Title
Molecular and Immunological Characterization of Ribosomal
Phosphoprotein PO of Babesia gibsoni( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
Mohamad Alaa Hasan Shekh Terka
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(獣医学) 甲第270号
Issue Date
2009-03-13
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/33582
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏 名(国籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 貞 (12)
Mohamad Alaa Hasan Shekh Terkawi
(シリア･アラブ共和国) 博士(獣医) 獣医博甲第270号 平成21年3月13日 学位規則第3粂第1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 帯広畜産大学 Molecular andImmunologicalCharacterizations of
RibosomalPhosphoprotein PO of彪besla glbsoDl
(バべシアギブソニーリボソームリン酸タンパク質POの 分子免疫的解析) 主査 帯広畜産大学 副査 帯広畜産大学 副査 岩 手 大 学 副査 東京農工大学 副査 岐阜 大 学 津 木 口 井 士 河 鈴 谷 白 福 授 授 授 授 授 教 教 教 教 教 信一郎 宏 志 和 之 淳 資 秀 人 論 文 の 内 容 の 要 旨 バべシア原虫は,野生動物から家畜噂乳類,ヒトに至るまで広く感染が成立する赤血球 寄生性原虫である｡バべシア症は,無症候キャリアーから致命的なマラリア様病態まで幅 広い臨床症状を呈する｡加ゎe∫ねg仏和而はイヌバベシア症の病原体で,世界中の多くの地 域でイヌへの感染が確認されている｡且刑fcror王はげっ歯類およびヒトバベシア症の主要な 病原体と考えられている｡且g伽0〃fと且椚fcroJfの交差反応抗原の血清学的同定は,イヌ およびヒトバベシア症の新規コントロール戦略につながるものと思われる｡これらの交差 反応抗原を同定するために,且g血0乃fのcDNAライブラリを且〝症肌痛感染急性期マウス 血清でイムノスクリーニングした｡その結果,リボソームリン酸タンパク質PO(BgPO)が イムノドミナントな抗原としてクローニングされた｡次に.BgPO遺伝子を単離し解析を行 った結果,BgPO遺伝子は且g触0乃fゲノムDNA中にシングルコピーとして存在し.その ORF942bpは,314アミノ酸,34kDaのタンパク質をコードすることが推定された｡大腸 菌で発現したGST融合組換え体BgPO(rBgPO)に対する抗血清は▲B.gibsoniおよびB.microti 赤内型原虫ライセートの34kDaタンパク質と特異的に反応した｡またBgPOに対する強い 免疫反応が,且g伽0"fおよび且血croJiの急性期および慢性期血清に認められた｡さらに. rBgPOの免疫防御効果をBALB/cマウスを用いて評価したところ,フロイントアジエバン トを併用したrBgPOの腹腔内投与は,同抗原に対するIgGlおよびIgG2aからなる強い液 性免疫を誘導した｡その結果,これらのマウスは抹消血中での原虫寄生率は上昇が遅れ,か つ.有意に抑制された｡次に,且〃扉c和〟感染に対する,精製抗BgPOIgGによる受動免疫効
果を調べるため1mgのIgGをSCIDマウスに腹腔内投与したところ,12日間B･microtiの 増殖が抑制された(第l章)｡ さらに.他種バべシア原虫のcDNAライブラリを抗rBgPO血清でスク.U-ニングするこ とで,BgPOホモログを単離した｡アミノ酸配列に基づく系統学的解析を行ったところ,BgPO はこれらホモログと以下の高い相同性を示した｡(且(元毎招PO(88.1%),且･封ge椚加αPO (85.6%),且あ0VねPO(81.4%),且e曾〟fPO(64.9%))｡また抗BgPO血清を用いた数種のバべ シア赤内型原虫ライセートに対するウェスタンプロット解析により,31∼34kDaの関連タ ンパク質が見いだされた｡次に,且占ovf∫感染に対する抗BgPOIgGの防御効果を加vわ℃培 養系で調べた結果,B.bovist*殖は抗rBgPOIgGにより濃度依存的に抑制され,培養液中濃 度Img/ml時には原虫寄生率の有意な抑制が見られた(第2章)｡ 