PepNovo と PEAKS を用いた de novo ペプチド配列 解析

PepNovo と PEAKS を用いた de novo ペプチド配列 解析

著者 磯野 直人, 柳原 和典, 小林 裕子, 小林 一成, 久 松 眞

雑誌名 三重大学大学院生物資源学研究科紀要

巻 37

ページ 79‑85

発行年 2011‑02‑01

その他のタイトル De novo peptide sequencing by PepNovo and PEAKS

URL http://hdl.handle.net/10076/11524

は じ め に

近年，質量分析法の発展やゲノム解析の進歩に より，ペプチドマスフィンガープリンティング

（PMF ）法や MS/ MS イオンサーチ法を用いて，

タンパク質を簡単に同定できるようになった。し かし，これらはゲノムデータベースや ESTデー タベースなどが整備された生物種に限り有効な実 験手法である。データベースを利用せずにアミノ 酸配列を決定する方法として，タンデム質量分析 装置を用いた

ペプチド配列解析法（denovo pepti desequenci ng ）がある

。これはペプチドイ オンの開裂によって生じた生成イオンのスペクト ル（MS/ MS スペクトル）から数学的演算により アミノ酸配列を算出する技術である。 通常，

MS/ MS スペクトル中には多くのピークが観察さ

れる。例えば， 10 残基程度のペプチドの場合，

明瞭なピークだけでも数十本あることが多く，さ らに多数のノイズが見られる。そのため，マニュ アル操作で構造未知のペプチドのアミノ酸配列を 正確に決定するのはほとんど不可能であると考え られる。最近，AUDENS,Lutef i sk,NovoHMM, PepNovo,PEAKS をはじめとする，多くの優れ た

ペプチド配列解析用のアルゴリズム

（プログラム）が考案された

。現在では，これ らのプログラムを利用したアミノ酸配列決定が，

比較的容易に実行できるようになりつつある。

三 重 大 学 で は 2009 年 に 4800 Pl usMALDI TOF/ TOFAnal yzer （エービー・サイエックス社 製 ） が 設 置 さ れ た 。 本 機 種 の 標 準 機 能 で は Protei nPi l ot ソフトウェア（エービー・サイエッ クス社製）や Mascot （マトリックスサイエンス

PepNovo と PEAKS を用いた denovo ペプチド配列解析

磯野 直人

・柳原 和典

・小林 裕子

・小林 一成

・久松 眞

1三重大学大学院生物資源学研究科，

2三重大学生命科学研究支援センター，

3三重大学大学院地域イノベーション学研究科

Denovo peptidesequencingbyPepNovoandPEAKS

NaotoI

,KazunoriY

,YuhkoK

, IsseiK

andMakotoH

1GraduateSchoolofBioresources,MieUniversity,Tsu,Mie514-8507,Japan

2LifeResearchCenter,MieUniversity,Tsu,Mie514-8507,Japan

3GraduateSchoolofRegionalInnovationStudies,MieUniversity,Tsu,Mie514-8507,Japan

Abstract

Wepresentatechniqueofdenovopeptidesequencingfrom MALDITOF/TOFtandem massspectraby web-based programs,PepNovoand PEAKS. Furthermore,weshow theresultofdenovopeptide sequencingofkidneybeangranule-boundstarchsynthaseI(GBSSI).

KeyWords:denovopeptidesequencing,PepNovo,PEAKS,MALDITOF/TOF tandem massspectrometry

三重大学大学院生物資源学研究科紀要 第37号：79～85

平成23年2月

2010年10月4日受理

＊ Forcorrespondence（e-mail:[email protected]）

社製）を用いたタンパク質の解析が可能である。

これらはデータベースや既知のアミノ酸配列情報 を利用し，既知タンパク質の同定や修飾解析を行 うことを目的とするプログラムである。構造が未 知でデータベース未登録のタンパク質のアミノ酸 配列は決定できない。そこで，本解説では 4800 Pl usMALDITOF/ TOF Anal yzer で 得 ら れ た MS/ MS スペクトルから，ウェブベースのソフト ウェアである PepNovo と PEAKSOnl i ne を用い て，denovo ペプチド配列解析する方法について 紹介する。以下では，インゲンマメの Granul e- boundstarchsynthaseI （GBSSI,EC 2. 4. 1. 242 ） を試料として用いた場合の解析方法と結果を示す。

方 法

１ ． SDS-ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動

（SDS-PAGE）およびゲル内消化

既報

にしたがって精製した組換え型 GBSSI

（5 μg ） を SDS- PAGEで分離した後， ゲルを Bi o- Saf eCBBG- 250 ステイン（バイオラッド社 製）で染色し，目的のバンドを含むゲル片を切り 出した。続いて，東京都老人総合研究所産学公連 携プロテオーム共同研究センターの標準操作法に したがって，還元アルキル化とトリプシンによる ゲル内消化を行った

