsequenceidentitywiththecorrespondinghuman,mouse, andhamsterHCprecursors.Whentheintra‑speciesHCsprecursorswerecomparedwitheachother,HCl toHC2,HCltoHC3,andHC2toHC3,however,thededucedaminoacidsequenceshowedonly40,52、
and40%sequenceidentity,respectively.TheseresultssuggestthatHCgeneshavebeenevolvinginde‑
pendentlyofeachotherunderpurifyingselectionandeachHCsubfamilymayhaveuniquefUnction(s).
1.InstituteofBiology‑OrientedScienceandTechnology,KinkiUniversity.Kainan,Wakayama.642‑0017,Japan 2.DepartmentofGeneticEngineertng,KinkiUniversity,Wakayama649‑6493,Japan
ThenucleotidesequencedatareportedinthispaperhavebeensubmittedtotheDDBJ/EMBL/GenBanknucleotidesequencedatabasewith theaccessionnumberABO50592andABO50593respectively
