大賀好美

(1)

奈医誌.(J.

N a r a M e d . A s s

目)

4 3

，

489~502， 1 9 9 2 ( 4 8 9 )

生後発育に伴う胎児ヘモグロビン

γ

鎖異型体組成の変化について一一いわゆる

A‑Fs w i t c h i n g

に関連して

奈良県立医科大学第

2

生理学教室

大賀好美

CHANGES OF THE γISOFORM COMPOSITIONS IN FETAL HEMOGLOBIN DURING POSTNATAL DEVELOPMENT

YOSHIMI OHGA

Second Department 0 1 P h y s i o l o g y

，

Nara M e d i c a l U n i v e r s i t y

R e c e i v e d S e p t e m b e r 2 9

，

1 9 9 2

Summm ツ Ane f f i c i e n t p r o c e d u r e was d e v e l o p e d f o r t h e e n r i c h m e n t o f Hb F ( α 2 γ 2 ) i n human a d u l t h e m o l y s a t e by an a l k a l i d e n a t u r a t i o n ‑ s a l t i n g o u t . The method c a n be a p p l i e d t o s m a l l amounts o f b l o o d w i t h l e s s t h a n 1 % o f Hb F

，

and p r o v i d e s a s u f f i c i e n t Hb F l e v e l t o a l l o w an a c c u r a t e . h i g h ‑ p e r i o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c (HPLC) q u a n t i t a ‑ t i o n o f t h e t h r e e γchain i s o f o r m s

，

Gγ(136 Gly

，

7 5 I l e )

，

A γ 1 036 Ala

，

7 5 I l e ) and A γ T 036 Ala

，

7 5 T h r ) . CM ‑Sephadex chromatography can be combined t o a t t a i n a f u r t h e r e n r i c h m e n t Hb F i s o l a t e d from a d u l t b l o o d was e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l w i t h t h e p r o t e i n from c o r d b l o o d i n t h e i r p h y s i c o c h e m i c a l and p h y s i o l o g i c a l p r o p e r t i e s . D e v e l o p m e n t a l c h a n g e s i n t h e γ i s o f o r m c o m p o s i t i o n o f Hb F were s t u d i e d i n 1 1 0 normal J a p a n e s e newborns

，

2 9 7 i n f a n t s w i t h i n o n e y e a r a f t e r b i r t h and 1 2 1 a d u l t s

，

f i r s t by t h e γCB‑3 p e p t i d e p r o c e d u r e and t h e n by HPLC m e t h o d . The a v e r a g e r a t i o o f Gγ/Aγchanged from 7/3 a t b i r t h t o 4/6 d u r i n g t h e p o s t n a t a l 4 ‑t o 5‑month p e r i o d

，

and t h e r e a f t e r s e t t l e d down g r a d u a l l y t o 3/7 i n t h e a d u l t s . The most c o n s p i c u o u s f i n d i n g was t h a t t h e i s o f o r m c o m p o s i t i o n and t h e r e f o r e t h e γ g e n e e x p r e s s i o n

，

which was k e p t w i t h i n a s t r i c t l y c o n f i n e d l e v e l i n t h e n e o n a t a l p e r i o d

，

was r e n d e r e d g r a d u a l l y t o show a h i g h l y e x t e n s i v e v a r i a t i o n d u r i n g p o s t n a t a l d e v e l o p m e n t . The A γ T g e n e f r e q u e n c i e s i n t h e newborns and t h e a d u l t s were e s t i m a t e d a s 0 . 1 2 5 and 0 . 1 6 0

，

r e s p e c t i v e l y

，

and t h e v a l u e s were c o n s i s t e n t w i t h t h o s e p r e v i o u s l y r e p o r t e d f o r J a p a n e s e s u b j e c t s

，

b u t q u i t e d i f f e r e n t from t h o s e f o r C h i n e s e and A f r o ‑ a m e r i c a n s . The γisoform c o m p o s i t i o n s were a l s o s t u d i e d i n m u l t i p l e p r e g n a n c i e s . The r e s u l t s s u g g e s t e d t h e p r e s e n c e o f an " e x t e r n a l " f a c t o r a f f e c t i n g t h e e x p r e s s i o n o f t h e γglobin g e n e s and a l s o t h e p o s s i ‑ b

i1

i t y o f u s i n g t h e γisoform c o m p o s i t i o n s t o d e t e r m i n e t h e z y g o s i t y o f t w i n s

，

a l b e i t u n d e r l i m i t e d c o n d i t i o n s .

Index Terms

γchain i s o f o r m s

，

gene e x p r e s s i o n

，

Hb s w i t c h i n g

，

Hb F

，

z y g o s i t y o f t w i n s

まえおき

出生時に血中ヘモグロビン (Hb)の約

8 0

%を占める胎

児ヘモグロビン (HbF)は，生後急速に減少し，一年後には

1%

以下となり生涯このレベノレを維持する.Hb

F

は ι鎖と y鎖から成るが

( a 2 γ ' 2 ) ， 1 9 6 8

年

S c h r o e d e r

ら

) 1

に

(2)

より，

y

鎖には

N

末から

1 3 6

番目が

Gly

の

G γ

鎖と，

Ala

である

Ay

鎖のあることが報告された.その後

R i c c o

ら

2 )

により，更に

A γ

鎖には

N

末から

7 5

番目がIl

e

の場合と

Thr

の場合，すなわち

A γ 1

鎖と

A y T

鎖のあることが見出された.したがって，

y

鎖には

3

種の異型体(i

s o f o r m )

，

G y ( 1 3 6 Gly

，

7 5

Il巴)，

A y I

(1

3 6 Ala

，

7 5

Il

e )

および

A γ T ( 1 3 6 Ala

，

7 5 Thr)

が存在することになる.

G y

鎖と

A γ

鎖の存在比は生後しだいに変化し，新生児期における

7: 3

から正常成人での

2 3 3)

へと有意に移行することが観察されている.

しかしながら，正常成人血にはごく微量(1%以下〉しか

HbF

が存在しないため，その十分量を分離することがきわめて困難である.そのため，従来サラセミア，鎌状赤血球症，遺伝性高

HbF

症など成人でも

HbF

含有量が比較的高い血液については

Gy

fA

y

鎖存在比について多くの報告があるものの4，明，正常成人血についての報告はごく僅かしかない

7 ) .

