市販茶系飲料の示すフリーラジカル消去活性

平 成14年12月 (2002年) 一33一

調 査報 告

市 販 茶 系 飲 料 の示 す フ リー ラ ジ カル 消 去 活 性

中川 一 夫,仲

村

明子,松

永 博 絵

Free radical scavenging

activities

of tea drinks on the market

Kazuo Nakagawa,

Akiko Nakamura

and Hiroe Matsunaga

Tea drinks, prepared from the tea plant classified as Camellia sinensis, contain antioxidative phenolic compounds, like catechins and flavonols. We evaluated the free radical scavenging activities of tea drinks on the market by measuring luminol-amplified chemiluminescence stimulated by the free radical initiator 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, and the absorption of 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) radical cation at 734 nm. Black tea drinks and green tea drinks mostly showed high free radical scavenging activities in either assay, followed in order by oolong tea drinks and blend tea drinks that contain extracts from plants other than the tea plant. Total phenol contents in tea drinks highly corre-lated with their free radical scavenging activities, indicating polyphenols in tea drinks are the major com-ponents contributing to the free radical scavenging activities of tea drinks.

1.は じ め に 全 国清 涼 飲 料 工 業 会 の 統 計 資 料1)に よ る と,非 ア ル コ ール 系 飲 料 で あ る清 涼 飲 料 の な か で 茶 系飲 料 の 2001年 に お け る生 産 量 は482万8千 キ ロ リ ッ トル と も っ とも 多 く,酒 類 や 牛 乳 ・乳 飲 料 を除 く飲 料 に 占 め る シ ェ ア は30.4%に な っ て い る(図1)。 最 近 数 年 間 の 生産 量増 加 率 も 大 き く,2001年 に お け る清 涼 飲 料 全 体 の 生 産 量 は1997年 の113.6%で あ る の に 対 し て,茶 系 飲 料 の 生 産 量 は124.6%に な っ て い る。 そ の 要 因 と して,茶(茶 樹Camellia sinensisの 葉 を原 料 とす る飲 料)を 利 用 す る歴 史 が長 い うえ に,自 動 販 売 機 の普 及 や コ ン ビニ エ ン ス ス トア の 増 加 で 手軽 に の め る飲 料 とな っ た こ と,後 口が 良 い こ と,健 康 に 良 い と思 われ て い る こ とな ど様 々 な理 由 が 考 え ら れ る。 茶 樹 か らつ く られ る茶 の 製 法 は,茶 樹 の 品 種 や 産 地,伝 播 経 路,民 族 的 背 景 の 違 い な どに よ り多 種 多 様 に 分 化 して い る が,茶 は ふ つ う不 発 酵 茶(煎 茶 や 玉 露 な どの 緑 茶),半 発 酵 茶(ウ ー ロ ン茶 な ど),発 京都 女子 大 学家 政学 部食 物 栄養 学科 衛 生学 第 一研 究 室 酵 茶(紅 茶),お よび 後 発 酵 茶(黒 茶 な ど)に 大 別 さ れ る。198玉年 に 缶 入 りウ ー ロ ン茶 が 発 売 され て 以 来 多 くの メ ー カ ー か ら各 種 容 器 入 りの茶 飲 料 が生 産 さ れ,2001年 で は そ の 数 は800種 類 以 上 に及 ん で い る。 これ は 先 に見 た 生 産 量 の推 移 と同様 に,消 費 者 の 期 待 す る利 便 性 や 健 康 志 向 に合 致 す る飲 料 と して 受 け 入 れ られ て い る こ と を示 す 数 値 で あ ろ う。 茶 葉 に 含 ま れ る成 分 の うち カ フ ェ イ ン の 中枢 神 経 興 奮 作 用 は よ く知 られ て い る と こ ろ で あ る が,最 近 は カ テ キ ン類 の 示 す 様 々 な 生 体 機 能 に対 す る作 用 が 注 目 され て い る 。 カ テ キ ン 類 の 生 体 作 用 と して は, 抗 酸 化 作 用,抗 腫 瘍 作 用,抗 菌 作 用,血 糖 上 昇 抑 制 作 用 な ど 多 く の 生 理 機 能 へ の 影 響 が 報 告 され て い る2-5)。 しか し茶 の 生 体 機 能 成 分 お よび そ の 含 有 量 は 茶 の種 類 に よ っ て 大 き く異 な る。 本 報 告 で は カ テ キ ン類 の 抗 酸 化 性,特 に フ リー ラ ジカ ル 消 去 作 用 に着 目 して 市 販 茶 飲 料 を評 価 す る こ と を 目的 と した 。茶 飲 料 は 緑 茶 飲 料,紅 茶 飲 料,ウ ー ロ ン茶 飲 料,お よび 茶 葉 以 外 の植 物 も原 料 と して製 造 され る茶 飲 料(ブ レン ド茶 飲 料)に 分 け て 検 討 し, 容 器 の 種 類 は 特 に考 慮 して い な い 。 結 果 と して 相 対 的 に は 緑 茶 や 紅 茶 の ラ ジ カ ル 消 去 作 用 は 強 く,ウ ー

