ラ ッ ト皮 膚細 胞 の 関与 す る免疫 反 応へ の紫 外 線 の影 響
岡 山 大 学 医 学 部 第 一 外 科 学 教 室(指 導:折 田 薫 三 教 授) 高 橋 健 治 (平 成6年12月2日 受 稿) Key words:皮 膚 細 胞,免 疫 反 応,紫 外 線 緒 言 最 近 フ ロ ン ガ ス に よ る オ ゾ ン層 の 破 壊 が 世 界 的 な 環 境 問 題 と な り,紫 外 線 の 生 物 に 及 ぼ す 影 響 が 注 目 さ れ る よ う に な っ た.紫 外 線 の う ち 地 表 に 到 達 す る も の はUV-A (320∼400nm)と UV-B (280∼320nm)で あ る.し か し生 物 に 及 ぼ す 影 響 が 問 題 視 さ れ て い る の は 寧 ろUV-Bで あ る. UV-Bは 表 皮 と真 皮 の 上 層 ま で し か 透 過 で き な い.そ の 影 響 を受 け る 細 胞 は 主 に 表 皮 に あ る 細 胞 で あ る.ま たUV-Bが 免 疫 反 応 に 影 響 を 与 え る と い う報 告 も 多数 あ る1)∼3).一方,我 々 は 皮 膚 細 胞 が 各 種 の 免 疫 反 応 に お い て 重 要 な 役 割 を 演 じて い る こ と を報 告 し て きた4)∼7).そこ で 我 々 は,皮 膚 細 胞 が 関 与 す る 免 疫 反 応 に お い て UV-Bが ど の よ うに 影 響 を 及 ぼ す か をin vitro に て 検 索 し た の で 報 告 す る. 材 料 と 方 法 1. 実 験 動 物 日本 チ ャ ー ル ズ リバ ー 社 及 び 静 岡 県 実 験 動 物 農 業 組 合 に て 繁 殖 及 び 維 持 さ れ て い る6∼10週 令 の 雌 性 近 交 系 ラ ッ トF344 (RT11V1)とWKA (RT1K)を 購 入 し て 使 用 し た.購 入 ラ ッ トは 岡 山 大 学 医 学 部 附 属 実 験 動 物 施 設 に てspecific path ogen freeの 状 態 で 使 用 ま で 飼 育 し た. 2. 培 養 液 の 調 整 各 種 細 胞 の 浮 遊 及 び ア ッ セ イ に 用 い た 培 養 液 はRPMI 1640に25mM HEPES緩 衝 液 及 び10% 牛 胎 児 血 清(GIBCO社, USA),抗 生 剤(1% PenicillinG, 1% Streptomycin)を 添 加 した も の を使 用 し た. 3. 各 種 細 胞 浮 遊 液 の 作 製 1) 皮 膚 細 胞 浮 遊 液 の 作 製 皮 膚 細 胞 は 田 中 等 の 方 法5)に よ り作 製 し た.ラ ッ ト尾 皮 膚 を70%エ タ ノー ル で 消 毒 し た 後,皮 膚 を 基 底 膜 層 あ た りで 剥 離 し 短 冊 状 に 細 切 し, 0.5%ト リプ シ ン 溶 液 で37℃, 3時 間 浮 遊 消 化 し て 残 存 し て い る 真 皮 成 分 を の ぞ き, 0.025% D N ase溶 液 中,表 皮 基 底 細 胞 層 側 よ り ガ ラ ス 棒 に よ る擦 過 で 皮 膚 細 胞 を 単 離 し た.単 離 細 胞 浮 遊 液 は150メ ッ シ ュ フ ィ ル ター を通 過 させ て 混 入 物 を 除 去 し,リ ン 酸 緩 衝 液(PH 7.4, 0.15M) に よ り洗 浄 して 最 終 的 に 培 養 液 に 浮 遊 し た.こ の 細 胞 浮 遊 液 に は,皮 膚 上 皮 細 胞 お よびLanger hans細 胞 が 含 まれ て お り,リ ンパ 球 の 混 入 は1% 以 下 で あ っ た.以 下,皮 膚 上 皮 細 胞 とLanger hans細 胞 を 含 む もの を 皮 膚 細 胞 と い う. 2) 脾 細 胞 浮 遊 液 の 作 製 エ ー テ ル 麻 酔 下 に ラ ッ ト を脱 血 屠 殺 し た 後, 無 菌 的 に 脾 臓 を 摘 出 し た.