科学研究費助成事業  研究成果報告書

岩手医科大学・薬学部・助教

科学研究費助成事業  研究成果報告書

様 式 Ｃ−１９、Ｆ−１９−１、Ｚ−１９ （共通）

機関番号：

研究種目：

課題番号：

研究課題名（和文）

研究代表者

研究課題名（英文）

交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）

３１２０１ 若手研究(B)

2017

〜 2016

プロトン輸送ATPaseを標的とする抗口腔病原細菌薬の開発

Exploitation of proton pumping ATPase inhibitors in oral cavity pathogenic  bacteria

７０５０９０３３ 研究者番号：

關谷 瑞樹（Sekiya, Mizuki）

研究期間：

１６Ｋ１８８７７

平成 ３０ 年   ５ 月 ３１ 日現在

円      3,100,000

研究成果の概要（和文）：本研究は、口腔内病原細菌におけるプロトン輸送ATPaseの役割を検討し、阻害化合物 の探索を行った。虫歯菌S.mutansの耐酸性にF型ATPaseが重要な役割を果たすこと、歯周病菌P.gingivalisにお いてA型ATPaseが栄養物の取り込みに関与する可能性を示唆した。また強力な阻害化合物を多数見出し、

curcuminのF型ATPase阻害機構を明らかにした。さらに宿主側の破骨細胞において、骨吸収に必要なタンパク質 の分泌にV型ATPaseが重要な役割を果たすこと、またその分子機構を示した。以上の結果から、プロトン輸送 ATPaseは口腔内疾患の予防・治療薬の重要な標的となり得ると考えられる。

研究成果の概要（英文）： In this study, we investigated the roles of proton pump ATPases in the  principal causative agent of human dental deseases, S. mutans and P. gingivalis.

 We suggested that F‑ATPase is an essential role in acid tolerance in S. mutans, and proton gradient  and A‑ATPase are important for the growth of P. gingivalis. We also found various inhibitors of  bacterial proton pump ATPase and suggested their inhibitory mechanism and binding sites. 

 Furthermore, we analyze the function of lysosomal proton pump V‑ATPase in mammalian osteoclast,  which associates with bone resorption in periodontal diseases. We found a novel role for the  V‑ATPase in secretory lysosome trafficking and an unexpected mechanistic link with Rab GTPases.

研究分野： 機能生化学

キーワード： プロトン輸送ATPase F‑ATPase A‑ATPase ポリフェノール Curcumin 虫歯 歯周病

  １版

様 式 Ｆ－１９－２

１．研究開始当初の背景

プロトン輸送 ATPase（H⁺-ATPase）は、ATP 加水分解のエネルギーと共役し H⁺を輸送する、

あるいは膜内外の H⁺濃度勾配により ATP を合 成する酵素である。F 型、V 型、A 型、P 型 に分類され、F、V、A 型は構造や反応機構が 類似している。F 型 ATPase は、ATPase 活性 を持つ F₁部分（α₃β₃γδε）と膜内で H⁺ 送 路を形成する F_O部分（ab₂c_10~14）からなる（図 1）。ATP の合成・分解に伴い、γεc_10~14が他 のサブユニットに対して回転するモーター であることが知られており、触媒反応はこの 回転を介して H⁺ 輸送と共役している。

H⁺-ATPase は細胞内の ATP 合成や物質輸送 等に関わるため、その阻害剤には強い殺菌・

抗菌作用が期待できる。同酵素群は生物種間 で構造は類似するがキネティクス等に相違 点が存在する。実際に F 型 ATPase を標的と する bedaquiline が抗結核薬としてアメリ カで上市されている。また、A 型 ATPase は細 菌のみが有する酵素であり、細菌特異的な阻 害薬の開発が期待できる。