A: 2001年の清涼飲料生産量 B:主な清涼飲料生産量の年次推移 5000 4500 4000 3500

i

f

3000 ~2500 酬 側 2000 制1500 1000 500 0 1997 1998 1999 2000 ベ3一茶系飲料 -・一炭酸飲料 年 次 一 ← 果 実 飲 料 等 ー岳ースポーツドリンク 2001 --.-コーヒー飲料等 図1清涼飲料の生産量とその年次推移 Aは2001年における各種清涼飲料の生産量を示す。Bは1997"'-'2001年における主要な清涼飲料の生産量の推移 を示す。(社団法人全国清涼飲料工業会編:清涼飲料関係統計資料から作成) ロ ン 茶 の 作 用 強 度 は 両 者 に 次 ぎ ， ブ レ ン ド 茶 の フ リーラジカル消去作用は弱かった。また，茶飲料の フリーラジカル消去作用の強度には，ポリフェノー ル含量が大きく寄与することが判明した。

l

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.

実 験 方 法

試 薬 ルミノール， 2， 2'-azobis (2引 nidinopropane)dihydro -chloride (AAPH)および2，2'-azinobis (3・ethylbenzothi -azolineふsulphonate) (ABTS)は 和 光 純 薬 工 業 ( 大 阪)から購入し， Folin司.Ciocalteu (FC)試 薬 と 3・ cyc1ohexylaminopropane sulfonic acid (CAPS)はナカ ライテスク(京都)から購入した。その他の試薬は 特級試薬を用いた。検体の茶系飲料は京都市内の不 特定の販売庖で購入した。 2. 化学発光法によるフリーラジカル消去活性の測 定法 ルミノールはアルカリ性溶液中で活性酸素種によ り過酸化物中間体を形成するが窒素を放出して分解 し，励起状態を経てアミノフタール酸になるととも に強く発光する。我々はすでにAAPHをラジカル発 生剤として用いてルミノール発光を測定し，フラボ ノイド類のラジカル消去活'性を測定する方法を報告 している6)。今回はこの方法により茶系飲料の希釈 液を検体に用いてラジカル消去活性を測定した。反 応 液 (600μ1)はO.1M CAPS緩 衝 液 (pH10.0)，50 m Mルミノール液， 10mMAAPH液，および検体(30 μ1)から成る。化学発光の測定には Berthold社 製 Lumat LB 9507を 用 い ル ミ ノ ー ル 液 とAAPH液は自 動注入した。反応開始15分後に発光量を 10秒間自 動計測した。没食子酸をポリフェノール化合物の標 準品に用いて発光抑制率に関する検量線を作成し， 茶系飲料のラジカル消去活性を没食子酸量に換算し た 没 食 子 酸 等 価 濃 度 (GEC) として表した。なお， 没食子酸が発光量を50%抑制する濃度(lC50)は約 1.5μMで、あった。茶系飲料は，発光抑制率がおよそ 20"'-'80%の範囲に入るように蒸留水で希釈して用い た。 3. ABTSラジカルカチオンを用いたフリーラジ力 ル消去活性の測定法 ABTSラジカノレカチオンは734nmに吸収を示す比 較的安定なラジカルであるので，吸光光度法7)によ り検体のラジカル消去活性を測定した。測定前日に 7mMABTS水溶液(5ml)と 14.7mM potassium per -sulfate (1 ml)を混和し，測定直前に蒸留水で、希釈し て用いた。このABTS水 溶 液2mlに検体20μlを混 ぜ， 5分後に吸光度を測定した。化学発光法と同様 に没食子酸を標準物質に用いて検量線を作成し，茶 系飲料のフリーラジカル消去活性を没食子酸等価濃 度 (GEC) で表した。なお，この方法による没食子 酸の1C50値は約5，uMであった。 4. ポリフェノール量の測定法 茶系飲料に含まれるポリフェノール量は， Single -ton

V

.