脾 は リ ン 酸 緩 衝 液 中 に ペ ー ス ト状 に 細 切 し て 浮 遊 させ た.浮 遊 液 中 の 混 入 赤 血 球 は0.75%塩 化 ア ン モ ニ ウ ム 処 理 に よ り破 壊 し て150メ ッ シ ュ フ ィ ル ター を 通 過 させ て 夾 雑 物 を除 去 し,最 終 的 に 培 養 液 に 浮 遊 した. 3) K562継 代 腫 瘍 Natural Killer (NK)活 性 の 標 的 細 胞 と し て 岡 山 大 学 第 一 外 科 に お い て 継 代 培 養 してい るNK 感 受 性 腫 瘍K562(慢 性 骨 髄 性 白 血 病 細 胞)を 用 い た. 4. UV-B照 射 光 源 と して は280∼320nmの 波 長 を持 ち312nm に ピー ク を持 つVilber Loumat社 製VL-6LM を用 い た.線 量 設 定 には 同 社 のVLX radiometer 6162
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で 線 量 を 測 定 して 決 定 した.照 射 は 光 源 か ら細 胞 浮 遊 液 ま で の 距 離 を13cmと して,各 細 胞 に た い す る 照 射 は 脾 細 胞5×107個/5mlに 対 し て 5∼40mJ/cm2,皮 膚 細 胞1×107個/2mlに 対 し て 5∼150mJ/cm2, K562細 胞5×105個/2mlに 対 し て50, 100, 150mJ/cm2を 総 照 射 線 量 と し た. 5. 試 験 管 内 免 疫 検 査 法 1) Mitogenに よ る リ ン パ 球 幼 若 化 反 応 U底 の マ イ ク ロ プ レー ト(Corning社, USA, 96 well)に,未 処 理 脾 細 胞 お よ び5, 10mJ/cm2のUV-B照 射 を 行 っ たF344脾 細 胞(5×105個/ well)に 各 種mitogen (0.1ml/well): PHA (10 μg/ml), Con A (25μg/ml), LPS (100μg/ml)
を 添 加 し て, 5% CO2・37℃ の 加 湿 培 養 器 で48 時 間 培 養 し て, 3H-Thymidineを1μCi/well加
え て 更 に24時 間 培 養 し て 脾 細 胞 の3H-Thymidineの 取 り込 み を 測 定 し た.
2) Mixed Lymphocyte Response (MLR) MLRの 反 応 細 胞 に はWKA脾 細 胞 を,刺 激 細 胞 に はF344脾 細 胞 を 用 い て, U底 の マ イ ク ロプ レ ー トに 反 応 細 胞 及 び 刺 激 細 胞 を5×105個/ wellず つ 混 合 し て72時 間 培 養 し た.な お 刺 激 細 胞 に は正 常 脾 細 胞 と10ま たは20mJ/cm2のUV-B照 射 を行 っ た 脾 細 胞 の 両 者 を使 用 し,混 合 培 養 の 前 に 刺 激 細 胞 は25μg/mlのmitomycinCに よ り 処 理 を 行 っ た. 72時 間 培 養 後 に3H-Thymidine を添 加 し て 更 に24時 間 培 養 し て 反 応 細 胞 の3H-Thymidineの 取 り込 み を測 定 し た.
3) Mixed Lymphocyte-Skin Cell Response (MLSR) MLSRは 田 中 等 の 方 法6)に 準 じて 行 っ た.反 応 細 胞 に はWKA脾 細 胞 を用 い,刺 激 細 胞 に は 未 照 射 ま た は20mJ/cm2照 射 のF344皮 膚 上 皮 細 胞 を用 い てU底 マ イ ク ロ プ レー トに て 反 応 細 胞5×105 個/wellと 刺 激 細 胞2.5×105個/wellを96時 間 混 合 培 養 し た. 96時 間 後3H-Thymidineを 添 加 し て 更 に24時 間 培 養 し て,反 応 細 胞 に 取 り込 ま れ た3H-Thymidineを 測 定 した.