そこで今固まず，アノレカリ変性，半飽和硫安塩析および

CM‑Sephadex

カラムクロマトグラフィの組み合わせにより，成人血中の微量

Hb F

を高収率で単離，濃縮する方法を開発した.単離した

HbF

について，当初はシアノゲンブロマイド

(CNBr)

法による

yCB‑3

ベプタイドのアミノ酸分析川こより，

G y

，

Ay

両鎖の生後変化を追跡した.さらにその後，逆相高速液体クロマトグラフィ法

(RP‑HPLC)

により

γ

，

A y I

，

A y T

鎖の生後変化を検討した.その結果，正常なヒトでは胎児から成人への発育に伴い，

HbF

生成

(y

グロビン遺伝子発現〉の低下が起こるだけではなく，当該遺伝子の発現制御に6ゆるみ'の生ずることを明らかにした.また双生児の隣帯血についてy鎖異型体の組成を分析し，

双生児における遺伝的背景〔卵性〉と γ鎖組成との間の定量的関係を探る一方，y鎖異型体分析結果から，双生児における卵性判定が可能か否かについても検討した.

実験材料および方法

l.試料血液

新生児血は奈良県立医科大学附属病院産婦人科および聖パノレナパ病院産婦人科において，分娩時に隣帯より採血した.乳幼児血としては，奈良県立医科大学附属病院中央検査部における血液検査残余末梢血を，成人血には奈良県赤十字血液センターにおける輸血不適格

CPD

保存血および特志者よりの静脈血を用いた.いずれの場合にも，血液疾患を有するものは除外し，抗凝固剤としてはヘパリンを用いた.

2 . Hb

試料の調製

血液は冷

0.9%NaCl

で

3

回洗浄後，等量の脱イオン

水と1/

2

倍量のトノレエンを加えて振還し，溶血させた.

さらに冷却遠沈(1

2

，

0 0 0rpm

，

2 0

分，

0 ' C )

によっては

roma

を除去し，澄明な

Hb

溶液を得た.溶液には

CO

を通気して

HbCO

溶液とし，使用するまで低温保存した

( 4 ' C ) .

3 .

正常成人血からの

HbF

分離

成人血から約

1 0

%の

HbCO

溶液を作製し，これに

5 N NaOH

を

1/10

量スターラーで援持しながら加え，

2 0 ' C

で

2

分間アルカノレ変性を行う. この段階で，溶液中にあるほとんどの

HbA

は変性する.

2

分後，

0 . 2 3 3 N HCl

を含む半飽和硫安溶液をl.

9 5

倍量加えて中和塩析し，変性

Hb

を鴻紙

(ToyoNo

7)漏過，または冷却遠沈

( 1 5

，

0 0 0rpm

，

2 0

分，

0 ' C )

して除去した.この溶液〔または上清〉を

V i s k i n g

チューブに移し，

CO

飽和した冷却脱イオン水に対し一夜透析し，さらにコロジオンパック

( S a r t o r i u s )

で限外編過濃縮した.

以上の操作により

RP‑HPLC

分析に十分な

HbF

含量となるが，さらに

HbF

含量を増す必要のある時には，

Enoki

らの方法川こより，

0 . 0 4 M NaCI‑0.05 M

リン酸緩衝液で平衡した

C M‑Sephadex C‑50(Pharmacia)

カラムを用い，塩勾配溶出により

Hb F

画分を分離した.

Hb

F回分は上述のように透析，濃縮して用いた.

4 .

新生児血および乳幼児血からの

Hb F

の分離これらの場合，

HbF

含量は十分高いので，上記

Enoki

らの

C M‑Sephadex

クロマト法

8 )

により

HbF

画分を分離した.

5 γCB‑3

法による

γ

鎖異型体の定量

Hb F

溶液から，

‑20'C

下に塩酸ーアセトン法川こよりグロビンを調製した.

Nute

らの方法

1 0 ) 0

こよりグロビンはそのまま

7 0

%ギ酸に溶かし，グロピンと等量の

CNBr

を室温下

1 6

時間反応させた.反応生成物を凍結乾燥後，

1 %

ギ酸に溶かし

( 4 0mg/m

1)，同溶液で平衡させた

Sephad

巴

x G ー 7 5(Pharmacia)

カラム(1

x180 cm

を直列

2

連一連結〕に添加し，展開分離した

( F i g .5 ) .

溶出した

yCB‑3

画分を集め凍結乾燥後，

6 N HCl

，

1 1 0 ' C

で

2 4

時間加水分解し，目立

KLA‑3B

型アミノ酸分析計で分析

し

T

こ.

6 . RP‑HPLC

法による

γ

鎖組成の分析

c o

型で冷蔵保存した

Hb

溶液に，

O 2

を通気しながら光を照射して

oxy

型として(

4 ' c

，)

M i l l i p o r e

フィノレター

(SJHV0 0 4 NS

，子

L

径

0.45μm)

で漏過，試料とした.

ふつう

250μg(2.5%

，叩

1 0 μ

1)の

Hb

を分析に使用した.

RP‑HPLC

法は

H u ω l i s m a n

らの方法

HPLC LC

一

4A

装置により行つた.カラムは

Bondapak

王

C' 8

^〆^〔^羽

7 匂 a t

民

e r s

，

4 . 6 x 2 5 0 mm)

を，溶媒は，

(A)

:アセトニ

(3)

生後発育に伴う胎児ヘモグロビンy鎖異型体組成の変化について

トリル/メタノーノレ/!リン酸緩衝液

( 4 9m M KH

，

PO. ー

の残存が多くなり，また長過ぎると

HbF

の収率が低下

5 . 4 m M H 3 PO.

，

pH 2 . 8 4 ) ( 5 3 / 5 / 4 5

，

v / v )

，

( B )

アセするため，以下の実験では

2

分間とした.

トニトリノレ/メタノーノレ/リン酸緩衝液

( 4 9m M K H

，

PO.

次にアルカリ変性処理に供する

Hb

溶液量の影響をみ

‑5.4 m M H 3 PO.