口腔内には多様な微生物が存在しており、

一部の細菌はう蝕、歯周病といった感染症の 原因になっている。う蝕は Streptococcus

mutans などの虫歯菌がエナメル質などを脱

灰させ、歯を欠損させる疾患である。また、

歯周病は Porphyromonas gingivalis などの 歯周病菌によって歯周（歯肉、セメント質、

歯根膜、歯槽骨）で引き起こされる炎症疾患 である。う蝕、歯周病はいずれも歯の喪失に つながることはもちろん、全身性の疾患にも 深く関与していることが知られている。菌が 体内に進入することで感染性心内膜炎や動 脈硬化を引き起こす。したがって、口腔内病 原細菌の除菌は喫緊に取り組むべき重要な 課題である。以前より、虫歯菌や歯周病菌の 生存・増殖に H⁺-ATPase が重要な役割を果た している可能性が指摘されていた。虫歯菌の 1 種である S. mutans の低 pH における生 育に、F 型 ATPase が関与すると推定されて い た 。 ま た 歯 周 病 菌 の 1 種 で あ る P.

gingivalis は、Na⁺及び H⁺の濃度勾配を用い て細胞外からアミノ酸等の栄養素を取り込 んでおり、濃度勾配の形成には A 型 ATPase

が関与していると考えられていた。したがっ て、H⁺-ATPase の駆動機構を解明し、その特 徴を理解することは同菌類を殺菌・除菌する 薬剤を開発する手がかりになると考えた。

また、歯周病における歯槽骨の破壊は、炎 症により活性化した宿主の破骨細胞の骨吸 収により引き起こされる。V 型 ATPase はオル ガネラの酸性化に関与する酵素で破骨細胞 の骨吸収に大きな役割を果たしている。V 型 ATPase は 13 種類のサブユニットから構成さ れ、そのうち 6 種のサブユニットにイソフォ ームがある（図 2）

中でも、a3 イソフォームは破骨細胞への分 化により誘導され、骨吸収に必須であること が示されている。当研究室では、a3 イソフォ ームがプロトンポンプとして骨吸収窩の酸 性化を担うだけでなく、破骨細胞に特徴的な リソソームの局在に必須であることを見出 していた。したがって a3 イソフォームの局 在機構の解明は歯周病による歯槽骨の破壊 を予防する手がかりになると考えた。

２．研究の目的

研 究 代 表 者 は こ れ ま で に curcumin や piceatannol などのポリフェノール類が大腸 菌 H⁺-ATPase の阻害を介して抗菌作用を示す ことを見出していた（図 3）。これらの化合物 は虫歯菌や歯周病菌の H⁺-ATPase についても 阻害し、抗菌作用を示すことが期待できると 考えた。

また、大腸菌 F 型 ATPase の回転駆動機構 について、酵素一分子の動作を観察する実験 系（一分子観察系）によりキネティクスを解 析してきた。その結果、同酵素に関する重要 な知見を多く得た。酵素の触媒反応に重要な 図1 F型ATPaseのモデル図

Piceatannol Curcumin

図3 ポリフェノール類の化学構造 図2 V型ATPaseのモデル図とイソフォーム

構造部位の特定や、化合物の阻害メカニズム の解明は、特異的な阻害剤のデザインに有用 であると考えた。さらに、破骨細胞において V 型 ATPase のイソフォームやその局在に関 わる因子を発現させる実験系を確立してい る。そこで本研究課題では以下の 3 点を目的 に研究を行った。

（１）虫歯菌、及び歯周病菌の H⁺-ATPase を 精製し、阻害する低分子化合物を探索する。

また、阻害化合物の抗菌作用を評価する。

（２）H⁺-ATPase の回転を伴う駆動機構を解 析する。また、阻害化合物の阻害機構を明ら かにする。

（３）V 型 ATPase の a3 イソフォームの局在 に関わる因子を同定し、破骨細胞が骨吸収を 行う分子機構を明らかにする。

３．研究の方法

（１）S. mutans F 型 ATPase の F₁ 部分及 びP. gingivalis A 型 ATPase の A₁ 部分の 精製を検討した。P. gingivalis A 型 ATPase の A₁ 部分については精製が困難であったた め、A 型 ATPase が存在する膜画分を用いた。

ポリフェノール類を中心に、試料を添加した 際の H⁺-ATPase の活性を検討し、阻害する化 合物を探索した。また、類縁体を用いて構造 活性相関を検討し、作用のより強力な化合物 を 探 索 し た 。 同 時 に 、S. mutans、P.

