岡 山 医 誌 (1993) 105, 543∼558
皮膚器 官培養 を用 い た黄 色 ブ ドウ球 菌性
表 皮剥脱素Aの 研究
岡 山大 学 医学 部皮 膚科 学教 室(指 導:荒 田次郎 教 授)
山
田
琢
(平成5年3月9日
受稿)
Key words:黄
色 ブ ドウ球 菌,表 皮剥 脱素,免 疫 酵素抗 体 法,
器 官培養,蛍 光 抗体 法
緒 言 黄 色 ブ ドウ球 菌 が 産 生 す る菌 体 外 性 毒 素 で あ る黄 色 ブ ドウ球 菌 性 表 皮 剥 脱 素A(staphylococ cal exfoliative toxinA,以 下ETAと 略 す.) は 正 常 人 皮 膚 の 顆 粒 層 で裂 隙 を形 成 す る こ とが 知 ら れ て い る1) 2)が,そ の 作 用 機 序 は 未 だ 明 らか で は な く,ま た な ぜ 顆 粒 層 で の み 表 皮 剥 脱 が 起 こ る の か も明 らか に は な っ て い な い. 我 々 は,ヒ ト正 常 皮 膚 器 官 培 養 を材 料 と して ETAを 作 用 させ る モ デ ル を使 っ て さ らに 実 験 を 行 っ た. ETA処 理 に よ りケ ラ チ ン 蛋 白,終 末 角 化 の 指 標 で あ る イ ン ボ ル ク リ ン,表 皮 細 胞 接 合 部 に 局 在 して い る 表 皮 成 長 因 子 受 容 体(以 下EGF-R), 表 皮 成 長 因 子(以 下EGF)が ど の よ う な 変 化 を 受 け る か 免 疫 酵 素 抗 体 法 を 用 い て 調 べ た.さ ら にETAが 作 用 す る 時,表 皮 細 胞 の 細 胞 表 面 マ ー カ ー の発 現 の 有 無 も検 討 し た. ETAの 作 用 に よ り顆 粒 層 に裂 隙 が で き る が, 同 じ レベ ル に 水 疱 の 生 ず る落 葉 状 天 疱 瘡 の 自 己 抗 体 の 結 合 部 位 とETAの 結 合 部 位 との 関 係 も 興 味 深 い 点 で あ る.表 皮 細 胞 間 の 接 着 に 非 常 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い るデ ス モ ゾー ム の構 成 成 分 で あ る160kDデ ス モ グ レ イ ンIは 落 葉 状 天 疱 瘡 患 者 抗 体 の 標 的 抗 原 で あ る.蛍 光 抗 体 間 接 法 を行 う こ と に よ り,こ の デ ス モ グ レ イ ンIに 対 す る 患 者 血 清 の 結 合 がETAに よ り どの 様 な 変 化 を来 す か 調 べ た.こ れ らの 結 果 をふ ま え て, ETAの 表 皮 裂 隙 形 成 に てつ いて 考 察 し以 下 に 報 告 す る. 材 料 と 方 法 1. ヒ ト正 常 皮 膚 皮 膚 手 術 時 に 摘 出 さ れ た皮 膚 材 料 の 一 部 に残 る正 常 皮 膚 を用 い た.患 者 の 年 齢 と摘 出皮 膚 の 部 位 は,14歳 女 子(項 部),61歳 男 子(大 腿 部) 44歳 男 子(腹 部 お よ び 左 前 腕 部),9歳 女 子(上 腕)で あ っ た. 2. 使 用 した 黄 色 ブ ドウ球 菌 株(以 下E株 と略 す)3) 4) 伝 染 性 膿 痂 疹 の2歳 の 男 児 よ り分 離 し た 黄 色 ブ ドウ球 菌 の1株 を用 い た.こ の 菌 の 性 状 は, プ ロ テ イ ンA陽 性,コ ア グ ラー ゼ 陽 性 で コ ア グ ラー ゼ 型 はV型.フ ァー ジII群71型.α 毒 素 陰性, β毒 素 陽 性,δ 毒 素 陰 性 で あ っ た.ETA産 生 性 は,新 生 仔 マ ウ ス に 培 養 上 清 を 皮 下 注 射 し た 後, ニ コ ル ス キー 現 象 が 認 め られ る こ と,及 び,抗 ETA抗 体 を 用 い たOuchterlony法 で 沈 降 線 が 認 め られ る こ と に よ り確 認 し た.3. Exfoliative toxin A (ETA)の 精 製 ETAの 精 製 方 法 は桜 井 ら(Chromatography 投 稿 中)の 方 法 に 従 い行 っ た.そ の 概 略 は 図1 に 示 す.精 製 し たETAの 蛋 白 量 は,90μg/ml. 新 生 仔 マ ウ ス の 背 部 に 皮 下 注 射 し て表 皮 剥 脱 を 引 き起 こす 最 小 蛋 白 量 は30μg/マ ウ ス で あ っ た. ま た,桜 井 ら に よ る と こ の 方 法 を用 い た と き 表 皮 壊 死 活 性 を持 つ 黄 色 ブ ドウ球 菌 性 α-toxinは, 第1ピ ー クに 存 在 す る こ と が 確 認 さ れ て い る. ま た,こ の 方 法 で 得 ら れ た 標 品 は,SDS-543
polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)で 分 子 量 約27000の 位 置 に シ ン グ ル バ ン ドを形 成 し,ま たOuchterlony法 で 抗ETA抗 体 と1本 の 沈 降 線 を 形 成 す る こ とが 確 認 され て い る. 4. 皮 膚 器 官 培 養 皮 膚 器 官 培 養 はSarkanyら5)の 方 法 に 準 じ て 行 っ た.正 常 皮 膚 をphosphate-buffered saline, pH 7.5, (PBS)で 洗 浄 後,出 来 る 限 り脂 肪 織 を 取 り除 い た 後,10mm×5mm(厚 さ0.4∼1.5mm) の 大 き さに 細 切 した あ と,時 計 皿 中 のDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco
Lab.)に 浮 か せ た レ ン ズ ペ ー パ ー 上 に,真 皮 を 下 に し て の せ た.時 計 皿 中 の 培 地 に所 定 の 濃 度 (30μg/ml, 3.0μg/ml, 0.3μg/ml, 0.03μg/ml, 0.003μg/ml)に な る よ うに 前 述 のETAを 加 え, 合 計3mlに 調 整 して 用 い た.37℃,5%CO2in air の 環 境 で イ ン キ ュ ベ ー ト し,1∼3時 間 毎 に 立 体 顕 微 鏡 下 に 鑷 子 で 軽 く摩 擦 し,角 層 が 薄 くシ ー ト状 に 剥 が れ る時 間 を 陽 性 と し た.対 照 と し てPBSの み を加 え た 群 と,オ ー ト ク レー ブ に て120℃20分 加 熱 失 活 させ たETAを 加 え た群 を 用 い た.各 群,各 時 間2∼3ヶ の 皮 膚 片 を観 察 し た.観 察 終 了 後,型 の 如 くホ ル マ リン 固 定 し パ ラ フ ィ ン 切 片 を作 製 後,ヘ マ トキ シ リ ンー エ オ ジ ン 染 色(HE染 色)を 施 行 し,組 織 学 的 に 検 討 し た. 5. 免 疫 組 織 化 学 染 色 前 述 の如 き方 法 で 得 た皮 膚 器 官 培 養 材 料 よ り 4μmの 凍 結 切 片 を作 製 し た.PBSで 洗 浄 後,非 特 異 反 応 を抑 え る た め 正 常 ウ サ ギ 血 清 で 処 理 し た の ち,一 次 抗 体 と し て表1の もの を 用 い,ま た 二 次 抗 体 と して ビ オ チ ン標 識 ウ サ ギ 抗 マ ウ ス IgG+IgM+IgA抗 体(ニ チ レ イ)を そ れ ぞ れ 室 温 で30分 反 応 させ た 後,PBSで5分3回 洗 浄 を 行 っ た.三 次 抗 体 に ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ス ト レプ トア ビ ジ ン(ニ チ レ イ)を 室 温 で30分 反 応 させ た.最 後 に3%過 酸 化 水 素 水 加2.5% 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)(協 和 メ デ ィ ッ ク ス)を 用 い て発 色 させ, マ イヤ ー の ヘ マ トキ シ リンで 核 染 色 後,封 入 した. 図1 ETAの 精 製 法 表1
6. 蛍 光 抗体 間 接法
前 述 の器 官培養 皮 膚標 本 よ り5μm凍結切 片 を
作 製 し,風 乾 後,PBSで5分3回 洗 浄 し,10倍, 20倍,40倍,に そ れ ぞ れ 希 釈 し た 患 者 血 清 をか け,37℃ で30分 イ ン キ ュ ベ ー ト し た.血 清 は, 160kDの 表 皮 間 抗 原 を認 識 し て い る こ とが 免 疫 ブ ロ ッ ト法 で 確 認 され て い る落 葉 状 天 疱 瘡 の 患 者 血 清1例(33歳 女 性),尋 常 性 天 疱 瘡 患 者 血 清 2例(40歳 女 性 ・67歳男 性),水 疱 性 類 天 疱 瘡 患 者 血 清2例(59歳 女 性 ・56歳 女 性)を 用 い た. PBSで5分3回 洗 浄 後,二 次 抗 体 と し てFITC 標 識 抗 ヒ トIgGFabヤ ギIgG抗 体(Cappel Research Products)を 用 い,37℃30分 イ ン キ ュ皮 膚器 官培 養 を用 い た黄 ブ菌 性表 皮剥 脱素Aの 検 討
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ベ ー ト後,再 びPBSで5分3回 洗 浄 し,10% グ リセ リン で 包 埋 した 後 蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 した. 各 希 釈 系 列 の 各 濃 度 に つ き18枚 ず つ の 切 片 を作 製 し観 察 した. 表2 正 常 ヒ ト皮 膚 器 官 培養 結 果 -:鑷 子 で皮 膚切 片 の 表 面 をこす って も全 く表 皮 が剥 脱 しない. +-:鑷 子 で皮 膚切 片 の 表 面 をこす っ た時,切 片の 周 辺 のみ 顆 粒 層下 で角 層 が剥 脱 す る. +:鑷 子 で 皮 膚切 片の 表 面 をこす っ た時,切 片の 一部 の角 層 が剥 脱 す るが シー ト状 に まで至 らな い. ++:切 片 の角 層 が顆 粒 層 下 で シー ト状 に全 て剥 脱 す る. 図2 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚 器 官 培 養 開始4時 間 後 のHE所 見.顆 粒 層 下 で の 表 皮剥 離 を認 め るが,有 棘 細 胞 層 下 層,基 底 細 胞層,表 皮 真 皮 境 界部 は変 化 が な い. 図3 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 いた ヒ ト正 常 皮 膚器 官 培養 開始24時 間 後のHE所 見.表 皮 は壊 死 性 とな り,有 棘 細 胞 層下 層で も裂 隙 形成 お よび 棘融 解 を認 め る. 結 果 1. 皮 膚 器 官 培 養 年 齢 ・性 別 に 関 係 な く,約2時 間 後 よ り切 片の 周辺 よ り角 層が剥 脱 し始 め,4∼21時
間後 ま
で角 層 が シー ト状 に剥 脱す る現象 が認 め られ た
(表2).立
体顕 微鏡 で観察 す る と,ま ず1時 間
後 頃 よ り表 皮 が次 第 に軽度 浮腫 状 に な り,最 上
層 の角 層が ご く薄 く不 規則 に剥 が れ るが,組 織
学 的 には角 層,表 皮細 胞層 とも変 化が な い.続
いて約2時 間 後 頃 よ り標本 の 周辺 部の み角 層 が
薄 く剥 脱 す る よ うに な り,組 織学 的 には顆 粒 層
での表 皮剥 脱 を認 め る.更 に約3時 間 後 には標
本 上 の一部 を残 して角 層 が薄 く剥 脱す る.4時
間後 よ り標 本 全体 の角 層 が きれ いに剥 脱す るた
め シー ト状 の角 層 を得 るこ とがで きる様 に なる.