4) Natural Cytotoxicity Assay
我 々 は 正 常 ラ ッ ト脾 細 胞 が 同 系 お よ び 同 種 の 皮 膚 細 胞 に 対 してNK活 性 を持 っ て い る こ とを報 告 し て い る7). ラ ッ ト皮 膚 細 胞 をNa251CrO4300μCiで2時 間 標 識 し,そ の1×104個/wellをU底 マ イ ク ロ プ レー トに て 脾 細 胞 と皮 膚 細 胞 の 割 合 を100対1の 割 合 で 混 合 して12時 間 培 養 し た.培 養 後 上 清 を 採 取 して 遊 出 し た5)Crを 測 定 して 以 下 の 算 出 式 に よ り殺 細 胞 能 を 算 出 した.ま た,対 照 と し て K562腫 瘍 細 胞 を100μCiの51Crで1時 間 標 識 し て, 4時 間 培 養 に よ り殺 細 胞 能 を 測 定 し た. UV -B照 射 の 影 響 を み る た め に 攻 撃 細 胞 に5 , 10, 20, 40mJ/cm2照 射 し,標 的 細 胞 に50, 100, 150mJ/ cm2の 照 射 を行 っ た.
%51Cr release =exp. release-spont. release / maxim. release-spont. release
×100 5) 統 計 学 的 検 討 数 値 お よ び グ ラ フ は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で示 し, 統 計 学 的 検 討 はWilcoxon検 定 に よ り危 険 率 5%以 下 の 場 合 を 有 意 と し た. 結 果 1. Mitogenに 対 す る リン パ 球 幼 若 化 反 応 に お け るUV-Bの 影 響 Fig. 1の 如 く, 5ま た は10mJ/cm2の 照 射 に よ りPHA, ConA, LPSの い ず れ のmitogenに 対 す る 反 応 も抑 制 さ れ た.こ の 際,照 射 量 に よ っ て抑 制 効 果 に 変 化 が な く,リ ンパ球 のmitogen反 応 の 抑 制 に は5mJ/cm2で 充 分 と考 え られ た.
2. リン パ 球 混 合 培 養 法(MLR)に お け るUV-B の 影 響
Fig. 1 UV-B照 射 のmitogen反 応 に 対 す る影 響 F344脾 細 胞(5×105個/well)を5ま た は 10mJ/Cm2のUV-Bで 処 理 し た 後 に 各 種 mitogenと 混 合 し て48時 間 培 養 し た . MLRに お け るUV-B照 射 の 影 響 をみ る と,脾
細 胞 の 刺 激 性 は 未 照 射 の 場 合 に 比 べ10mJ/cm2照 射 で65.2%,さ らに20mJ/cm2照 射 で は30.4%と 減 弱 し た(Fig. 2). 3. リ ンパ 球 皮 膚 混 合 培 養 法(MLSR)に お け るUV-Bの 影 響 UV-B照 射 に よ るMLSRへ の 影 響 は, F344皮 膚 細 胞 をUV-B 20mJ/cm2の 照 射 で 前 処 理 し て WKA脾 細 胞 と混 合 培 養 す る と,照 射 しな か っ た コ ン トロ ー ル群 に 対 して54 .6%ま で 反 応 が 抑 制 さ れ た(Fig. 3).従 っ て,皮 膚 細 胞 も脾 細 胞 と 同 様 にUV-B照 射 に よ り抗 原 性 が 減 弱 し,反 応 細 胞 の 抗 原 認 識 が 低 下 す る と考 え られ た.