ginngivalis に対する抗菌作用を評価する。

さらに、S. mutansについては pH 変化に対す る感受性を検討した。

（２）酵素の回転を一分子ずつ観察する実験 系を用いて、F 型 ATPase の阻害化合物を添加 した際の回転を観察した。阻害化合物には curcumin、及び citreoviridin を用いた。化 合物が回転に及ぼす影響を評価するととも に、酵素の各種変異体を組み合わせ、化合物 の作用部位や阻害メカニズムを検討した。さ らに、結晶構造を用いたドッキングシミュレ ーションも用いて酵素と化合物の結合様式 を推定した。

（３）V 型 a3 イソフォームのノックアウト マウスの脾臓から得られたマクロファージ を破骨細胞に分化させ、リソソームの局在を 検討し、野性型と比較した。また、オルガネ

ラの輸送に関わる Rab タンパク質を過剰発現 させた際の影響や、a3 イソフォームとの結合 を検討した。

４．研究成果

（１A）S. mutansの F 型 ATPase を阻害する 化合物の探索と抗菌作用

S. mutans の F₁ 部分に対し、curcumin、

及び piceatannol などのポリフェノール類 は ATPase 活性を強く阻害した。また、酸 性環境においても中性条件と同等の阻害作 用を示した。続いて、piceatannol、curcumin 類縁体及び各種阻害剤の S. mutans の増殖 に対する作用を検討した。中性の培地ではい ずれの阻害剤も S. mutans の増殖を抑制し なかったが、酢酸により pH を 5.3 に低下 させた培地では濃度依存的な増殖抑制作用 を示した。さらに、低 pH における S. mutans の生存率を検討したところ、ピセタノール及 びクルクミン類縁体は中性の培地では作用 しないが、pH4.3 では生存率を低下させるこ と を 明 ら か に し た 。 以 上 の 結 果 か ら 、S.

mutans の 酵素活性と耐酸性には強い相関

が認められ、F 型 ATPase は S. mutans の耐 酸性に重要な役割を果たしていると考えら れる。研究成果は、ConBio2017、薬学会年会 などの国内学会で発表した。

（１B）H⁺ATPase 阻害剤のP. gingivalis に 対する増殖抑制作用と膜 ATPase 阻害作用 イオノフォアの中でプロトノフォアであ る FCCP はP. gingivalis の増殖を抑制した。

ま た 、 A 型 ATPase 阻 害 剤 で あ る diethylstilbestrol にも強い抗菌作用が見 られた。同じスチルベン骨格を有するポリフ ェノール類（スチルベノイド）について検討 したところ、pterostilbene など強い作用を 有するスチルベノイドを見出した（図 5）。A 型 ATPase に類似した構造を持つ F 型 ATPase の各種阻害剤も検討したところ、curcumin や citreoviridin な ど の 阻 害 剤 が P.

gingivalis に対し、強い増殖抑制作用を示 した（図 6）。さらにそれらの化合物は、P.

gingivalis の膜画分の ATPase 活性を阻害 した。以上の結果から、プロトン濃度勾配と そ れ を 形 成 す る A 型 ATPase は P.

gingivalis の増殖に重要な役割を果たして いることが示唆され、歯周病の予防・治療の 標的になりうると考えられる。研究成果は、

Biochemical and Biophysical Research Communications 誌で発表した。

図4 一分子観察のモデル図 ^MeO

OMe

OH

Pterostilbene

図5 Pterostilbeneの 化学構造

（２）Citreoviridin 及び curcumin の F 型 ATPase 阻害メカニズムとα/β相互作用の重 要性

F 型 ATPase を阻害することが明らかとな っている citreoviridin 及び curcumin に ついて F₁部分における作用部位を推定する ために、結晶構造をもとにドッキングシミュ レーションを行った。その結果、両化合物と もα/βサブユニットの境界領域に結合する ことが推定された。シミュレーションから結 合への関与が推定されたβR398 に変異を導 入したところ、citreoviridin 及び curcumin の阻害作用は減弱した。この結果はシミュレ ーションによる予測が正しいことを示唆し ている。