こ の 所 見 は4∼21時 間 後 ま で 観 察 で き,こ の 時 期 ま で の 標 本 を 組 織 学 的 に 観 察 す る とい ず れ も 顆 粒 層 で の 裂 隙 形 成 が 認 め られ た(図2). 24時 間 後 頃 よ り,表 皮 全 体 が 壊 死 性 と な り, 次 第 に 深 く表 皮 剥 脱 を起 こ す よ う に な る.組 織 学 的 に も,次 第 に 有 棘 細 胞 層 が 棘 融 解 を 示 し(図 3),や が て 表 皮 細 胞 層 全 体 が 壊 死 状 態 と な り, 最 終 的 に は,表 皮 下 で の裂 隙 形 成 を 認 め る に 至 っ た(図4).一 方ETAの 代 わ りにPBSを DMEMに 加 え た 系,お よ び オ ー ト ク レー ブ に て 120℃20分 加 熱 失 活 させ たETAを 加 え た 系 で は 30時 間 後 ま で,全 く変 化 を認 め な か っ た.こ の 正 常 皮 膚 器 官 培 養 系 で角 層 の 剥 脱 を 引 き起 こす の に 必 要 な 最 小 蛋 白濃 度 は3.0μg/mlで あ っ た. 図4 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚 器 官 培養 開始27時 間 後 のHE所 見.表 皮 下 での 裂 隙形 成 を認 め る. 表3 2. 免 疫 組 織 化 学 染 色 表3及 び 図5に 示 し た 如 くの 結 果 と な っ た. 今 回 施 行 し た4名5標 本 の 中 は,ほ ぼ 同 じ染 色 態 度 を 示 し,ETAの 有 無 に よ る染 色 性 の 違 い は 認 め ら れ な か っ た.ま た,皮 膚 採 取 直 後 に 凍 結 した 正 常 皮 膚 と も差 は 認 め られ な か っ た. 3. 蛍 光 抗 体 間 接 法 ETA処 理 を し な い 皮 膚 を 用 い た,落 葉 状 天 疱 瘡 患 者 血 清 に よ る蛍 光 抗 体 間 接 法 で は,表 皮 全 層 の 表 皮 細 胞 間,特 に 上 方 の 表 皮 細 胞 間 に 網 目 状 の 蛍 光 を認 め た が(図6-a),ETA処 理 を行 っ た標 本 の 蛍 光 は 明 ら か に 減 少 し て い た(図6 -b) .尋 常 性 天 疱 瘡 患 者 血 清 で はETA処 理 に皮 膚器 官培 養 を用 い た黄 ブ菌 性 表皮剥 脱素Aの 検 討
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図5. 免疫 組 織 化 学 染色 図5-a 対照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗 ケ ラ チ ン抗 体 で 免疫 組 織 化 学 染 色 した.基 底 層直 上 か ら角 層 にか け て 強 く 陽性 に染 ま る. 図5-b 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚 器 官培 養 開 始4時 間後 の標 本 を,抗 ケ ラ チ ン抗体 で免 疫 組 織化 学 染 色 した.基 底 層 直 上 か ら角 層 に か け て強 く 陽性 に染 ま る. 図5-c 対 照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚 器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗 ケ ラチ ンSE抗 体 で 免 疫組 織 化 学 染 色 した.基 底 層 直上 か ら角 層 にか け て 強 く陽 性 に染 まる. 図5-d 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚 器 官培 養 開 始4時 間後 の標 本 を,抗 ケ ラ チ ンSE抗 体 で免 疫組 織 化 学 染 色 した.基 底 層 直上 か ら角 層 に か けて 強 く陽性 に染 ま る. 図5-e 対 照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚 器 官培 養 開 始4時 間 後 の標 本 を,抗 ケ ラチ ン19抗 体 で免 疫 組織 化 学 染 色 した.表 皮 は陰 性. 図5-f 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚器 官 培 養 開始4時 間 後 の標 本 を,抗 ケ ラチ ン19抗 体 で 免疫 組 織 化 学染 色 した.対 照 と同 じ く表 皮 は陰 性.図5-g 対 照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚 器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗 ケ ラチ ン5 D 3抗 体 で免 疫 組 織化 学 染 色 した.表 皮 は 陰性. 図5-h 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚 器官 培 養 開 始4時 間後 の標 本 を,抗 ケ ラ チ ン5D3抗 体 で免 疫 組 織化 学 染 色 した.対 照 と同 じ く表 皮 は 陰性. 図5-i 対 照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚 器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗 イン ボ ル ク リン抗 体 で免疫 組 織 化 学 染 色 した.有 棘 細 胞 層 の上 半分 と顆 粒 層 に 陽性 に染 ま る. 図5-j 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚 器 官培 養 開 始4時 間後 の標 本 を,抗 イ ン ボル ク リン抗 体 で免 疫組 織 化 学 染 色 した.対 照 と同 じ く有 棘 細 胞層 の 上 半分 と顆 粒 層 に 陽性 に染 ま る. 図5-k 対 照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚 器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗 サ イ トケ ラチ ンPKK 1抗 体 で免 疫 組 織化 学 染 色 した.基 底 層 ∼有棘 細 胞 層 の 下半 分 が 陽 性 に染 ま る. 図5-l 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 いた ヒ ト正 常皮 膚器 官 培 養 開始4時 間 後 の標 本 を,抗 サ イ トケ ラチ ンPKK 1抗 体 で免 疫 組 織 化 学 染 色 した.対 照 と同 じ く基底 層 ∼有 棘細 胞 層の 下 半分 が 陽性 に染 ま る.