4. Natural Cytotoxicity Assayに お け る UV-B照 射 の 影 響 Fig. 2 UV-B照 射 のMLRに 対 す る影 響 未 処 理WKA脾 細 胞(WKA-sp)をUV-B (10ま た は20mJ/cm2)で 処 理 したF344脾 細 胞 (F344-sp)と 混 合 培 養 し た. Responder:Stimulator=1:1 Fig. 3 UV-B照 射 のMSLRに 対 す る 影 響 未 処 理F344 (F344-sp)ま た はWKA脾 細 胞(WKA-sp.)をUV-B (20mJ/cm2)で 処 理 し たF344皮 膚 細 胞(F344-sk)と 混 合 培 養 し た. Responder:Stimulator=2:1
Fig. 4 UV-B照 射 のNatural Cytotoxicityに 対 す る 影 響(1) F344脾 細 胞(F344-sp)に 漸 増 的 にUV-B 照 射 し, F344皮 膚 細 胞 ま た はK562腫 瘍 細 胞 に 対 す る 殺 細 胞 能 を 測 定 し た.(数 値 は UV-B非 照 射 群 に 対 す る 百 分 率 で 表 現 し た.) 皮 膚 細 胞 に 対 す る脾 細 胞 のNK活 性 に 及 ぼ す UV-Bの 影 響 を, K562細 胞 を一 方 の 標 的 細 胞 と して 比 較 検 討 した.ま ず,攻 撃 細 胞 で あ る脾 細 胞 をUV-B照 射 しcytotoxicity assayを 行 うと, Fig. 4の 如 くF344皮 膚 細 胞 に 対 しF344脾 細 胞 の 殺 細 胞 能 は,照 射 量 を増 加 して ゆ くに従 っ て 低 下 し, 20mJ/cm2で は 未 照 射 時 の 殺 細 胞 能 の58.7 %ま で 減 弱 し た.ま た, K562細 胞 に 対 し て も 同 様 に, F344脾 細 胞 の 殺 細 胞 能 は 照 射 量 と と も に 減 弱 し,皮 膚 細 胞 を 標 的 細 胞 と し た 場 合 と 差 は
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な か っ た. 一 方,標 的 細 胞 をUV-Bで 照 射 す る と, K562 細 胞 は 照 射 量 を50か ら150mJ/cm2ま で 増 量 し て も 脾 細 胞 に 対 す るNK感 受 性 は 変 化 な く,か え っ て 感 受 性 が 増 強 され る傾 向 が あ っ た(有 意 差 な し). しか し,皮 膚 細 胞 に 照 射 を 行 っ た 場 合, 50mJ/cm2 よ り感 受 性 の 低 下 が 認 め られ150mJ/cm2の 照 射 で は,未 照 射 群 に 比 較 して58.4%ま で 感 受 性 が 低 下 した.各 照 射 群 の 反 応 は 統 計 学 的 に 有 意 の 差 を 持 っ て い た(Fig. 5).ま た こ の 場 合, UV-B 照 射 自体 が 皮 膚 細 胞 に 障 害 性 を 示 す か 否 か に つ い て, 50, 100, 150mJ/cm2のUV-B照 射 を行 い, 51Crで 標 識 し た 皮 膚 細 胞 のviabilityの 変 化 , 51Crの 総 標 識 量,及 びassay時 のspontaneous releaseを 比 較 し た が,特 に 有 意 差 は な く, UV-B に よ る 直 接 の 影 響 は な い と 考 え ら れ た (Table 1).Fig. 5 UV-B照 射 のNatural Cytotoxicityに 対 す る 影 響(2) F344脾 細 胞 の,漸 増 的 にUV-B照 射 したF 344皮 膚 細 胞 ま た はK562腫 瘍 細 胞 に 対 す る 殺 細 胞 能 を 測 定 し た.(数 値 はUV-B非 照 射 群 に 対 す る 百 分 率 で 表 現 し た.) 考 察 今 回 我 々 は,免 疫 反 応 を構 成 す る 抗 原 認 識 相 と 組 織 破 壊 相 の2つ の 相 に お け る 紫 外 線 の 影 響 を検 討 した. ま ず 抗 原 認 識 相 に お け るUV-Bの 影 響 は,リ ン パ 球 に 紫 外 線 照 射 しmitogenに よ る リン パ 球 幼 若 化 反 応 へ の 影 響 を 調 べ て み る と, Judith O. Pretell等8)がPHAを 用 い て 行 っ た よ う に, ConA, LPSに お い て も リ ンパ 球 の 幼 若 化 は 抑 制 さ れ た.こ れ は 紫 外 線 に よ る リン パ 球 のmitogen receptorへ の 障 害 も一 因 で は な い か と考 え られ た. 次 にMLRに お い て,刺 激 細 胞 で あ る 脾 細 胞 へ のUV-B照 射 に よ り 反 応 細 胞 の3H-Thymidine の 取 り込 み が 抑 制 さ れ た.