。得られた消化液を遠心 エバポレーターで 2 μL程度まで濃縮した後，40 μLの溶媒 A （2 ％ アセトニトリル,0. 1% トリ フルオロ酢酸）と混合した。

２．ナノ LCによるペプチドの分離

ゲル内消化した試料はトラップカラム Hi Q si l C18W （内径 500 μm×長さ 1mm， 粒子径 3 μmの C18粒子を充填，ケーワイエーテクノロ ジーズ社製）を用いて脱塩した後，逆相カラム Hi Q si lC18W （内径 50 μm ×長さ 50mm ，粒 子径 3 μm の C18粒子を充填，ケーワイエーテ クノロジーズ社製）を接続した Di NAダイレク トナノ HPLCシステム（ケーワイエーテクノロ ジーズ社製）に供した。溶媒 Aで 10 分間カラム を洗浄した後，0- 50 ％溶媒 B （70 ％ アセトニト リル,0. 1 ％ トリフルオロ酢酸）の直線濃度勾配

（45 分間），50- 100 ％ 溶媒 Bの直線濃度勾配（10 分間），100- 0 ％ 溶媒 B の直線濃度勾配（10 分間）

でペプチドを分画した。操作はすべて流速 300 nL/ 分で行った。カラムから溶出されたペプチド 試料をマトリックス溶液（0. 4 ％ α- シアノ- 4- ヒ ドロキシケイ皮酸，2 ％ クエン酸二アンモニウム，

0. 1 ％ トリフルオロ酢酸，70 ％ アセトニトリル）

と混合し，MALDI プレート（エービー・サイエッ クス社製）に 30 秒/ スポットの速度で合計 119 ス ポットに分画した。

３．MALDITOF/TOFタンデム質量分析

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時 間型タンデム質量分析計 （MALDITOF/ TOF MS ） で あ る 4800 Pl us MALDI TOF/ TOF Anal yzer （エービー・サイエックス社製）を用い てペプチドの質量分析を行った。前駆イオンを検 出するために，MSRef l ectorPosi ti ve モードで検 出範囲を 800 ～4000Da ，FocusMass を 2400Da に設定した。イオンカウントが 1 万カウント程度 になるようにレーザー強度を設定し，1 スポット あたり 25 箇所について 50 回レーザーをランダム に照射して全てのスポット（119 スポット）に含 まれる分子イオンの TOF質量スペクトルを測定 した。さらに，各スポットから検出されるスペク トルのうち，イオン強度の高い上位 10 本のピー クを前駆イオンとして，MS- MS1kVPosi ti ve モー ドで MS/ MS 自動測定を実施した。衝突誘起開裂

（CID ）コントロールを ・CID Of f ・ ，レーザー強 度は前駆イオン検出時の 1. 2 倍に設定し，1 スポッ トあたり 50 箇所について 50 回レーザーをランダ ムに照射した。

４．データ変換

4800Pl usMALDITOF/ TOFAnal yzer によっ て得られた SpotSet データをソフトウェア 4000 Seri esExpl orer で開き， PeakstoMascot の機能 を用いて単一の Mascot

Experi mentType として ・Protei n- Pepti debySpot Set・ を選択した。MS/ MSPeakFi l ter では，Mi n S/ N を 20 ， Mi n Areaを 1000に 設 定 し た

（MS/ MS スペクトルのピークが小さい場合は，

これらの設定値を小さくする）。PeakstoMascot によって出力されるファイルの拡張子は txt であ るが， PepNovo で解析する時にエラーとなるた め，拡張子を mgf に変更した。

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５．PepNovo

PepNovo は Uni versi tyofCal i f orni a,SanDi ego の Centerf orComputati onalMassSpectrometry の Web サイト （http: / / proteomi cs. ucsd. edu/ Li ve Search/ ）から無料で利用できる。メインページ の Toolsel ecti on では Tool を ・PepNovo・ とし，

Spectrum f i l e で Mascot 形式ファイル（拡張子 mgf ）を選択した。また， ・Usespectrum Charge・

と ・Usespectrum precursorm/ z・ の両方にチェッ クを入れた。 Moreopti ons では Pepnovosearch type を ・De Novo・ と し ， Numberofdesi red sol uti ons を ・1・ とした（各ペプチドについて多数 の予想配列を得たい場合はこの数値を増やす）。

なお，翻訳後修飾が予想される場合はメインペー ジの Al l owedPost- Transl ati onalModi f i cati ons で，

考慮する修飾の種類を設定することができる。た だし，翻訳後修飾を考慮すると解析に必要な時間 が長くなる。また，実際は未修飾のペプチドに対 して，修飾を考慮した解析を行うと，正しいアミ ノ酸配列が得られないことが多い。

６．PEAKSOnline

PEAKSOnl i ne は Bi oi nf ormati csSol uti onsInc.