皮膚 器官 培養 を用 い た黄 ブ菌 性 表皮 剥脱 素Aの 検討
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図5-m 対 照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚 器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗EGF抗 体 で免 疫 組 織 化 学染 色 し た.表 皮 は 陰 性. 図5-n 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮膚 器 官 培養 開始4時 間後 の標 本 を,抗EGF抗 体 で免 疫組 織 化 学染 色 し た.対 照 と同 じ く表 皮 は陰 性. 図5-o 対照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗EGF-R抗 体 で 免疫 組 織 化 学染 色 した.基 底 層 ∼有 棘 細 胞2∼3層 が 陽性 に染 まる. 図5-p 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚器 官 培養 開始4時 間後 の標 本 を,抗EGF-R抗 体 で 免疫 組 織化 学染 色 した.対 照 と同 じ く基 底層 ∼有棘 細 胞2 ∼3層 が 陽性 に染 ま る. 図5-q 対照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚 器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗TNFα 抗体 で 免疫 組 織化 学 染 色 した.表 皮 は 陰性. 図5-r 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚 器官 培養 開始4時 間 後 の標本 を,抗TNFα 抗 体 で免疫 組織 化 学 染 色 した.対 照 と同 じ く表 皮 は 陰性.よ り表 皮 細 胞 が 棘 融 解 を起 こ して い る ため,個 々 の 細 胞 膜 が 発 す る蛍 光 が む し ろ軽 度 増 強 し て い る様 に 観 察 さ れ た(図6-c, d).水 疱 性 類 天 疱 瘡 患 者 血 清 で はETA処 理 を行 った 皮 膚 切 片, 対 照 と も表 皮 真 皮 境 界 部 に 線 状 の 蛍 光 を 認 め, 差 は 認 め ら れ な か っ た(図6-e, f). 図5-s 対 照 のPBS添 加DMEMを 用 い た ヒ ト 正 常 皮 膚器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗ICAM-1抗 体 で免 疫 組 織化 学 染 色 した.表 皮 は 陰性 で あ る. 図5-t 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚器 官培 養 開 始4時 間後 の標 本 を,抗ICAM-1抗 体 で免 疫 組 織化 学 染 色 した.対 照 と同 じ く表 皮 は 陰性. 図5-u 対 照 のPBS添 加DMEMを 用 いた ヒ ト 正 常 皮 膚 器 官 培 養 開 始4時 間 後 の 標 本 を,抗HLA-DR抗 体 で免疫 組織 化 学染 色 した.表 皮 内 に斑 状 に陽性所 見 を認 め る. 図5-v 30μg/ml ETA添 加DMEMを 用 い た ヒ ト正 常 皮 膚器 官 培 養 開 始4時 間後 の標 本 を,抗HLA-DR抗 体 で免 疫 組 織化 学 染 色 した.対 照 と同 じ く表 皮 内 に斑 状 に 陽 性所 見 を認 め る. 考 察
ETAは, Staphylococcal Scalded Skin Syndrome (SSSS)及 び,水 疱 型 伝 染 性 膿 痂 疹 の 原 因 毒 素 で あ り1) 2),海 外 で は主 に フ ァ ー ジII 群6) 7),わ が 国 で はI・III混 合 群 ま た はIII群8) 9)に 属 す る黄 色 ブ ドウ 球 菌 か ら産 生 され る菌 体 外 毒 素 で あ る. MelishとGlasgow10)に よ っ て1970 年 に 新 生 仔 マ ウ ス を用 い たETAの 動 物 実 験 モ デ ル が 確 立 さ れ て 以 来,多 数 のin vivo, in vitro の 実 験 モ デ ル が 報 告 さ れ て い る11). 1. 皮 膚 器 官 培 養 ヒ トの 正 常 皮 膚 器 官 培 養 を用 い た 実 験 モ デ ル はEliasら12) 13)(1974), Gentilhommmeら14) 15) (1987),二 村 ら16)(1987)に よ り行 わ れ て お り, い ず れ も臨 床 的 に 見 られ るSSSSや 伝 染 性 膿 痂 疹 と同 じ,顆 粒 層 で の裂 隙 形 成 を 認 め て い る. Eliasら13)は 新 生 仔 マ ウ ス の 表 皮 剥 脱 に 要 す る ETAの 量 と正 常 ヒ ト皮 膚 器 官 培 養 で表 皮 剥 脱 を 引 き起 こ す の に 必 要 な 蛋 白 量 を直 接 比 較 して い
皮 膚 器官 培養 を用 いた黄 ブ菌 性 表皮 剥脱 素Aの 検 討