，

pH 2 . 8 4 ) ( 3 8 / 9 . 5 / 5 2 . 5

，

v / v )

，

( C ) :

るため，

Hb

溶液量を最大

50ml

から最少

1ml

まで変化アセトニトリノレ

/H

，

O ( 5 0 / 5 0 )

を使用した.溶媒

( C )

は，毎させ，

y鎖組成比を同様比較したのが Table1

である.

分析後のカラム洗浄に用いた.まずカラムを溶媒

A/B

試料としては，正常成人で

G γ

鎖と

A y '

鎖をほぼ等量に合

( 2 0 / 8 0 )

で

3 0

分間平衡した後，サンフ。ルを

Hamilton

マむ試料溶液と，

3

種の

γ

鎖をそれぞれもつ試料溶液を用イクロシリンジで注入し，最初の

1 0

分は

i s o c r a t i c

溶い，アノレカリ変性塩析法により得た試料を

RP‑HPLC

出，ついで

1 3 4

分後に

A/B(63/37)

となるよう直線勾配

溶出を行った

( F i g .7 ) .

溶出流速はl.

5m l / min

，溶出液の吸光度は

2 2 0nm

で測定，連続記録した

( F i g .7 ) . 3

種の

γ

異型体%は，島津

F

ロマトパック

(C‑R1 B d a t a p r o c e s s o r )

で計算した.

7 .

血液

HbF

含量の測定

HbF

含量の高い隣帯血，新生児血，および乳幼児血は J

o n x i s ‑V i s s e r

法

1

川こより，

Hb F

含量が

1 0

%以下の幼児および成人血については

Betke

らの方法

1

内こより行った.

8 . 0

，平衡測定および電気泳動

セノレ付きトノメータを用い，榎の分光学的方法

1 3 )

により測定した.電気泳動は，デンプン・ゲルを担体とする

S m i t h i e s

の方法

' 4 )

にほぼ準じ，

Tris‑EDTA

ホウ酸緩衝液

(pH8 . 6 )

およびギ酸緩衝液

(pH 1 . 9 ) 1 5 )

下に行った.

試薬類は市販特級

( N a c a l a iTesque)

を用い，特に

RP

‑HPLC

用には高速液クロ用規格品を使用した.

9 .

統計処理

有意差検定は

u n p a i r e dt

ー検定を用い，

p<0.05

を以て有意と判定した.

結果 1 成人血中微量

Hb

Fの分離濃縮について

成人血中で微量にしか存在しない

Hb F

のy鎖組成を分析するためには，試料中の

HbF

含量を増す必要がある. この目的のため，アノレカリ変性一硫安塩析法の組み合ぜについて検討した.

まずアノレカリ変性過程において，処理時間がy鎖組成にどのような影響を与えるかを見たのが

F i g .1

である.

3

種の

y

鎖

(GγAγ

，

A γ T )

から成る

HbF

をもっ成人血の

1 0% HbCO

溶液について，変性時間を

3 0

秒から

3

分まで変化させ，組成比に変化がみられるか否かを

RP‑

HPLC

分析により比較した.図からわかるように，アルカリ変性処理時聞による影響は少なくとも

3

分以内ではみられず，この結果から各

3

種γ鎖のアルカリに対する感受性は，少なくとも今回の処理時間内では同じである

ことが判明した.変性時間は，余り短か過ぎると

Hb A

( 4 9

1)

60

Aγl

て

o

40 O、

ド.

20

^ハHハU

fγ

ロ

O

2 3

Denαturation Time ( m i n . ) F i g . 1 . The

y

i s o f o r m c o m p o s i t i o n o f Hb F i s o l a t e d

from normal a d u l t h e m o l y s a t e by a l k a l i d e n a t u r a t i o n ( 2 0 ' C ) f o r v a r i o u s d u r a t i o n o f t i m e . Sample: 10gHb/dl‑10m

l.

Tabl 巴1.P e r c e n t a g e s o f t h e y ‑ c h a i n i s o f o r m s o f Hb F e n r i c h

巴

dby a l k a l i d e n a t u r a t i o n ‑ s a l t i n g o u t o f normal a d u l t h e m o l y s a t e . S t a r t i n g volume o f t h e hemolysat

巴

wasv a r i e d S a m p l e 1 S a m p l e 2

b)

V o

.l

(m

I)

G y( % ) A y ' ( % ) V o

.l

(m

I)

A γ T ( % ) G y( % ) A y ' ( % ) 5 0 5 2

目

5 4 7 . 5 5 0 2 0 . 4 1 7 . 3 6 2 . 3 1 0 5

l.

9 4 8 . 2 1 0 2 0 . 8 1 5 . 3 6 3 . 9 5 5 4

目

9 4 5 . 1 5 2 0

目

3 1 6 . 0 6 3 . 7 2 5 2 . 6 4 7 . 4 2 2 0 . 3 1 5 . 7 6 4 . 0

1 " ) 5 6

^目

9 4 3 . 1 2 0 . 0 1 3 . 9 6 6 . 2 A v e r a g e 5 3 . 8 4 6 . 3 A v e r a g e 2 0 . 4 1 5 . 6 6 4 . 0

土

SD

l.

9

l.

9

土

SD 0 . 3 1

目

1 I

^目

3 5 0 ‑ C M S ' ) 5 1 . 9 4 8 . 2 5 0 一 CMS 2 0 . 6 1 7 . 6 6 1

^目

8 a ; S e d i m e n t was w a s h e d w i t h a n a p p r o p r i a t 巴 a m o u n to f

5 0 % ‑ s a t u r a t e d CNH.)

，

S O . . b; S e d i m e n t s w e r e w a s h e d

w i t h 1 m l o f 5 0 % ‑ s a t u r a t e d CNH

4

) 2 S 0 . p e r 1 ml o f s a m p l e .

c ; F u r t h e r e n r i c h e d by CM‑Sephadex c h r o m a t o g r a p h y .

(4)

分析した.表から明らかなように，試料溶液量により結

Fig.2

は隣帯溶血液，成人溶血液，アルカリ変性一塩析果に差はなく，最少

1ml

でも充分分析できることがわ法によって得られた成人

HbF

襟品，さらに

CM‑

かった.なお，アノレカリ変性塩析法の後，さらに

CM‑ Sephadex

!7ロマトグラフィを組み合わせて得た純化成

S

巴

phadex

クロマトグラフィにより標品中の日

bF

含量人

HbF

標品を泳動し，

Amido B l ack 1 0 B

染色した結を上げても，結果には全く影響がなかった. 果である.アノレカリ変性一塩析法に加え，カラムクロマ以上の結果から，正常成人血中に微量存在する

HbF

トグラフィを組み合わせることにより，成人血中の

Hb

の濃度を増す方法として，アルカリ変性

(2

分〕一硫安塩主成分である

HbA

は完全に除去できることがわかる.