また、citreoviridin、curcumin の存在下 で F₁の回転を解析したところ、catalytic dwell と呼ばれる反応過程が延長し、回転速 度 が 低 下 す る こ と が わ か っ た 。 Catalytic dwell に影響を与える各種変異 F₁に対する 化合物の作用を検討した結果、βサブユニッ トの構造変化に障害があるβS174F 変異体に 対して、citreociridin、curcumin は相乗的 に阻害活性を示した。このことから、両化合 物はα/βサブユニット間の相互作用を障害 することで、回転の駆動力となるβサブユニ ットの構造変化を妨げ、回転速度を低下させ ていると考えられる。

さらに、α/βサブユニット間相互作用と βサブユニットの構造変化との相関性を明 らかにすることを目的に、α/βサブユニッ ト間相互作用に重要と考えられるアミノ酸 に変異を導入した。αE402 に変異を導入し たところ、変異 F₁ の回転速度が低下した。

一方、βサブユニットの構造変化を障害する βS174F 変 異 体 と の 2 重 変 異 体 、 α Ε 402Α/βS174F F₁ は βS174F 変異体に比べ て回転速度が回復した。この結果から、α/

β相互作用が弱まることで βS174F 変異に より抑制 された β サブユニットの構造変化 がスムーズに行えるようになったと考えら れる。以上から、α/βサブユニット間相互 作用は F₁の回転に重要な役割を果たしてお り、阻害剤の標的として有用であることが示 唆 さ れ た 。 研 究 成 果 は 、 International Journal of Biological Macromolecules 誌で 発表した。

（３）V 型 ATPase a3 イソフォームのリソ ソームの輸送における重要性

野性型と V 型 ATPase a3 イソフォームノッ クアウトマウスの破骨細胞について、電子顕 微鏡等で観察した。野性型ではリソソームが 細胞膜に局在していたのに対し、a3 ノックア ウトでは、分泌リソソームの細胞膜への移動 が見られなかった。また、リソソームの移動 を開始するスイッチとして働く Rab タンパク 質を探索した結果、Rab7 が a3 イソフォーム を欠損するとリソソームに局在できなくな ることを明らかにした。さらに V 型 ATPase は a3 イソフォーム選択的に Rab7 の GDP 型 と結合することも見出した。

これらのことから、リソソームに存在する V 型 ATPase は、a3 イソフォームが Rab7 と結 合することで Rab7 をリソソームに回収し、

リソソームの移動を開始することが示唆さ れた。研究成果は、Scientific Reports 誌で 発表した。

50 100

0 20 40

Concentration (µM)

Growth of P. gingivalis(%)

Cucumin Pterostilbene

図6 ポリフェノール類の

P. gingivalisに_{対する増殖抑制作用}

βR398!

βR398!

Citreoviridin – E. coli β

Curcumin – E. coli β

図7 CitreoviridinとcitreoviridinのE. coli F1 βサブユニット推定結合部位

（Sekiya et al, Int. J. Biol. Macromol. 99 (2017) 615-621より転載）

５．主な発表論文等

（研究代表者は下線）

〔雑誌論文〕（計 3 件）

1. Sekiya, M., Sakamoto, Y., Futai, M., Nakanishi-Matsui, M.: Role of α/β interface in F₁ ATPase rotational catalysis probed by inhibitors and mutation. Int. J. Biol. Macromol. 99 (2017) 615-621

2 Sekiya, M., Shimoyama, Y., Ishikawa, T., Sasaki, M., Futai, M., Nakanishi-Matsui, M.: Porphyromonas gingivalis is highly sensitive to inhibitors of a proton-pumping ATPase.

Biochem. Biophys. Res. Commun., 498, (2018) 837-841

3. Matsumoto N., Sekiya M., Tohyama K., Ishiyama-Matsuura E., Sun-Wada G.H., Wada Y., Futai M., Nakanishi-Matsui M.:

Essential Role of the a3 Isoform of V-ATPase in Secretory Lysosome Trafficking via Rab7 Recruitment. Sci. Rep.