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図6-a ETA処 理 を して いな い皮 膚 を用 いて,落 葉 状 天 疱瘡 患者 血 清 に よる蛍 光抗 体 間接 法 を施 行 した.表 皮 全 層の 表 皮 細 胞 間 に 蛍 光 を認 め る. 図6-b ETA処 理 を した皮 膚 を用 いて 落 葉 状 天 疱瘡 患者 血 清 に よ る蛍光 抗 体 間 接 法 を施 行 した.蛍 光 は 明 らかに 減 少 して い る. 図6-c ETA処 理 を していない皮 膚 を用 いて尋 常 性 天 疱 瘡 患 者 血清 に よる蛍 光 抗体 間接 法 を施 行 した.表 皮細 胞 間 に 蛍光 を認 め る. 図6-d ETA処 理 を した皮 膚 を用 い て尋 常 性 天 疱 瘡 患 者血 清 に よ る蛍 光 抗体 間 接 法 を施 行 した.表 皮細 胞 間 の蛍 光 はむ しろ増 強 す る. 図6-e ETA処 理 を して いない皮 膚 を用 いて水疱 性 類 天疱 瘡 患 者 血 清 に よ る蛍 光 抗 体 間接 法 を施 行 した.表 皮 真 皮 境 界部 に線 状 の 蛍 光 を認 め る. 図6-f ETA処 理 を した皮 膚 を用 い て水 疱 性 類 天 疱 瘡 患者 血 清 に よる蛍光 抗 体 間 接 法 を 施 行 した.対 照 と同 じ く表 皮 真 皮 境 界部 に線 状 の蛍 光 を認 め る.る.彼 ら の 場 合, in vivoで 新 生 仔 マ ウ ス に 表 皮 剥 脱 を 引 き起 こす のに 必 要 な最 小 蛋 白量 は10∼50 μg/マ ウ ス で あ り,我 々 の 今 回 の30μg/マ ウ ス と ほ ぼ 一 致 し妥 当 な値 と思 わ れ た.一 方 正 常 ヒ ト 器 官 培 養 皮 膚 の 裂 隙 形 成 ∼角 層 の 剥 離 に 要 し た 最 小 蛋 白 濃 度 はEliasら12) 13)の30μg/ml, Gentil hommmeら15)の200μg/ml,二 村 ら16)の10μg/ml と,か な りの ば ら つ きが 見 ら れ る.本 実 験 で は, 3μg/mlと 既 報 告 例 よ り少 な い が,こ れ は 本 実 験 で は 鑷 子 に よ り直 接 外 力 を加 え て い る こ と,観 察 時 間 が 長 い こ と,ETAの 精 製 がSDS-PAGE レベ ル で ほ ぼ 純 粋 なサ ン プ ル を用 い て い る こ と, な どに よ る の で は な い か と思 わ れ る.裂 隙 形 成 に 要 す る最 短 時 間 は2時 間 で,Eliasら が1時 間, 二 村 ら が1.5時 間,と い う今 ま で の 報 告 とほ ぼ 一 致 し た.今 回 の 実 験 に 用 い た 正 常 皮 膚 は 性 別, 年 齢,部 位 に 関 係 せ ず 裂 隙 形 成 を認 め て お り, 再 現 性 の 高 いSSSSま た は 伝 染 性 膿 痂 疹 のin vitro実 験 モ デ ル で あ る こ と,こ の 裂 隙 形 成 が ほ ぼ 純 粋 なETAとDMEMの み で 生 じ て い て他 の 血 清 成 分 や 免 疫 担 当 細 胞 の 関 与 な し に 裂 隙 形 成 が 引 き起 こ さ れ る こ とが 確 認 さ れ た. 臨 床 的 にSSSSや 伝 染 性 膿 痂 疹 が 小 児 を 中 心 に 発 症 し,マ ウ ス で は加 齢 と と も に 生 後5∼7 日頃10)よ りETAに 対 す る 感 受 性 を 失 う こ とが 知 られ て い るが,in vivoで の み 認 め られ るETA 感 受 性 の 年 齢 に よ る相 違 の 根 本 的 な理 由 は 未 だ 解 っ て い な い.MelishとGlasgow17)は,皮 膚 が 成 熟 す る こ とや,毛 組 織 が 成 熟 す る こ と に よ り,ETAに 対 す る耐 性 を獲 得 し て ゆ く と考 え た が,そ の 後Eliasら12)が,成 熟 し た ヒ トや マ ウ ス にETAを 皮 下 注 射 す る こ とに よ り表 皮 剥 脱 を 引 き起 こ し得 る こ と,及 び,有 毛 部 で も組 織 学 的 な 表 皮 の 剥 脱 が 起 こ り得 る こ と を証 明 して お り,表 皮 自体 が 加 齢 と と も に 耐 性 を獲 得 す る とは 考 え に くい と思 わ れ る. 現 在 の と こ ろ,ETAの 感 受 性 の 年 齢 に よ る変 化 の 理 由 と して,宿 主 の 免 疫 機 構(ETAに 対 す る 中 和 抗 体 を含 む)が 加 齢 と と も に 変 化 す る こ と,ETAを 代 謝(尿 中 排 泄 な ど)す る能 力 が 加 齢 とと もに 増 加 す るこ とな どが 考 え られ て い る11). 2. 免 疫 組 織 化 学 染 色 ETAの 作 用 部 位 す なわ ち顆 粒 層 で の み 裂 隙 形 成 が お き る こ と に 関 して は,ETAが 顆 粒 細 胞 に な っ て 初 め て 出 現 す る 機 能 あ る い は構 造 を標 的 と し て い る と考 え ざ る を得 な い. ケ ラ チ ン は 上 皮 系 細 胞 に 特 有 の 中 間 径 ブ ィ ラ メ ン トを構 成 す る蛋 白の サ ブ ユ ニ ッ トの 総 称 で, 細 胞 骨 格 と して 働 い て い る18).ま た表 皮 に お い て は,表 皮 細 胞 が 基 底 層 → 有 棘 層 → 顆 粒 層 と分 化 す る に 従 い,ケ ラ チ ン の 性 状 が 生 化 学 的 に も免 疫 学 的 に も変 化 して い き,表 皮 細 胞 の 分 化 の マ ー カー とな る こ とが 知 られ て い る19) 20) 21).ま た,イ ン ボル ク リン も有 棘 細 胞 で構 成 され る マー ジナ ル バ ン ドの 前 駆 体 を形 成 す る可 溶 性 蛋 白 であ り22) 23), 上 部 有 棘 細 胞 層 お よび 顆 粒 層 に 認 め られ,表 皮 細 胞 の 最 終 分 化 の マ ー カ ー と考 え られ て い る24) 25). ケ ラ チ ン は 表 皮 細 胞 の 分 化 の 指 標 と し て 重 要 な だ け で は な く,ETAの 直 接 ま た は 間 接 的 な標 的 と し て も重 要 で あ る.1986年Smithら26)は, ETAがfilaggrin groupに 結 合 しkeratin intermediate filament networkを 介 し て デ ス