L.らの方法8)を改変したKondoY.らの方法9) により測定した。検体1mlにFC試薬を5ml加えて よく混和し， 500_{Cで5分間保温した。冷却後4mlの} 10%Na2C03液を加え，時々混ぜながら 1時開放置 した後，吸光度を 765nmで測定した。没食子酸を標

平成

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35-表

1

茶系飲料のポリフェノール量とフリーラジカル消去活性 フリーラジカル消去活性 茶系飲料製品

_{GEC (mM:t S}

ポリフェノール量

_D

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_CL

_法

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1

フリ}ラジカル消去活4性は化学発光法

(

C

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法)と

ABTS

ラジカルカチオンの吸光度測定法

(ABTS

法)によ り測定し，没食子酸等価濃度

(

G

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で表した

(

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=

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。ポリフェノール量は没食子酸等価濃度

(

G

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で表 した

(

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。緑茶飲料

(

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) 7

製品，紅茶飲料

(

B

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) 7

製品，ウーロン茶飲料

(

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) 3

製品，およびブレン ド茶飲料

(

B

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T

) 5

製品についての測定結果を示す。 準物質に用いて検量線を作成し，検体中のポリフェ ノール量は没食子酸等価濃度

(

G

E

C

)

で表した。

I

D

. 実験結果および考察

市販茶系飲料を緑茶飲料，紅茶飲料，ウーロン茶 飲料，および緑茶以外の植物成分を含むブレンド茶 飲料に分け，それらに含まれるポリフェノール量を 測定した。また，フリーラジカル消去活性を化学発 光法

(

C

L

法)と

ABTS

ラジカルカチオンを用いた 吸光光度法

(ABTS

法)により測定した。各茶飲料 ごとに測定した結果を表 lに示した。 ポリフェノールの標準品に用いた没食子酸のフ リーラジカノレ消去活性を

50%

消去濃度である

I

C

₅₀値 でみると ，

CL

法での

I

C

₅₀値は

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.

5

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ABTS

法ではむ

M

となった。

CL

法では

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の解裂に伴って生じるペルオキシラジカルが主に反 応に関係している。両測定法における消去有効濃度 の差は，測定に用いたラジカルとの反応性の差に由 来すると考えられる。

I

C

₅₀値の比較からわかるよう に

CL

法は

ABTS

法よりも高感度でフリーラジカル 消去活性の測定ができる。したがって

CL

法により 測定するときには茶系飲料を高倍率で希釈して用い るので，本法は検体の着色や濁りなどをほとんど気 にすることなく測定できる利点をもっ。 今回測定した茶系飲料はわが国で生産されている 製品の一部にしか過ぎないが，茶系飲料の種類によ りフリーラジカル消去活性に違いが見られた。同じ 製茶方法の製品間で比較した消去活性の違いよりも 製茶方法の異なる製品開の消去活性の違いの方が大 きく，茶緑茶飲料や紅茶飲料にフリーラジカル消去 活性の高いものが多かったが，ウーロン茶飲料のラ ジカル消去活性は弱く，ブレンド茶飲料はさらに弱 かった。この傾向は2つのラジカル消去測定法にお いてほぼ一致し，両測定法による

GEC

値は比較的

フラビン類やテアルピジン類などの二次ポリフェ ノールを多く含んでいる。今回我々が用いた FC試 薬によるポリフェノール定量法は，茶飲料中に含ま れるこれらポリフェノールの総量を示すものであ る。当然のことながら個々のポリフェノールの示す フリーラジカル消去効果には違いがあり，製品のポ リフェノール組成により抗酸化作用も異なる10) と 考えられるが，図3に示すように，フリーラジカノレ 消去活性と総ポリフェノール量との聞には，今回用 いたいずれの測定法においても高い相関性が見ら れ，茶飲料のフリーラジカル消去活性にフェノーノレ 化合物が大きく寄与していると考えられる。フラパ ン-3ーオール類が多く含まれる縁茶や二次ポリフェ ノーノレの多い紅茶から製造される茶系飲料のフリー ラジカル消去活性は高かったのであるが，紅茶飲料 であっても製品

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5

に見られるようにポリフェ ノール量が低い製品はフリーラジカル消去活性も低 かった。一方，健康志向を反映して様々な保健機能 を有するとされる植物抽出物を配合したブレンド茶 飲料が販売されているが，それらはポリフェノーノレ 量が少なく，フリーラジカル消去効果も小さかった。 ところで，市販茶飲料の大多数には，抗酸化剤と してアスコルピン酸が添加されている。 FC試薬に よるポリフェノール定量で、はアスコルビン酸が反応 陽性物質となるが，還元型アスコルビ、ン酸量は定量 していないので，ポリフェノール量およびフリーラ ジカル消去活性にアスコノレピン酸がどの程度寄与し ているかは不明である。しかし，ブレンド茶飲料に もアスコルビン酸は添加されているにもかかわらず