析法はきわめて有用であることが結論される

Fig.3

は，成人溶血液，およびその溶血液からアノレカ

2 .

成人血中

HbF

の諸特性リ変性塩析ーカラムグロマト法の組み合わせで得られ次に，上記の方法により成人血から得られた

HbF

標た

HbF

画分と，別途に得た

HbA

画分の紫外部吸収ス品について，その諸特性を検討した.まず

Tris‑EDT A‑

ベクトノレを示す.

HbF

画分には， γ鎖の分光特性であるホウ酸緩衝液

(pH8 . 6 )

およびキ守酸緩衝液

(pH 1 . 9 )

によ

2 9 0 nm

を中心としたいわゆる

t r y p t o p h a n f i n e s t r u c

^勾るデンプン・ゲノレ電気泳動特性をみた.ギ酸緩衝液下の

t u r

巴

band

が明らかに認められる.

泳動により，

Hb

はその構成サプユニットに解裂する

1 5 ) .

ついで

O 2

平衡特性を見るため，隣帯血および成人血よ

F i g

^目

2 .Enrichment o f Hb F i n normal a d u l t h e m o l y s a t e a s shown by s t a r c h g e l e l e c t r o ‑ p h o r e s i s . Top: f o r m a t e b u f f e r s y s t

巴

m (pH 1 . 9 ) ， boUom

^目

0.04M T r i s ‑EDT A ‑ b o r a t e b u f f e r s y s t

巴

m(pH 8 . 6 ) ， Amido Black 10B s t a i n . ( a ) c o r d h e m o l y s a t e

， (b)

a d u l t h e m o l y s a t e t r

巴

a t e dby a l k a l i d e n a t u r a t i o n s a l t i n g out‑CM Sephad

四

chromatography ， ( c ) a d u l t h e m o l y s a t

巴

t r e a t

巴

d by a l k a l i denaturation‑salting out ， ( d ) adult h e m o l y s a t

巴目

り得た

HbF

溶液について，

Bohr

効果

(pH 6~8.5) と

1 .

0 0 . 8

0 g 0 . 6

.

o

.0

』

O

(/)

」コ

《

0 . 4

260 280 300

Wave Length (nm)

F i g . 3 . Enrichment o f Hb F i n normal a d u l t

hemolysate a s shown by u l t r a v i o l e t

s p e c t r o s c o p y

^目

0 . 1M p o t a s s i u m p h o s p h a t e

b u f f e r (pH 7 . 0 ) . ( a ) : a d u l t h e m o l y s a t e ，

(b) :

Hb Ao from a d u l t h e m o l y s a t e

，

( c ) : Hb F i s o

l a t e d from a d u l t h e m o l y s a t e by a l k a l i

d e n a t u r a t i o n ‑ s a l t i n g o u t

一

CM Sephadex

chromatography

(5)

生後発育に伴う胎児ヘモグロビンy鎖異型体組成の変化について

( 4 9 3 ) DPG

効果を比較してみた.

F i g . 4 ‑ a

は

Bohr

効果を

0 . 1

M

リン酸カリウム緩衝液下

( 2 0 ' C )

にみたもので，両

Hb F

聞で全くアルカリ性

Bohr

効果に差はみられず，また

Hb A

に比較しても全く差がみられなかった.

F i g . 4 ‑ b

は

DPG

効果を

0 . 0 5M B i s T r i s ‑ 0 . 1 M CI‑(pH 7 . 3 )

，

2 0 ' C

下にみたもので，

HbA

に比し明らかに

DPG

効果の減弱を認めたものの，両

HbF

間に差はみられなかった.

3 . y

鎖組成の生後変化について 1)

γCB‑3

法による結果

F i g . 5

に

CNBr

処理

16)

した

Hb F

グロピンを

Sepbad

巴

xG‑75

カラムによってゲル漏過クロマトした

。

ぜ

3 a

1 . 0

宮

0 . 5 ( 0)

結果を示す.

HbF

を構成する

a

，

γ

鎖にはそれぞれ

Met 0

残基が

2

個ずつ存在し，したがって

CNBr

処理によって両鎖それぞれについて

3

個のベプタイドが生ずるはずである.

1 x 1 8 0 cm

カラムの直列

3

連一連結により，これら

6

個のベプタイドはほぼ完全に分離溶出するが

( F i g . 5 ‑ b )

，目的とする

yCB‑3

ベプタイドの分離には，

2

連カラムで十分その目的を達しうることがわかる

( F i g .5 ‑ a ) .

したがって，以下の実験では，全て

1x180 cm

カラムの直列

2

連連結によりベプタイド分離を行った.

Tabl

巴

2

に，それぞれ麟帯血由来

( n

ニ

1 0 )

および成人血由来

(n=15)HbF

から分離した

yCB‑3

ベプタイドのアミノ酸分析結果を示す

.γCB‑3

ベプタイドのアミノ酸配列は，

Val‑Thr‑GIy(or A l a ) ‑Val‑Ala ‑ S e r ‑Ala ‑Leu‑Ser‑ 140

S e r ‑Arg‑Tyr‑H i s

であるから，以下に論ずる

1 3 6Gly

および

1 3 6Ala

残基を除き，アミノ酸組成の実測値は予想値と実験誤差内でよく一致している.換言すれば，

yCB‑3

ベプタイドの分離は完全であると結論することができる.

Table 3

に，正常成人血

(n=2

1)および新生児血

(n=

1 0 )

中の

HbF

含量，および，それぞれから調製した

Hb F

の

γCB‑3

ベプタイドにおける

Gly

，

Ala

値，および

( G l y 十 A l a )

値を一括表示した.