の Web サイト

（http: / / www. bi oi nf or. com: 8080/ peaksonl i ne/ ） か ら無料で利用できる。ただし，はじめて使用する 前にアカウントを作成する必要があり，一つのア カウントからの解析は 1 日 5 回に制限されている。

多数の試料について，短時間で解析する必要があ る場合は Bi oi nf ormati csSol uti onsInc. から購入で きるスタンドアローン版の PEAKSStudi o を利 用しても良い。

Search ページの Enzyme は ・SemiTrypsi n・ ， Functi on は ・Fi nddenovosequences・ とした。

Preprocessで ・Do preprocess・を 選 択 し ， Instrument は ・TOF- TOF・ とした。 Mergetol . , Parenttol . ,Fragmenttol . はすべて 0. 5Da とし，

Precursormass は ・Monoi sotopi c・ とした。 Data f i l e として Mascot 形式ファイル（拡張子 mgf ） を 選 択 し た 。 デ ー タ ベ ー ス に 関 す る 項 目 は PEAKSOnl i ne では無効であるため，初期設定 のままとした。なお，PepNovo と同様，翻訳後 修飾について考慮した解析をするように設定する ことも可能である。

解析結果

インゲンマメ GBSSI はデンプンのアミロース 合成に関与する酵素であり，すでに cDNAの全 塩基配列が決定され，国際塩基配列データベース に登録されている （アクセッション番号 AB 029546 ）

。 ト リ プ シ ン 消 化 し た GBSSIを MALDITOF/ TOF質量分析計で分析したところ 合計 86 個のペプチドイオンの MS/ MS スペクト ルが得られた。このデータを用いて

配列 解析を行った。ただし，denovo 配列解析には，

アミノ酸配列や塩基配列のデータベース情報は使 用しなかった。

PepNovo による解析では，図 1 のような予想 アミノ酸配列と PepNovo スコアの一覧表が得ら れる。 PepNovo スコアが大きな値の場合，予想 配列が実際のアミノ酸配列と一致あるいは類似し ている可能性が高い。GBSSI の分析結果では 78 個のペプチドの予想配列が示された（PepNovo スコア：- 135 ～112 ）。PepNovo スコアが 60 以上 のペプチドは 22 個あり，このうち 11 個は予想配 列が実際の配列と連続 7 残基以上一致していた

（表 1 ）。つまり，PepNovo はこれらのペプチドの 配列をかなり正しく決定できたことがわかった。

一方，スコア 60 以下の場合，PepNovo 予想配列 の信頼性は低く，特にスコア 50 以下の予想配列 は実際の配列とほとんど一致しなかった（データ は示さない）。また， PepNovo はペプチドの N 末端側もしくは C末端側の分析結果の信頼性が 低い場合，この部分の予想配列を返さずにペプチ ド末端からの質量（N- Gap および C- Gap ）を用 いた結果を示すことがある。 一例を示すと，

GBSSIの ト リ プ シ ン 分 解 物 で あ る

= 1750. 722 のペプチドイオン（前駆イオン）の予 想配列は LFVGAEVAであり，N- Gap と C- Gap がそれぞれ 431. 341 と 533. 328 であった。実際の 配列は GMNLIFVGAEVAPWSK であり，下線 部の配列と予想配列は完全に一致していた（後述 するように，I と Lは質量が同一であり識別でき ない）。

PEAKS では，図 2 のような予想アミノ酸配列 候補とそれぞれのスコアの一覧表が得られる。一 つのペプチドについて， 20 種類の予想配列候補 が提示される。スコアが大きな値の場合，予想配