Table 1 Viability of Skin Cells in Natural Cytotoxicity 各 照 射 量 に お け るF344皮 膚 細 胞 の 細 胞 活 性 次 に 行 っ たMLSRに お い て も,刺 激 細 胞 で あ る皮 膚 細 胞 にUV-B照 射 す る と反 応 細 胞 の3H-Thymidineの 取 り込 み が 抑 制 され た.こ れ はJ. Czernielewski等9)の 述 べ て い る よ う に, MLSR に お い て リン パ 球 刺 激 に 必 須 の 存 在 で あ るLan gerhans細 胞 が,一 時 的 に 機 能 低 下 を起 こ し た た め で あ ろ う と考 え られ る.ま た, Werner Aberer 等10)に よ る とLangerhans細 胞 をUV-B照 射 す る こ と に よ り細 胞 表 面 抗 原 で あ るIa抗 原 が 消 失 し て し ま っ た と報 告 して い る.こ れ ら の こ と は 細 胞 表 面 で の 紫 外 線 の 障 害 を 示 す も の で あ る. 次 に 免 疫 反 応 の 組 織 破 壊 相 に 対 す る 影 響 を 検 討 し た.標 的 細 胞 に 皮 膚 細 胞 を 用 い たNatural Cytotoxicity Assayに お い て,皮 膚 細 胞 にUV
-B照 射 した 場 合,そ のviabilityに 変 化 を起 こ す こ とな く,そ のNK活 性 の 感 受 性 が 照 射 量 依 存 性 に 低 下 し た.こ の こ とは 紫 外 線 の 皮 膚 細 胞 表 面 へ の 影 響 に よ る と考 え る と,皮 膚 細 胞 表 面 の NK抗 原 決 定 基 の 障 害 が起 き,そ れ に よ り皮 膚 細 胞 のNK細 胞 に 対 す る感 受 性 が低 下 したた め であ る と 説 明 で き るか も し れ な い.た だ し注 目す べ き 点 は, MLSRに お け る 皮 膚 細 胞 の 細 胞 刺 激 性 のUV-B照 射 の 影 響 と,皮 膚 細 胞 のNK細 胞 に 対 す る 感 受 性 のUV-B照 射 の 影 響 とを 比 較 す る と,照 射 線 量 が 後 者 の 場 合 の 方 が よ り 多 く必 要 と した こ と で あ る.こ の こ と は, MLSRに お け る 刺 激 能 はLangerhans細 胞 に 主 体 が あ り, NK 細 胞 に 対 す る 感 受 性 は 皮 膚上 皮 細 胞 に 主 体 が あ る と説 明 され るか も しれ な い.ま た,リ ンパ 球 の う ちNK細 胞 は 皮 膚 細 胞 の 増 殖 やcar tinogenesis等 に お け る 免 疫 防 御 機 構 に 関 わ って お り11), NK活 性 の 感 受 性 の 低 下 は 免 疫 監 視 か ら の 離 脱 を 意 味 す る.こ の よ うに, UV-Bは 皮 膚 細 胞 に 対 し て,核DNAレ ベ ル で の 障 害 の 他 に も 細 胞 表 面 レベ ル に お い て も様 々 な 形 で 影 響 を 及 ぼ して い る と考 え ら れ た. 結 論 ラ ッ ト脾 細 胞 及 び 皮 膚 細 胞 に 対 す るUV-B照 射 の 影 響 を検 討 し た. 1) UV-B照 射 に よ り リンパ 球 のmitogenに 対 す る幼 若 化 反 応 が 抑 制 され た. 2) UV-B照 射 に よ り脾 細 胞 及 び 皮 膚 細 胞 の 抗 原 提 示 能 が 減 弱 した. 3) UV-B照 射 に よ り脾 細 胞 の 殺 細 胞 能 が 減 弱 した. 4) UV-B照 射 に よ り皮 膚 細 胞 のnatural cytotoxicityの 感 受 性 が 低 下 した. 稿 を終 え るに あ た り御 指 導,御 校 閲 を賜 った折 田 薫 三 教授 に深 甚 な る 謝意 を捧 げ る と共 に,終 始御 指 導 を賜 りま した 田 中 信一 郎 先生 に深 謝 い た します. 文 献
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