モ ゾ ー ム に 何 らか の 影 響 を 与 え る と推 論 して い る. 最 近 で はKitajimaら が,SSSSの 病 変 形 成 部 位 と非 常 に 近 い 部 位 に病 変 の 生 ず る落 葉 状 天 疱 瘡 の 発 症 病 理 解 明 に 関 連 して,培 養 ヒ ト表 皮 細 胞 を 落 葉 状 天 疱 瘡 患 者 血 清 で 処 理 す る こ とに よ り,ケ ラ チ ン のrearrangementな い し消 失 が 認 め られ る こ と を抗 ケ ラ チ ン 抗 体 を用 い た 蛍 光 抗 体 間 接 法 で 確 認 して い る27) 28).落 葉 状 天 疱 瘡 は SSSS,伝 染 性 膿 痂 疹 と同 じ よ うに 顆 粒 層 で棘 融 解 を 生 じ る こ とが 特 徴 的 な 自 己 免 疫 性 水 疱 症 の 1つ で あ り,SSSSと 類 似 の 電 顕 所 見 を認 め る こ と29) 30)や,最 近immune-blottingを 用 い て, 落 葉 状 天 疱 瘡 抗 体 とETAと が お そ ら く共 通 の 蛋 白 質 を標 的 と して い る,と す る 報 告 が あ る31)な ど興 味 深 い 点 が 多 い. 今 回 用 い た 抗 体 の 内,抗 ケ ラ チ ン 抗 体(55, 56, 60, 62kDの ケ ラ チ ン を認 識 す る.)及 び ケ ラ チ ンSE (68, 58, 56, 5, 56kDの ケ ラ チ ン を 認 識 す る.)は 高 分 子 ケ ラ チ ン を標 的 と した も の で,重 層 上 皮 型 ケ ラ チ ン と 呼 ば れ,正 常 表 皮 に も存 在 す る. 一 方,抗 サ イ トケ ラ チ ン19抗 体(40kD)と ケ ラ チ ン5 D 3抗 体(40,45,52,2kD)が 認 識 す る
皮 膚器 官培 養 を用 い た黄 ブ菌 性表 皮剥 脱素Aの 検 討
553
ケ ラ チ ン は 分 子 量 が 小 さ く,胃,腸,肝,胆 嚢, 膵 臓 な ど に 分 布 し,単 層 上 皮 型 ケ ラチ ン と呼 ば れ る32).ケ ラ チ ンPKK 1は 同 じ く小 分 子 ケ ラ チ ン(40,45,52,5kD)を 認 識 す る が,表 皮 は 基 底 層 を認 識 す る こ とが 特 徴 的 と さ れ て い る33). 今 回 の 実 験 で は,ETAで 処 理 した 器 官 培 養 皮 膚 切 片 も処 理 し な か っ た 皮 膚 切 片 も,上 記 の 報 告 に 見 られ る 正 常 表 皮 の 染 色 態 度 とほ ぼ 同 一 の 染 色 態 度 を示 し た こ と よ り,ETAが こ れ らの 表 皮 細 胞 分 化 マ ー カ ー や 細 胞 骨 格 に ほ と ん ど影 響 を与 え ず に 表 皮 剥 脱 作 用 を発 現 し て い る こ とが 示 唆 され た. ヒ ト正 常 表 皮 組 織 で はEGF-Rは 基 底 層 及 び 基 底 層 の2∼3層 上 方 の 有 棘 細 胞 な ど の,増 殖 能 を有 す る細 胞 に 限局 して い る34) 35) 36).ま た,報 告 に よ っ て は 表 皮 の 上 部4層 程 の 細 胞 に も 陽 性 反 応 が 出得 る こ とが 知 ら れ て い る34).EGF-Rは, 後 述 す る 天 疱 瘡 抗 原 な どが 属 す る カ ドヘ リン-Eと そ の 局 在 分 布 が 非 常 に 似 て お り34)ETAに よ る処 理 に よ っ て ど の よ う な 変 化 を受 け るか 調 べ た.EGFはEGF-Rと は 逆 に,増 殖 能 を 有 さ ず 分 化 した 腺 細 胞 な ど で 陽 性 に な り,分 化 の マ ー カー と して 用 い ら れ る.正 常 表 皮 で は 陰 性 で あ る34). 次 に 最 近 数 々 の 感 染 症 や,炎 症 性 疾 患 で 表 皮 細 胞 に様 々 な 細 胞 表 面 マ ー カ ー が 発 現 し て,皮 膚 に お け る 免 疫 応 答 ・発 症 機 序 に 重 要 な 役 割 を 果 た して い る こ とが 報 告 され て きて い る37).黄色 ブ ドウ球 菌 ま た は 連 鎖 球 菌 感 染 症 の 分 野 で も, そ の 外 毒 素 す な わ ちtoxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1), Staphylococcal enterotoxins (SEs), Streptococcal pyrogenic exotoxins (SPEs)な どに よ るTリ ンパ 球 の 活