第1章,第2章に示したデータに基づき,次に,敦死的なネズミバべシア感染における 補体成分C3の役割を明らかにする目的で,且′肌班血涙感染でのrBgPOによる交差免疫誘 導試験を行った｡rBgPOを用いて,C57BL/6マウス(WT)およびC3KOマウス(C3-/-)を 免疫した結果,WTマウスには特異的で強いIgGlおよびIgG2から成る液性免疫が誘導さ れ,かつ,牌臓細胞上清中に高いIFN■-†産生が認められた｡一方,C3-/-マウスではトータ ルIgG,IgGl,IgG2bが有意に低く,IL-12およびIFN-γの分泌はWTより低い傾向にあっ た｡部分的防御効果はrBgPO免疫WTマウスのみに見られ,C3-/-マウス▲対照群マウスに は見られなかった｡これらのマウスは統計学的に有意な原虫寄生率上昇の遅れが見られ, また,致死時期の遅れ,生存率低下の遅れが見られた(第3章)｡ 以上の結果は,他のアピコンプレックス門原虫で報告されているように,POがバべシア 感染においても強い免疫原性を有することを示唆するものであり,またこの抗原が原虫の 細胞内侵入に関与しているという仮説を支持するものでもある｡POはバべシア原虫属間で 広く保存された防御抗原であることから,バベシア症制圧を目的としたユニバーサルワク チン抗原の候補として至適と考察する｡さらに,ノックアウトマウスを用いた交差免疫誘 導試験の成績から､補体成分C3がPO抗原に対する液性および細胞性免疫応答の調節に関 して重要な役割を果たしていることも示唆された｡ 審 査 結 果 の 要 旨 バベシア原虫は,野生動物から家畜晴乳類,ヒトに至るまで広く感染が成立する 赤血球寄生性原虫である｡バベシア症は,無症候キャリアーから敦命的なマラリア 様病態まで幅広い臨床症状を呈する｡バべシア症の予防法として,原虫感染血液の 接種による計画感染がウシのバベシア症で行われているが,他のバベシア症に対す る有効な予防法は開発されていない｡本研究では多種バべシア症の予防に有効なユ ニバーサルワクチンの開発を目的として,イヌバベシア原虫且g触0乃fのリボソーム リン酸タンパク質PO(BgPO)抗原について,その分子性状および免疫原性,ならび に他種バべシア症でのワクチン効果を検討した｡また,交差免疫誘導試験の成績か ら､補体成分C3がPO抗原に対する免疫応答の調節に重要な役割を果たしているこ とを見いだした｡ 第1章では,且gfあ∫0乃fのcDNAライブラリをネズミバべシア原虫且椚fcroわ感染 マウス血清でイムノスクリーニングして,BgPOをイムノドミナント抗原としてクロ ーニングし,その性状を解析した｡BgPO遺伝子は且g伽0乃fゲノムにシングルコピ ーとして存在し,3】4アミノ酸,34kDaのタンパク質をコードすることが推定された｡
GST融合組換え体BgPO(rBgPO)に対する抗血清は.B.gibsoniおよびB.microti*内 型原虫ライセートの34kDaタンパク質と特異的に反応した｡且g伽0扉および且 血cro〟の急性期および慢性期血清はBgPOと強く反応した｡rBgPOをフロイントアジ ュバントとともにBALB/cマウスの腹腔内に投与したとろ,同抗原に対するIgGl およびIgG2aからなる強い液性免疫が誘導された｡これらマウスでは抹消血中での 原虫寄生率の上昇が遅れ,かつ,それが有意に抑制された｡精製抗BgPOIgGで受動 免疫されたSCIDマウスでは,腹腔内接種後の且血crorfの増殖が12日間抑制された｡ 第2章では,他種バべシア原虫のcDNAライブラリを抗rBgPO血清でスクリーニ ングして,各種BgPOホモログを単離した｡･アミノ酸配列に基づく系統学的解析では ホモログ間に64･9∼85.6%の高い相同性が認められた｡BgPO血清を用いたウェスタ ンプロット解析により,数種バベシア赤内型原虫のライセート中に,分子量31∼34 kDaの関連タンパク質を見いだした｡BgPOIgGは,B.bovisO)invitro培養系での増 殖を濃度依存的に抑制し,培養液中の抗体濃度1mg/mlで原虫寄生率の有意な抑制 が見られた｡ 第3章では,PO抗原に対する免疫応答での補体成分C3の役割を明らかにする目 的で,且ro(溝α涼感染に対する畑gPOの交差免疫誘導効果をノックアウトマウスで 調べた｡C57BL/6マウス(WT)およびC3KOマウス(C3-/-)をrBgPOで免疫したと ころ,WTマウスには特異的で強いIgGlおよびIgG2から成る液性免疫が誘導され, かつ,牌臓細胞上清中に高いIFN一†産生が認められた｡一方,C3-/-マウスではトー タルIgG,IgGl,IgG2bが有意に低く,IL-12およびIFN-†の分泌はWTより低い傾 向にあった｡有意な原虫寄生率上昇の遅れ,致死時期の遅れ,生存率低下の遅れな ど,部分的防御効果はrBgPO免疫WTマウスのみに見られ,C3-/-マウス,対照群マ ウスには見られなかった｡ 