(2018) doi: 10.1038/s41598-018-24918-7

〔学会発表〕（計 6 件）

1. 松元奈緒美、關谷瑞樹、遠山稿二郎、

孫（和田）戈虹、和田洋、二井將光、中西（松 井）真弓：破骨細胞に特徴的なリソソームの 局在における V-ATPase a3 イソフォームの関 与（第 89 回日本生化学会大会、仙台、2016 年 9 月 26 日）

2. 關谷瑞樹、山野辺春香、千葉瑛子、

佐藤桃恵、河野富一、大橋暁香、小川智、山 越博幸、岩渕俊治、二井將光、中西（松井）

真弓：F₁-ATPase の回転触媒機構に置けるα/

β相互作用の役割（第 89 回日本生化学会大 会、仙台、2016 年 9 月 27 日）

3. 泉澤信太郎、關谷瑞樹、櫛桁安生、

芳賀雅人、下山佑、木村重信、佐々木由香、

岩本昌子、中西（松井）真弓：プロトン輸送 ATPase を標的とした抗う蝕化合物の探索（日 本薬学会第 137 年会、仙台、2017 年 3 月 26 日）

4. 關谷瑞樹、泉澤信太郎、櫛桁安生、

芳賀雅人、下山佑、佐々木実、木村重信、佐々 木 由 香 、 岩 本 昌 子 、 中 西 （ 松 井 ） 真 弓 ： Streptococcus mutans の 耐 酸 性 に お け る F-ATPase の重要性（ConBio2017、神戸、2017 年 12 月 7 日）

5. 關谷瑞樹、泉澤信太郎、櫛桁安生、

芳賀雅人、下山佑、佐々木実、木村重信、佐々 木由香、岩本昌子、中西（松井）真弓：プロ ト ン 輸 送 ATPase 阻 害 剤 は 虫 歯 菌 Streptococcus mutansの耐酸性を低下させる

（日本薬学会第 138 年会、金沢、2018 年 3 月 27 日）

6. 松元奈緒美、關谷瑞樹、中西（松井）

真弓：破骨細胞における分泌リソソームの局 在に対する V-ATPase 阻害剤（バフィロマイ シン A1）の影響（日本薬学会第 138 年会、金 沢、2018 年 3 月 27 日）

〔図書〕（計 0 件）

〔産業財産権〕

○出願状況（計 0 件）

名称：

発明者：

権利者：

種類：

番号：

出願年月日：

国内外の別：

○取得状況（計 0 件）

名称：

発明者：

権利者：

種類：

番号：

出願年月日：

取得年月日：

国内外の別：

〔その他〕

新聞掲載：骨粗鬆症治療に期待 岩手医大チ ームが研究成果

朝日新聞（2018 年 5 月 9 日）

河北新報（2018 年 5 月 1 日）

岩手日報（2018 年 5 月 8 日）

図8 V型ATPase a3 イソフォーム選択的 なRab7との結合

HEK293T細胞にFLAG-aとV5-Rabを発現 させ、抗 FLAG 抗体で免疫沈降を行った。

W:野性型、D:GDP型、C:GTP型。

（Matsumoto et al, Sci. Rep. (2018) doi:

10.1038/s41598-018-24918-7より転載）

ホームページ：プレスリリース 平成 30 年 5 月 1 日 骨粗鬆症など骨代謝異常症の治療 につながる骨吸収のメカニズムを解明

（http://www.iwate-med.ac.jp/wp-content /uploads/20180501.pdf）

６．研究組織 (1)研究代表者 研究代表者

關谷 瑞樹（SEKIYA, Mizuki） 岩手医科大学・薬学部・助教

研究者番号： 70509033

(2)研究協力者

〔主たる渡航先の主たる海外共同研究者〕

〔その他の研究協力者〕

岩本昌子准教授（長浜バイオ大学・バイオサ イエンス学部）

佐々木実教授（岩手医科大学・歯学部）

阪本泰光准教授（岩手医科大学・薬学部）