Denovoペプチド配列解析 81

磯野 直人・柳原 和典・小林 裕子・小林 一成・久松 眞 82

表１．PepNovoとPEAKSによるGBSSIの予想アミノ酸配列1） №ペプチド イオンm/z実際のアミノ酸配列PepNovo予想配列2,3）PepNovo スコアPEAKS予想配列2,4）PEAKS スコアPepNovo-PEAKS 共通配列2,5） 11786.928FIDQNVQIIILGTGKLFDQVLLLQVQ+490.352112EMDNLNQLLLLDNNK10-- 21734.7841GMNLIFVGAEVAPWSKTSNLLFVKEVA+533.315105GMNLLFVQEVANDER15NLLFVXEVA6） 31240.5389ALGTYGTVAMEKALGTYGTVA+407.32595ALGTYGTVAMEK82ALGTYGTVA 4904.377ELVSGEDRELVSSVDR85ELVSSVDR56ELVSSVDR7） 51750.722GMNLIFVGAEVAPWSK431.341+LFVGAEVA+533.32883QFRLFVGAEVAVGSDR10LFVGAEVA 61896.944FLLKEALQAEVGLPVNR501.438+EALKAEV+655.36783SSAKKEALQAEVGLFYR10EALXAEV6） 71766.728TDKFIDIHFDTTSVK491.346+LDLHFDTTSVK82KLCFLDLHFDTTSVK14LDLHFDTTSVK 81745.7629QIEQLEEIYPEK763.345+LQEKLEEL+1745.76381RDVQLEELYLLQAR10XLEEL6） 91796.729LYGPSAGVDYEDNQLR276.425+GALAGVDYED+530.24281EFGPSAGVDYEDNQLR10AGVDYED 101589.705SAFDFTDGHLKPVR783.362+GHLQPVR80SSMDFTDGHLQHSK10GHLQ6） 111738.764GMNLIFVGAEVAPWSK431.354+LFVGAEV+592.35779SDNDLFVGAEVADCQR10LFVGAEV 12884.3989FDGPLAHKFDGPLAHK78FDGPLAHK49FDGPLAHK 131256.537ALGTYGTVAMEKALGTYGTVA+423.23775ALGTYGTVAFEK38ALGTYGTVA 141564.675VAFCIHNISYQGR727.291+NLSYGAGR74SSGMDLHNLSYNAR10NLSY 152094.917?217.397+EKVSTAHFD+863.50868FAQQVSTAHFDEEEEAEK10VSTAHFD 162000.833HPFEDFPLLNLPNEYR510.401+DFPLLNL+678.32368HPEFDFPLLNLPAGDYR10DFPLLNL 172013.918TGGLGDVLGGLPSALAEHGHR385.412+DVLGGLPSAL+706.26867--- 181395.678EALQAEVGLPVNR271.075000+AVAEVGL+485.26665ELAQAEVGLVPNR10AEVGL 192105.804YDQYKDAWDTNVTVEVK1101.36+DTNVTVEVK64FVQVSHDACDDTNVPCPMK13DTNV 201952.924AAILESDLVLTVSPYYAK497.358+SDLVLTW+641.43163QCHESDLVLTVSACCCNK23SDLVLTX7） 212073.834YDQYKDAWDTNVTVEVK1069.449+DTNVTVEVK63FMGMCQDAWDTNVPCEAR10DTNV 221518.639QIEQLEEIYPEK611.278+EEYLPTR61KLMYLEELQHSK10EE 231672.646IIQNCMAQDFSWKLLQNCFAQD+583.37458EPQNGCFAQDDSMCK10CFAQD 242089.8149YDQYKDAWDTNVTVEVKENYYKDASDDT+788.36855FMQYQDACVDTNVTVPCR10YXDA6） 251952.9449AAILESDLVLTVSPYYAK497.501+MALVLTW+641.30454GVVLESDLVLTVSAAHTNK14LVLTX7） 261456.576FFHCYKQGVDR754.236+QGAGVDR52RDGCGCYKQRDR10XXXDR6,8） 271404.6121VFVDHPCFLEK597.364+PSSFLEK51AGFLFACPHDAAGK10-- 281419.676IIAGSDFIMIPSR174.08+PSLMLFD+442.41351LLAGSDFLMLPSR14LML 1）PepNovoスコアが50以上のペプチド（28個）の解析結果を示した。 2）実際のアミノ酸配列と一致する連続した2残基以上の配列を赤字で示した。また記号Lは「I（イソロイシン）あるいはL（ロイシン）」を意味している。 3）N-GapとC-Gap（図1）がある場合は予想配列の前後に数値を記載した。PEAKS予想配列と一致する連続した2残基以上の配列を下線で示した。 4）20種類の予想配列のうち，最も高いスコアを示す配列を記載した。最高スコアが10のペプチドについてはseq1（図2）の配列を示した。また，PepNovo予想配列と一致する連続し た2残基以上の配列を下線で示した。 5）PepNovoとPEAKSの両方のプログラムで共通して予想された配列を示した。 6）K≒Q＝AG＝GA（質量） 7）W≒AD=DA=EG=GE≒SV=VS（質量） 8）R≒GV=VG（質量）