以上のことから,POが他のアピコンプレックス門原虫の感染に同じく,バべシア 感染においても強い免疫原性を有することを示唆された｡POはバベシア原虫属間で 広く保存された防御抗原であることから,バベシア症制圧を目的としたユニバーサ ルワクチン抗原の候補と成り得る｡また,ノックアウトマウスを用いた交差免疫誘 導試験の成績から､補体成分C3がPO抗原に対する液性および細胞性免疫応答の調 節に関して重要な役割を果たしていることも示唆された｡本研究の成果は,バベシ ア原虫感染に対する宿主免疫応答の解明を大きく前進させ,将来のバべシア症防圧 法の開発につながることが期待される｡ 以上について,審査委員全員一敦で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の 学位論文として十分価値があると認めた｡ 基礎となる学術論文 1)題 目‥BabesiagibsoniribosomalphosphoproteinPOinducescross-protectiveimmunityagainstB.microtiinftctioninmice 著 者 名:Terkawi,M.A.,Jia,H.,Zhou,J.,Lee,E.G.,Igarashi,Ⅰ..Fujisaki,K., Nishikawa,Y.andXuan,X. 学術雑誌名:Vaccine 巻･号･頁･発行年:25(11):2027-2035,2007
2)題 目:AsharedantigenamongBabesiaspecies:ribosomalphosphoprotein POasauniversalbabesialvaccinecandidate 著 者 名:Terkawi,M.A.,Jia,H.,Gabriel,A.,Goo,YK.,Nishikawa,Y, Yokoyama,N.,Igarashi,1.,Fltjisaki,K･andXuan,X･ 学術雑誌名:ParasitologyResearch 巻･号･頁･発行年:102(1):35-40,2007 3)題 目:C3contributestothecross-PrOteCtiveimmunityinducedbyBabesia gibsoniphosphoriboproteinPOagainstalethalB･rOdhainiinftction 著 者 名:Terkawi,M.A.,Zhang,G.,Jia,H.,Aboge,G.,Goo,YIK･,Nishikawa, Y,Yokoyama,N.,Igarashi,I.,Kawazu,S･Ⅰ･,Fujisaki,K･andXuan, Ⅹ. 学術雑誌名:ParasiteImmunology 巻･号･頁･発行年:30(6):365-370,2008 既発表学術論文 1)題 目:Anove157-kDamerozoiteproteinofBabesiagibsoniisa prospectiveantigenfbrdiagnosisandserosurveyofcanine babesiosisbyenzyme-1inkedimmunosorbentassay 著 者 名:Aboge,G.0.,Jia,H.,Terkawi,M.A･,Goo,Yl,Kuriki,K･,Nishikawa, Y.,Igarashi､I.,Suzuki.H･andXuan,X･ 学術雑誌名:VeterinaryParasitology 巻･号･頁･発行年:149(1):85-94,2007 2)題 目:Babesiagibsoni:identificationofanimmunodominant,interspersed repeatantlgen 著 者 名:Jia,H.,Terkawi,M.A.,Aboge,G.0.,Goo,YK･,Zhou,J･,Lee,E･G･, Nishikawa,Y,Igarashi,Ⅰ.,Fttjisaki,K･andXuan,X･ 学術雑誌名:ExperimentalParasitology 巻･号･貢･発行年:118(1):146-149,2008 3)題 目:Babesiagibsoni:Serodiagnosisofinftctionindogsbyan enzyme-1inkedimmunosorbentassaywithrecombinantBgTRAP 著 者 名:Goo,Y.K.,Jia,H.,Aboge,G.0.,Terkawi,M.A.,Kuriki,K･, Nakamura,C.,Kumagai,A.,Zhou,J.,Lee,E.G.,Nishikawa,Yl, Igarashi,Ⅰ.,Fltiisaki,K･andXuan,X･ 学術雑誌名:ExperimentalParasitology 巻･号･貢･発行年:118(4):555-560,2008