S c h r o e d e r

ら刊こよって明らかにされたように，

γ

鎖には

Gly

残基が

1

個

(y 1 3 6 )

と

Ala

残基が

2

個

(γ138

，

y 1 4 0 )

含まれる場合(す

7 . 0

pH ⁸ ^. ⁰

Fig.4

^目

Oxyg

巴

n a t i o np r o p e r t i e s o f Hb F i s o l a t e d from a d u l t and newborn b l o o d

^目

( a )Bohr e f f e c t s i n 0 . 1 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e . S o l i d l i n

巴

r e p r

巴‑

s e n t s t h

巴

r

巴

s u l tf o r Hb A . ( b ) DPG e f f

巴

c t si n 0 . 0 5 M B i s T r i s ‑ 0 . 1 M C I ‑(pH 7 . 3 )

^目 0;

HbF from newborn b l o o d

，・;

Hb F from a d u l t b l o o d

，口

HbA . [ H b ] : 4.5X

lQ

‑5M

，

2 0 . 0 ' C . P

^{回目}

oxygen t e n s i o n f o r h a l f ‑ o x y g e n a t i o n

( t o r r ) .

なわち

G γ

鎖〉と，

Gly

残基がO個で

Ala

残基が

3

個

( y

比が約

7/3

であるのに対し，成人血では約

3/7

と全く

1 3 6

，

y 1 3 8

，

γ140)

の場合〔すなわち

A γ

鎖〕の

2

通りがあ逆転していることがわかる.なお，ここで胎児血

G γ

鎖がる.したがって，

(Gly+Ala)

値は常に

3

となるはずで，比較的狭い範囲の変動

( 6 5 ‑ 8 1

%)しか示さないのに対し，

このことは

Table3

に示した結果からも実証できる(す成人血ではきわめて大きな変動

(9‑ 6 5

%)を示す事実がなわち，成人

HbF

では

3 . 0 9 土 0 . 0 4

，新生児では

3 . 0 5 : ! :

注目される.

0 . 0 5 ) .

当然のことながら，

γ136Ala

値は，総

Ala

値か

F i g . 6

は，生後

1 8 0

日未満の健常乳幼児血

2 8

例につら

2

をヲ￨いた値になる.また，このようにして得られたいて，向上の如く測定，算出した

GγAγ%

および

HbF Gly

，

Ala

値はそれぞれ

G y

鎖および

A γ

鎖の存在比を示す %の生後推移を図示した結果で、ある.健常成人

2 1

例およ

ことになる.

Table 3

の結果から，胎児血で、は

G γ / A γ

鎖び健常新生児

1 0

例についての結果も，同時に示してあ

(6)

1 . 2

0.8

E

c O

記

⁰

.4

。 ω

c 。

D

d

O

0

.4

O

a

2 columns

b

3 columns

40 80 1 2 0 160 200

Tube Number

Fig.5

目

S e p a r a t i o n o f p e p t i d e s from CNBr‑treated g l o b i n F(60mg) on S

巴

phadexG‑75 c o l u m n s . Two ( a ) o r t h r e e

(b)

columns o f 1 x 180cm each i n s e r i e s were d e v e l o p e d with 1 % f o r m i c a c i d . yCB‑3 p e p t i d e comprisesγ134Val‑147His r e s i d u e s .

Table 2 . Amino a c i d c o m p o s i t i o n o f γCB‑3 p

巴

p t i d e

型

4

例川および再生不良性貧血

l

例からの

HbF

についても，同様に

yCB‑3

ベプタイドの

Gly

値を測定してみた.いずれも生後 4年以降の成年であるにかかわらず，

それぞれ

0 . 7 3

，

0 . 7 4

，

0 . 6 8

，

0 . 6 1

，

0 . 5 8

となり

γ

鎖は新生児レベルにあった.

i s o l a t e d from Hb F i n normal c o r d and a d u l t h e m o l y s a t e s

Amino a c i d C o r d A d u l t

A n t i c i p a t e d ( n ニ 1 0 ) ( n ニ 1 5 )

HIS 0 . 9 8

土

0 . 0 2 0 . 9 8

土.0

. 0 3 ARG 0 . 9 4 士 0 . 0 7 0 . 9 4 士 0 . 0 4 THR

キ l.

0 0

土

0 . 0 5 0 . 9 8

土

0 . 0 2

SER* 3 . 1 7 : : 1 = 0 . 1 0 3 . 0 3

土

0 . 0 6 3 GLY 0 . 7 2

土

0 . 0 5 0 . 3 2 士 0 . 1 8

ALA 2 . 3 3

土

0 . 0 5 2 . 7 6

土

0 . 1 9

VAL

l.

9 4 士 0 . 1 2 2 . 0 2 士 0 . 0 8 2 LEU

l.

0 1

土

0 . 0 2

l.

0

1::1=

0 . 0 2

TYR 0 . 9 1 士 0 . 0 3 0 . 9 4 士 0 . 0 2

* :

C o r r e c t e d v a l u e s f r o m t h e 2 4 h ‑ h y d r o l y s i s r e s u l t s

2 ) RP‑HPLC

法による結果

先に述べた

γCB‑3

法は，

G y

鎖と

A γ

鎖の

2

種しか分離定量することができない上，分析に要する血液量も正常成人では約

200ml

，また全操作完了に数日を要する.

一方，

RP‑HPLC

法では，

Ay

鎖を更に

A y I ( 1 3 6Ala

，

7 5 I l e )

，

A γ T ( 1 3 6 Ala

，

7 5 Thr)

鎖に分離定量することができ

( F i g

^目

7 )

，かっ正常成人の場合でも血液量が最少約

1ml

で分析可能であった

(Table

1).

F i g . 8

は新生児

1 0 0

名，生後

l

年までの乳幼児

2 6 9

名，成人

1 0 0

名

(16‑55

歳〉にる.

HbF%

の低下と平行して，

G

y%の低下と

Aγ%

の上ついて，

G y

鎖%と

HbF %

の推移を示したものである.

昇が起こり，やがて上述した

G y / A γ

鎖比の逆転に至る時乳幼児については，一ヶ月毎に平均値と標準偏差を算出閉経過がよく理解できる.なお，

HbF

を種々の程度の高し，成人については，年齢が

1 6

才から

5 5

才までの広範レベノレ

(3.0‑66.9

%)にもつ体質性再生不良貧血のー異聞の結果を，

2 0

年毎に一括して示した.