性 化 が, toxic shock syndrome (TSS)の 発 症 に 深 く係 わ っ て い る こ とが 知 られ て い る38).すな わ ち,こ れ らの 外 毒 素 はsuperantigenと し て 生 体 内 に 広 く分 布 す るMHCク ラ スII陽 性 細 胞 を 活 性 化 し,引 き続 い て 大 量 の リン フ ォ カ イ ン, モ ノ カ イ ン の 過 剰 産 生 を招 きTSSで 見 られ る 臨 床 症 状 を 引 き 起 こ す と 考 え ら れ て き て い る39) 40) 41).ETAも マ ウ スTリ ン パ 球 活 性 化 能 を 持 つ と い う報 告40) 42)や,逆 にsuperantigenで は な い43)とい う 報 告 も な さ れ て い る.今 西42)らは こ のETAが 持 つsuperantigenと し て のTリ ンパ 球 活 性 化 能 がSSSSの 時 に 見 られ る全 身 の 潮 紅, 発 熱 等 の 炎 症 所 見 を 説 明 す る と して い る.ETA が 本 当 にsuperantigenか 否 か は 議 論 の 残 る所 で あ る が,表 皮 に お け る 炎 症 反 応 のinitiaterと し て 知 られ る以 下 の3つ の 細 胞 表 面 マ ー カ ー を検 討 し た. TNF-α は極 め て 広 範 な 作 用 を持 ち,T細 胞, B細 胞,マ ク ロ フ ァ ー ジ を活 性 化 し,表 皮 細 胞 に よ る他 の サ イ トカ イ ン の産 生 を誘 導 し た り,血 管 内 皮 細 胞 に よ る細 胞接 着 分 子(CAM)の 発 現 を 誘 導 す る44).ま た前 述 の 細 菌 毒 素 性shockに も TNF-α とIL-1が 関 与 す る38) 45) 46)とされ て い る. ICAM-1は 正 常 状 態 の 表 皮 細 胞 に は そ の発 現 が 認 め られ な い が,種 々 の 炎 症 性 疾 患 で 発 現 さ れ る37).ICAM-1は,前 述 のTNF-α や γ-IFN に よ り血 管 内 皮 細 胞 に発 現 して 白 血 球 のCD-43, LFA-1な どの リガ ン ドと結 合 し,炎 症 部 局 所 へ の 白 血 球 の 遊 走 を 媒 介 し,局 所 で の 炎 症 の 引 き 金 とな る と推 測 さ れ て い る47) 48). HLA-DR抗 原 は 正 常 表 皮 細 胞 で は 認 め られ な い がgraft-versus host diseaseや,自 己 免 疫 性 疾 患 で 発 現 さ れ て く る49). 結 果 的 に は ケ ラチ ンに よ る 免 疫 染 色 と同 じ く, こ れ らの 細 胞 膜 表 面 マ ー カー もETA処 理 の 有 無 に よ る有 意 差 は 認 め 得 な か っ た こ と よ り,こ れ らの サ イ トカイ ンや 細 胞 接 着 因 子 を介 したETA の 作 用 機 序 は 明 らか に で き な か っ た. 3. 蛍 光 抗 体 間 接 法 最 近 自 己免 疫 性 水 疱 症 の 抗 原 物 質 が 明 ら か に な りつ つ あ る.そ の う ち,先 に も述 べ たSSSS の 組 織 学 的 病 変 部 位 の 類 似 が 注 目 さ れ る落 葉 状 天 疱 瘡 の 抗 原 は160kDの 分 子 量 を有 す るデ ス モ グ レ イ ンIそ の もの で あ る こ とが証 明 さ れ た50). こ の デ ス モ グ レ イ ンIはE-カ ドヘ リン の 一 種 で,表 皮 細 胞 間 を 接 着 す る デ ス モ ゾ ー ム の 重 要 な 構 成 成 分 で あ る.天 疱 瘡 抗 体 は こ の デ ス モ ゾ ー ム に 対 す る 直 接 の 阻 害 作 用 を持 つ と考 え ら れ て きて い る.一 方 尋 常 性 天 疱 瘡 抗 原 は,基 底 細 胞 の よ うな 低 分 化 の 表 皮 細 胞 が 発 現 す る,低 分 子(130kD)の デ ス モ グ レ イ ン類 似 の 蛋 白 質 で あ る こ とが 解 明 され て き て い る51) 52). ETA処 理 に よ り落 葉 状 天 疱 瘡 患 者 血 清 の 蛍 光
の み 明 らか な 減 退 を 見 た こ と はETAが 落 葉 状 天 疱 瘡 と 同 じ デ ス モ グ レ イ ンIに 対 し て 直 接 ま た は 間 接 的 に 作 用,或 い は結 合 を し,そ の た め 後 に 落 葉 状 天 疱 瘡 抗 体 と対 応 抗 原 との 結 合 を阻 害 し た 可 能 性 が あ る と考 え られ た.し か し,ETA 処 理 の 時 間 が,3時 間 よ り も6時 間 で よ りは っ き り と した 細 胞 間 蛍 光 の 減 退 を認 め た こ とは, 実 際 に 表 皮 細 胞 の 細 胞 間 の 接 合 が 離 れ て か ら さ らに 数 時 間 を 要 し た こ とに な る.従 っ て,こ の 変 化 が 二 次 的 な変 化 に す ぎ な い 可 能 性 も あ り, 更 に別 の 落 葉 状 天 疱 瘡 患 者 血 清 を 用 い て の検 討 を重 ね る 必 要 が あ る. ま た,ETAが 表 皮 細 胞 表 面 に 結 合 し た 後 どの 様 な機 序 で 細 胞 接 合 の 離 解 が 起 こ る の か,ど の 様 な 機 序 で 落 葉 状 天 疱 瘡 抗 原 を変 化 ∼ 消 失 させ る の か,な ど も ま だ解 っ て い な い が,死 亡 した 新 生 仔 マ ウ ス で もETAに よ る表 皮 剥 離 を 認 め る こ と53),ホル マ リ ン 固定 し たマ ウ ス で も同 じ く 表 皮 剥 離 を 認 め る こ と(未 発 表 デ ー タ)よ り, 細 胞 内 の 代 謝 経 路 の 関 与 は 少 な い と思 わ れ る. 