列が実際のアミノ酸配列と一致あるいは類似して いる可能性が高い。GBSSI の分析結果では 80 個 のペプチドの予想配列が示された（PEAKS スコ ア：10 ～82 ）。PEAKS スコアが 25 以上のペプチ ドは合計 12 個あり，このうち 5 個は予想配列が 実際の配列と連続 7 残基以上一致していた（デー タは示さない）。ただし，PEAKS スコアが最低 値の 10 であるにもかかわらず，予想配列の一部 が実際の配列と一致するケースも多かった。例え ば，表 1 では PepNovo スコアが 50 以上のペプチ ド（28 個）が示されているが，PEAKS スコア 10 のペプチドが 17 個あり，このうち 7 個は予想配 列が実際の配列と連続 7 残基以上一致していた。

また，PEAKSは PepNovo と異なり，ペプチド の末端についても必ず予想配列を提示する。しか し，PEAKS スコアが極めて高いケースを除き，

ペプチドの末端側の配列の信頼性は低かった（表 1 ）。

このように， PepNovo と PEAKS は優れた

ペプチド配列解析プログラムであり，部分 的ではあるが，正確にアミノ酸配列を決定するこ

とができた。ただし，denovo ペプチド配列解析 では気をつけなければならない点がいくつかある。

（1 ）アミノ酸残基 Lと I は同一の質量であるた め識別できない。そのため，PepNovo と PEAKS の予想配列中の記号 Lは「I または L 」を意味し ている。（2 ） アミノ酸残基 K と Q の質量差は 0. 036 しかない。また，Qは AGあるいは GAと 同一の質量である。スペクトルによってはこれら のアミノ酸残基（配列）の判別ができないことが ある。 同様に，（3 ） N と GG の識別，（4 ） W, AD,DA,EG,GE,SV, VSの識別，（5 ）R,GV, VGの識別も難しいので，これらのアミノ酸残基

（配列）が予想配列中にある場合は，注意する必 要がある。

タンパク質をコードする遺伝子や cDNAをク ローニングするために，アミノ酸配列情報を基に して，（RT- ） PCRに用いるオリゴヌクレオチド プライマー（縮重プライマー）を設計することが ある。しかし， PepNovo あるいは PEAKSのい ずれか一方のプログラムの結果のみを用いて効果 的なプライマーを設計するのは難しい。例えば，

Denovoペプチド配列解析 83

図１ PepNovoの解析結果画面

GBSSI の場合，PepNovo ではスコア 60 以上のペ プチド（22 個）のうち，提示された予想配列が 完全に正しいペプチドは 10 個であった（表 1 ）。

また， PEAKSではスコア 25 以上のペプチド

（12 個）のうち，予想配列が完全に正しいペプチ ドは 3 個だけであった。つまり，これらのペプチ ド予想配列を用いて作成したプライマーの多くは，

（RT- ） PCRで機能しないことが予想された。そ こで，私たちは PepNovo と PEAKS の両方のプ ログラムで，共通して予想された配列を調べた。

その結果，連続した 7 残基以上の配列が共通して いるペプチドは 10 個あることが明らかとなった

（表 1 ）。この共通予想配列のうち 8 個については 実際のアミノ酸配列と完全に一致していた。この ように， PepNovo と PEAKS を併用し，情報を 絞り込めば，より確実に正しいアミノ酸配列を取 得できることがわかった。これらの共通予想配列 を用いれば，（RT- ） PCRに有効なプライマーを，

効率的に作成することができると推定した。

最近，私たちは本解説で紹介した手法を用いて，

微 細 藻 類

由 来 β - 1,3- gl ucan phosphoryl ase （EC 2. 4. 1. 97 ）のアミノ酸配列を 決定した（データ未発表）。本酵素は

属以外では発見されておらず，これまで構造が不 明であり，Oc

や類縁生物のゲノム 配列も決定されていなかった。また，アミノ酸配 列情報から作成した縮重プライマーを用いて RT- PCRを行い，本酵素をコードする cDNAの クローニングにも成功した。このように

ペプチド配列解析は，構造未知のタンパク質の研 究を進める際に非常に役立つ技術であり，今後さ らに利用が進むであろう。

要 約

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時 間型タンデム質量分析計 （MALDITOF/ TOF MS ）によって得られた MS/ MS スペクトルを用

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図２ PEAKSの解析結果画面

いて，denovoペプチド配列決定する手法を解説 す る 。 ウ ェ ブ ベ ー ス の ソ フ ト ウ ェ ア で あ る PepNovoとPEAKS onlineを使用した解析方法 を紹介する。また，インゲンマメGranule-bound starchsynthaseI（GBSSI）を試料とした解析例 を示す。

引 用 文 献

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