Hb F

は新生児

(7)

生後発育に伴う胎児ヘモグロビン Y鎖異型体組成の変化について

( 4 9 5 )

Table 3 . Numbers o f g I y c y I and a l a n y I r e s i d u e s i n y CB‑3 p e p t i d e s from Hb F i n a d u l t and newborn bood A d u l t b l o o d Newborn b l o o d

S a m p l e N o . Hb F ( % ) ' 1 G l y Ala G l y 十 Ala S a m p l e N o . Hb F (%)bl G l y Ala G l y 十 Ala 2 . 3 0 0 . 2 4 2 . 8 4 3 . 0 8

l

8 9 . 5 0 . 8 1 2 . 2 7 3 目 0 8 2 0 . 3 7 0 . 1 5 2 . 8 3 2 . 9 8 2 8 0 . 9 0 . 7 8 2 . 2 0 2 . 9 8 3 0 . 5 6 0 . 5 1 2 . 5 1 3 . 0 2 3 7 2 . 4 0 . 7 4 2 . 3 5 3 . 0 9 4 0 . 4 1 0 . 3 3 2 . 7 7 3 . 1 0 4 8

l.

3 0 . 6 9 2 . 3 5 3 . 0 4 5 0 . 3 7 0 . 6 0 2 . 5 0 3 . 1 0 5 7 8 目 2 0 . 6 5 2 . 3 5 3 . 0 0 6 0 . 4 3 0 . 4 6 2 . 6 2 3 . 0 8 6 7 8 . 5 0 . 7 0 2 . 3 7 3 . 0 7 7 0 . 4 0 0 . 1 3 2 . 9 7 3 . 1 0 7 8 5 . 1 目。 7 9 2 . 3 6 3 . 1 5 8 0 . 5 0 0 . 3 7 2 . 7 1 3 . 0 8 8 9

l.

2 ^。 . 6 9 2 . 3 1 3 . 0 0 0 . 2 8 0 . 0 9 3 . 0 1 3 . 1 0 9 8 8 目 5 0 . 6 9 2 . 3 2 3 . 0 1 1 0 0 . 3 6 0 . 5 2 2 . 5 6 3 . 0 8 1 0 7 4 . 1 0 . 6 9 2 . 3 7 3 . 0 6 1 1 0 . 3 2 0 . 4 3 2 . 6 7 3 . 1 0 Mean 8

l.

9 7 0 . 7 2 2 . 3 3 3 . 0 5 1 2 0

.4

4 ^目 ^。 0 9 3 . 0 0 3 . 0 9

_士

S . D . 6 . 1 0 . 0 5 0 . 0 5 0 . 0 5 1 3 0 . 1 7 0 . 1 3 3 . 0 3 3 . 1 6

1 4

l.

0 7 0 . 6 3 2 . 4 5 3 . 0 8 a ; by t h e method o f B e t k e e t a

l.

^l ^l ¹ 1 5 0 . 2 7 ^目 ^。 1 7 2 . 8 9 3 . 0 6 b ; by t h e method o f J o n x i s and V i s s e r 同

1 6 0 . 3 4 0 . 1 2 2 . 9 8 3 . 1 0 1 7 。 . 2 2 0 . 1 1 2 . 9 7 3 . 0 8 1 8 0 . 2 2 0 . 1 0 3 目。。 3 目 1 0 1 9 0 . 1 2 0 . 2 0 2 . 9 1 3 . 1 1 2 0 0 . 1 3 0 . 1 7 2 . 9 8 3 . 1 5 2 1 0 . 1 3 0 . 1 0 2 . 9 5 3 . 0 5 Mean 0

.4

5 0 . 2 7 2 . 8 2 3 目 0 9

士

S . D . 0 . 4 6 0 . 1 8 0 . 1 9 0 . 0 4

期には，総

Hb

のほぼ

8 0

%を占めるが，生後

4ヶ月まで

少する生後

1日目から 4ヶ月までの乳児における両者の

に急速に減少し，その後は徐々に成人値(平均)

0 . 5

%に相関をみるに(

F i g .9 ‑ a )

，両者聞には明かな相関があっ近づく.一方G

γ

鎖%は，新生児期には約

7 0

%であるが，た(r=0.68，

n ニ 1 5 5 ) .次に，生後 4

ヶ月

(HbF%

が約

2 0 Hb F %

の変化に伴い生後

4‑5

ヶ月までに急速に低下 %以下〕から I年までの期間についてみると，

γ=

して約

4 0

%となり，生後

1

年まではほぼこの値を維持す

0.16(n=133)

と両者聞にはほとんど相関はない(

F i g .9 ー

る.さらに注目されるのは，すでに

γCB‑3

法による結果

b ) .以上の事実は，生後 HbF

生成が急速に減少し

HbA

でもみたように(

F i g .6

，

Table 3

)，生後の日数経過につに置換されるのと，Ay鎖によるGy鎖の置換とはほぼ向れてG

γ

レベノレの低下だけでなく，個体差が著じるしく大時に起こること，また，

γ

鎖

(HbF)

生成が高レベルにあきくなることである

(13.3‑66.2

%).生後

l

年以降も

G γ

る時には，

yグロピン遺伝子の発現に厳密な制御が働い

レベノレの低下は徐々に進行し，しだいに成人値

2 6

%に収ているが，

γ

鎖生成が低下するときには，この制御に4ゆ飲していく.成人値についても大きな個体差がみられ，るみ'が生ずることを示唆する.

最低

5 %

から最高

6 5

%にわたって大きな変動を示した. 次に成人について，年齢と

G γ

鎖%との聞の関係をみるまた，新生児と成人における

G

y鎖分布を比較してみると，両者間には全く有意の相関がみられなかった(r=

と，前者では平均値

7 0

%を中心にごく狭い範囲でほぼ正

0 . 0 1

，

n ニ 1 0 0 ) .

すなわち，生後，

HbF

が

HbA

に置換規分布を示すのに対L，後者では全体として

2 0

%以下にされた時点では

G γ

鎖%と年齢との関連は無くなること分布範囲が低下するだけではなく，正規分布から大きながわかった.

ずれ

Oeft‑stewed)

を示した .