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1 2 3 4 5 6 ABTS法によるフリーラジカル消去活性 (mM) 化学発光法 (CL 法)によるフリーラジカル 消去活性と

ABTS

ラジカルカチオン吸光光度 法

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法)によるフリーラジカル消去活 性の相関性 フリーラジカル消去活性は没食子酸等価濃度 (GEC)で表した。 図2 よい相関性を示し，決定係数は R2=0.728となった (図2)

。

茶系飲料の示すフリーラジカル消去作用に寄与す る成分は，すでに抗酸化性に関して多くの報告があ るポリフェノール類が主要なものであると予想でき る。縁茶中には代表的な一次ポリフェノールで、ある (一)エピガロカテキンガレートをはじめとする多種 類のフラパン-3ーオール類やケルセチンなどのフラ ボノール類が多い。また発酵茶の紅茶は，製茶工程 中に一次ポリフェノールが酸化重合してできるテア CL法 ABTS法

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ABTS

ラジカルカチオン吸光光度法

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法)によるフリーラジカル消去活性とポリフェノー ル量との相関性を示し，右図は化学発光法 (CL法)によるフリーラジカル消去活性とポリフェノーノレ 量との相関性を示す。フリーラジカル消去活性は没食子酸等価濃度 (GEC)で表した。 7 6

。

_。

図3

平成 14年 12月 (2002年) フリーラジカル消去活'性が低かったことから，茶系 飲料に含まれるアスコルビン酸のポリフェノール量 やフリーラジカル消去効果への寄与は，それほど大 きなものではないと推察される。 FC試薬を用いた 本法はポリフェノール化合物に対する特異性に少し 欠けるところがあるが，簡便な定量法であり，茶系 飲料においてはフリーラジカル消去活'性とともにそ の抗酸化性の間接的な指標になると考えられる。ま た，本報告で用いた化学発光法は，従来からフリー ラジカル消去効果の測定に用いられているABTS法 とよく相関し，食品の示すフリーラジカル消去活性 の測定に利用可能な高感度測定法であることが示さ れた。 カテキン類やフラボノイド類は腸管吸収過程です でに抱合体形成を受けることが知られており ll，12)， in vitroでのフリーラジカル消去効果が生体内でその ままあらわれるとは限らない。しかし緑茶の摂取が ヒト生体内での抗酸化性を高めるとの報告13-15)が あるので，茶系飲料などフリーラジカル消去活性の 高い食品の調査は，食品成分の保健機能を理解する うえで必要な資料となろう。

N.

要 約

茶樹の葉から製される茶にはカテキン類など，抗 酸化性を示す成分が多数含まれている。茶は最近， 自動販売機の普及などもあって清涼飲料に分類され る茶系飲料としての利用が高まrっているが，本報告 では茶系飲料の抗酸化性をフリーラジカル消去活'性 の面から評価した。茶系飲料は原料茶葉の製法によ り，緑茶飲料，紅茶飲料，ウーロン茶飲料，および 茶樹以外の植物成分を含むブレンド茶飲料に分類し て検討した。フリーラジカル消去活'性はルミノール 発光を利用した化学発光法と， ABTSラジカルカチ オンを測定する吸光光度法により測定した。また， 茶系飲料中のポリフェノール量はFolin-Ciocalteu試 薬を用いる吸光光度法により定量した。カテキン類 など一次ポリフェノール量の多い緑茶飲料やポリ フェノール類の酸化重合した二次ポリフェノール量 の多い紅茶飲料は，フリーラジカル消去活性の高い 製品が多かった。半発酵茶を原料とするウーロン茶 飲料のポリフェノール量は緑茶飲料や紅茶飲料より も少なく，フリーラジカノレ消去活d性も低かった。プ レンド茶飲料のポリフェノール量とフリーラジカル 消去活性はもっとも低かった。以上の結果から，茶 系飲料のフリーラジカル消去活性にはフェノール化 合物が寄与することは明らかであり，茶系飲料のフ - 37-リーラジカル消去活'性測定に用いた 2つの測定法に よる消去活性の相関性は高く，化学発光法は食品の 示すフリーラジカル消去活'性の測定に有効な高感度 測定法であることが示唆された。 謝辞:本研究の一部は平成 13年度京都女子大学・ 京都女子短期大学研究助成の補助を受けたものであ る。

V. 引 用 文 献

1) 社団法人全国清涼飲料工業会編:清涼飲料関係 統計資料 (2002)

2)T.Yamamoto

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R.Juneja

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D.ーC.Chu and M. Kim

(Eds.):

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