結 論 今 回,ヒ ト正 常 皮 膚 器 官 培 養 を 材 料 と し て ETAを 作 用 させ,経 時 的,濃 度 依 存 的 に 顆 粒 層 に て 表 皮 剥 脱 が 起 こ る こ と を確 認 した. ETA処 理 に よ り細 胞 骨 格 蛋 白 であ り分 化 の指 標 で もあ る ケ ラ チ ン蛋 白,終 末 角 化 の マ ー カ ー で あ る イ ン ボ ル ク リ ン,細 胞 接 合 部 に 局 在 して い る表 皮 成 長 因 子 受 容 体,表 皮 成 長 因 子,さ ら に 炎 症 性 皮 膚 疾 患,細 菌 感 染 症 で 見 られ る表 皮 細 胞 の 細 胞 表 面 マ ー カ ー の 変 化 の 有 無 を免 疫 酵 素 抗 体 法 を用 い て 調 べ たが,対 照 と の 間 に 有 意 差 を認 め な か っ た. 表 皮 細 胞 間 の 接 着 に 重 要 な役 割 を果 た して い る160kDデ ス モ グ レ イ ンIがETAに よ り ど の 様 な変 化 を来 す か 調 べ た.そ の 結 果 落 葉 状 天 疱 瘡 患 者 血 清 に よ る 間 接 法 の 蛍 光 は,ETA処 理 に よ り明 らか に 減 退 し た が,対 照 の 尋 常 性 天 疱 瘡 患 者 に よ る 間 接 法 の 蛍 光 はETA処 理 に よ りむ し ろ軽 度 増 強 す る傾 向 を示 し た.水 疱 性 類 天 疱 瘡 はETA処 理 に よ る 変 化 を受 け な か っ た.こ れ ら の 結 果 よ り,ETAは 落 葉 状 天 疱 瘡 抗 原(す な わ ち デ ス モ グ レ イ ンI)を 標 的 と し,サ イ ト カ イ ン な ど を 介 さ な い機 序 に よ り,表 皮 剥 脱 が 起 こ り得 る こ とが 示 唆 され た. 謝 辞 稿 を終 え る に臨 み,懇 切 な る御 指 導,御 校 閲 を賜 りま した岡 山大 学 医 学部 皮 膚科 学教 室 荒 田次 郎教 授 に心 よ り深謝 致 し ます.ま たETAの 分 離 精 製 法 を 御 指 導 頂 きま した,東 京慈 恵会 医 科大 学 医科 学研 究 所 遺 伝 子工 学研 究 室桜 井 進教 授 に,心 よ り御礼 申 し上 げ ます. 更 に,多 大 な御 協 力 を頂 きま した,岡 山大 学 医学 部 皮 膚 科 学教 室 の 皆様 に心 よ り御 礼 申 し上 げ ます. 文 献
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皮 膚 器 官 培 養 を 用 い た 黄 ブ 菌 性 表 皮 剥 脱 素Aの 検 討 557
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Experimental studies on staphylococcal exfoliative toxin A
Taku YAMADA
Department of Dermatology,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan
(Director: Prof. J. Arata)
We reproduced an in vitro model of staphylococcal scalded skin syndrome or bullous impetigo in human skin explants in culture, using partially purified staphylococcal exfoliative
toxin A (ETA). ETA affects epidermal antigens such as keratins, involucrins, epidermal growth factor, epidermal growth factor receptor, HLA-DR, ICAM-1 and TNF-α were observed using the appropriate monoclonal antibodies. However, expressions of these antigens on cultured skin explants were not influenced by treatment with ETA compared to
the controls without ETA treatment. 160kD desmoglein I is known to have an important role in attaching epidemal cells and is the target antigen of pemphigus foliaceus (PF) antibody.
We examined the effect of ETA on the binding of PF antibody to 160kD desmoglein I by indirect immunofluorescence, using a PE patient's serum. The intensity of the fluorescence of the bound antibody was clearly reduced by ETA pretreatment. The binding of pemphigus vulgaris antibody did not seem to be influenced by ETA pretreatment. ETA did not have any effect on the binding of pemphigoid antibody to the basement membrane zone.
These results suggest that the binding site of ETA is closely related to PF antigen (desmoglein I) and that the epidermolysis by ETA occurs without involvement of cellular or humoral factors in the host.