G

y鎖が

5 0

%を下まわる例今回，新生児血および成人血について得られた結果をは，新生児では僅か1.2%に過ぎないが，生後

1

年の乳各フェノタイプ別に分け，各

γ

遺伝子の発現%を一括表幼児では

3 9

%に増加し，成人においてはその過半(

8 8

示したのが

Table4

である.標準偏差によって，両者に

%)を占めるに至る. おける

G y

遺伝子の発現幅を比較してみると，後者におい以上の結果，生後の

HbF

消失経過と

G γ

鎖減少経過のては前者の約

4

倍に達している.また，新生児血およびよく似ていることがわかったので，生後における

HbF

成人血におけるAyT鎖%の頻度分布をみると

γ

鎖%に

%とG

γ

鎖%の相関を見てみた.まず，

HbF

が急速に減関してみられたのと同様に，新生児では分布がごく狭い

(8)

Newboms Infants Adu I t s

2 . 8

。

•

'

• . •

' ^'

^' ^:_~. • • ^. ^. ^; • • • ^•

マ

^E F:

^・

• ^.

'

. . •

' 1 ， & Z . 2 . ‑ . .

・

曽

川・ー' ・

e

ー

• •

a a

• ^•

^ー

' '

a i h : : . ^. ^. _.

_。

: :

」

• •

'

• • • ， .

• ^.

•

ー‑

^.

•

ー

.

'

• ^.

E

80 。 ^寸

^l^>

40京 2

. 4

d

2 . 0 0 . 8

O

80

〉、

0 . 4

G"l

1

4 0 ̲

ポ

<.!}

O

̲ 80

~

O

n V

4

比D

工

O O 80

¥6

0 Postnαtal Days

F i g . 6 . P o s t n a t a l c h a n g e s i n t h e p e r c e n t a g e s o f Hb F and t h e numb

巴

ro f g l y c i n e and a l a n i n

巴

r

巴

s i d u e so f theγCB‑3 p e p t i d e o f Hb F from newborns(n=10) ， i n f a n t s ( n

^ニ

2 8 )and a d u l t s ( n = 2

I).

The number o f t h

巴

r

巴

s i d u e sr

巴

p r e s e n t st h e G y and Aγ%

，

r e s p

巴

c t i v e l y . .; Normal i n d i v i d u a l s

，

0

，口，ム， ... ;

Four c a s

巴

so f a v a r i a n t o f F a n c o n i ' s anemia ¹ ⁵

>，・;

a p l a s t i c an

巴

m i a .

範囲に限局されるのに対し，成人にあっては比較的広いグノレープとして記載した.

範囲にわたって分布していた.また，

A y T

鎖の遺伝子頻度

4 .

双生児におけるγ鎖異型体組成について生体内た

( g e n e f r e q u e n c y )

を計算すると，新生児と成人でそれぞんぱくの生成は，いうまでもなく，各個体のもつ遺伝情れ

0 . 1 2 5

，

0 . 1 6 0

となった.今回分析に供した血液試料報の指令下に行われる.したがって，各個体の示す

y

鎖が，成人と新生児のちがし、はあっては，何れも同一地域異型体パターンは，それぞれのもつ遺伝基盤の反映で、あの住民集団に由来するものであることからすれば，本来るということができる.そこで，一卵性と二卵性の双生両者の値は一致するはずである. 児の場合，各個体ベア聞で

y

鎖異型体組成にどのようななお，新生児血の場合，ごく僅少ながら (n

ニ 2

，) 定量的関係がみられるか，さらにこのことから，

γ

鎖異型

Huisman

のいう

lowGy

例

18)

がみられた.当該例が，遺体の分離，定量結果に基づいて双生児の卵性決定が可能伝的に特異なグループを形成するのか，あるいは単に集か否かを検討してみた.得られた結果

( T a b l e5 )

から，一団の下限に位置する個体にすぎないのかは必ずしも定か般に一卵性双生児の場合には，ベア問で予想通り良好なでないが，ここでは

Huisman

ら

1 8 )

に従い，一応

lowGy

一致がみられたが，時に

M 1 0 ‑ 1 0 '

のように両者間で大き

(9)

( 4 9 7 )

生後発育に伴う胎児ヘモグロビンγ鎖異型体組成の変化について

P h o s p h a t e (

pH

2 . 8 4 ) 45

5 2 . 5 CH30H

5 9 . 5 Cf も CN

5 0 . 38 S o l v e n t

A

S o l v a n t B

‑ r

巳

‑ n u

r‑

‑a a‑

‑.

︐. &

I Ea n

円

‑ H U

日

p

一

• Y '

'

U内

A

'

E ' _悌

E E

﹄E

n u n u

A E

l i l

i‑

‑4

e ︐ E

﹄

J m

u g

‑ u H

T E

‑ MH

・

E J

m l ι

AH一白

H

‑

G

一

100 A ( % )

80

60 o r J .

ECONN

↑

oω οC OA LO

凶

Dd

120 160

E f f l u e n t

(ml)

Fig

^目

7 .Separation o f t h e AγT ， Gγand A y l c h a i n s by r e v e r s e d phase HPLC. Sample i s Hb F i s o l a t e d from t h e cord hemolysat

巴.

Se

巴

t e x tf o r d

巴

t a i l s

80

200

40 O

Tabl

巴

5 .Percentage o f t h e t h r e e y‑chain isoforms and Hb F % i n hemolysates o f newborn monozygotic and d i z y g o t i c twins

MONOZYGOTIC TWIN DIZYGOTIC TWIN

Hb F(出)

A y T ( % l G γ ( % 1 ' y ' (

出 ) 耳bF(出)

A y T ( % l G γ ( % 1

ザ(出)

M1 8 9 . 1 2 6 . 9 7 3 . 1

一 D l

8 2 . 4 6 7 . 4 3 2 . 6 l ' 7 7 . 9 2 6 . 8 7 3 . 2 l ' 8 4 . 3 1 2 . 5 7 0 . 8 1 6 . 7 M3 8 5 . 3 1 0 . 0 6 8 . 7 2

1.3

D8 8 5 . 9 1 3 . 3 7

l.l

1 5 . 6 M 3 ' 8

1.3

1 4 . 1 6 8 . 2 1 7 . 7 8 ' 8 5 . 7 1 3 . 2 7 2 . 5 1 4 . 3 M6 8 6

.4

6 6 . 3 3 3 . 7 D5 7 9 . 2 7 0 . 4 2 9

^目

6 6 ' 8 3 . 0 6 6 . 8 3 3

^目

5 '8 3 . 4 8 0 . 3 1 9 . 7 M 1 0 9 0 . 8 6 6 . 6 3 3 . 4 M 1 4 8 7 . 3 7 0 . 5 2 9 . 5 1 0 ' 8 9 . 8 6 9 . 8 3 0 . 2 1 4 ' 8 5 . 8 6 9 . 5 3 0 . 3 Tabl

巴

4 .The

y

chain isoform composition and t h e

AγT gene f r

巴

quency

，

f C A y T )

，

i n normal Japanese newborns and a d u l t s

A

1'

1 ( % ) f ( A

1'

T ) 3 2

.l::t

3 . 0 5 9 . 7 土 0 . 7 1 6 . 7 。

土

5 . 0 0 . 1 2 5 N 巴 wbornBlood

G

1'(%)

A

1'

T(%) 6 7 . 7

土

2 . 9 0 4 0 . 3 士 0 . 7 0 7 0 . 4 土 3 . 7 1 2 . 9 土 2

^目

2 7 3 . 1

土

0 . 1 2 6 . 9 士 0 . 1 6 7 . 8 士 5 . 1

A d u l t Blood

2 4 . 9

土

1 8 . 3 0 7 3 . 7

土

1 8 . 9 2 7 . 0

士

1 4 . 9 2 4 . 0 土 8 . 5 4 8 . 6

士

1 3 . 60 . 1 6 0 3 2 . 6 土 3 . 7 6 7 . 4 土 3 . 7 0 2 5 . 7

土

1 7

^目

2 P h e n o t y p e s n A

1"

/ G

₁_'

7 5 lowG γ 2 A

γ' / A γ T /Gγ21 A γ T / G

₁_'

2 T o t a l 1 0 0

71

2 6 3 1 0 0 A γ ' / G

₁_'

A γ' / A γ T / G

1'

A γT / G γ

T o t a l

結論を得るためには，今後さらに例数を集積して，統計的検討を加えることが必要である.なお今回，一卵性一二卵性の判定は，在来の産科学的規準(胎盤数，胎盤の循環態様，両胎児聞の隔膜等〉に基づいて行われた.この場合，実際には，時にかなり判定に苦しむ例のあったことも指摘しておかねばならない.一卵性，二卵性を通じ，

HbF%

はベア間でさまざまな変動を示した

CTable5 ) .

察

生体には，個体発生に伴い遺伝子発現に変化の生ずるものが多くみられる.Illi子一胎児一成人間で造血にみら

考

な差のみられる場合もあることがわかった.二卵性双生児にあっては，

D 1 ‑1 '

，

D 5 ‑5

'のようにベア聞で明白な差を示すもののある一方，

D 8 ‑8 '

，

D 1 4 ‑ 1 4 '

の場合のように，一卵性の場合に変らぬ良好な一致を示す例もみられた.したがって，少なくとも現時点では， D

1‑1'

のように両者間で明らかな異型体組成の差がある場合，あるいは

D 5 ‑5 '

のように両者聞に歴然とした量的差のみられる場合を除けば，y鎖異型体分析だけから卵性の判定を行うことには困難があるように思われる.最終的な

(10)

Infants Newborns

(n

・

269)

(n=IOO)

80 :; 60

0 、

ド 40

<.!J

20

80

.‑‑由旬、

ポ

60

0 4

比A工

20 O O 2 4

4 3 2

6 8 ²⁰⁴⁰

Years 10

Months

F i g . 8 . P o s t n a t a l chang

巴

si n t h e p e r c

巴

n t a g e so f Hb F and ^G

y

c h a i n o f Hb F from normal newborns(n

^二

1 0 0 ) ， i n f a n t s ( n

^二

2 6 9 )w i t h i n one y e a r a f t

巴

rb i r t h and a d u l t s ( n = 1 0 0 ) . l n d i v i d u a l p o i n t s f o r normal i n f a n t s and a d u l t s a r e means and s t a n d a r d d e v i a t i o n s a t i n t e r v a l s o f 3 0 d a y s and 2 0 y

巴

a r s ， r

巴

s p

巴

c t i v e l y .x;

P<O.Ol ， * ; P<O.OOl v s . n e w b o r n s .

れる一連の変化

1 9 )

などは，その典型的な一例である.このような発育依存変化，いわゆる

s w i t c h i n g

の分子機構については，いまだ基本的理解にはほど遠い現状にある.

ところで，造血における

s w i t c h i n g

に伴い，生成する赤血球中の

Hb

にも

s w i t c h i n g

が生じ，順次，

H

壬子日

b ( S 2 C 2

，

a 2 ε 2

，

S 2 Y 2 )

胎児

Hb(a2Y2)

成人

Hb(a2s2

，

出 2 O 2 )

が生成される

2 0 )

.したがって，

Hb s w i t c h i n g

の研究は，ひろく生体における発育依存性遺伝子発現機構の解明に好個のモデノレを提供するものといえる.

Hb s w i t c h i n g

の中，JIE子

Hb

に関するものは試料入手に難があり，従来からさほど検討の対象とはなっていない

2 1 )

胎児期の末期から成人期にかけては，胎児

Hb ( a 2 γ 2 )

から成人

Hb(a2s2)

への

s w i t c h i n g

がみられ，試料の入手し易さもあって従来から研究報告も多々ある

3

，

4

，

7 )

ところでこの場合，

Hb F

は成人期においても完全に消失するわけではなく，生涯にわたJりごく微量ながら生成し続けられる

1 2 )

.その後，

S c h r o e d e r

ら

1 ， > R i c c o

ら川こよりy鎖には

3

種の具型体のあることが見出され，さらに各異型体の発現に発育依存性変化のあることが明らかにされた

3

，

4

，

7 )

.しかしここに一つの困難は，成人血中に

Hb F

が微量しか存在せず，そのため

s w i t c h i n g

の定量的な検討が容易でないことである.その結果，正常成人に関

しては従来不十分なデータの蓄積しかない

7 ) .

今回，成人血中の微量

Hb F

を単離，濃縮する確実，

有効な方法を開発し，これを用いて上記の問題に検討を加え，従来の知見にさらに新知見を加えることができた.

1.成人血微量

Hb F

の単離，濃縮法について成人血中の微量

Hb F

を単離する方法としては，