はじめに実験血漿由来 mirna の白血病マーカー探索などをはじめとして ( Tanaka M. et al., 2009) 体液中に含まれる RNA が病態の変化に関与していることが知られています近年ではさらに体液中の細胞外小胞特にエクソソームに含まれる RNA が細胞間の情報交換を担

(1)

近年、疾患の臨床研究では非侵襲的なサンプル源として、

Liquid biopsy

が注

目されています。中でも体液中に含まれる細胞外小胞エクソソームに含まれる

マイクロ

RNA

（

miRNA

）は、生体内の

RNase

による分解を免れ、細胞から細

胞へ運搬されていることから、疾患の進行のメカニズム解明やバイオマーカー

として役立てられないか探索が進められています。

アジレントのバイオアナライザは

DNA

や

RNA

、タンパクを高感度に検出でき

る装置で、使用するキットを変えることで様々な濃度のサンプルを泳動するこ

とが可能です。体液中に含まれる

RNA

は、分光光度計で測ることが困難なほ

ど濃度が低いことが多く、そのような低濃度サンプルの場合、

RNA 6000

ピコ

キットが適しています（定性範囲

50 ～

5,000 pg/uL

）。またアジレント

miRNA

マイクロアレイは、組織や培養細胞由来、あるいは

FFPE

由来

total RNA

に含

まれる

miRNA

の解析に実績があり、

5 ケタのダイナミックレンジで

miRNA

の

発現差を検出することが可能です。

本アプリケーションノートでは、

健常人の血清に含まれるエクソソーム由来

RNA

を市販の

3 種類のキットで抽出し、バイオアナライザでの泳動を行いまし

た。また抽出キットで使用が推奨されているスパイクインの検出を行いました。

次に抽出したエクソソーム由来

RNA

をアジレント

miRNA

マイクロアレイにハ

イブリダイズし、再現性や抽出キットの違いによる影響を検証しました。

福岡　弥生小髙　アラン田谷　敏貴アジレント・テクノロジー株式会社ゲノミクス部門

アジレント

miRNA

マイクロアレイおよび

バイオアナライザを用いた

exosomal miRNA

の検出

アプリケーションノート

要旨

著者

(2)

はじめに

血漿由来

miRNA

の白血病マーカー探索などをはじめとして（Tanaka M. et al.,

2009）、体液中に含まれる

RNA

が病態の変化に関与していることが知られています。近年ではさらに、体液中の細胞外小胞、特にエクソソームに含まれる

RNA

が細胞間の情報交換を担っているという報告がなされています（Kosaka N.,

2016）。エクソソーム由来

RNA

の生体内での詳しい作用機序（メカニズム）はいまだ不明な点が多く、様々な病態で解明が期待されます。アジレント

miRNA

マイクロアレイを用いた報告としては、乳がんが脳へ転移する際に特定の

miRNA

が脳関門を破壊するメカニズムの解明（Tominaga N. et al., 2015）や、2型糖尿病のマーカー

miRNA

探索などがあります（Delić D. et al., 2016）。これまでエクソソーム由来

RNA

は、さまざまな抽出方法が検討されていますが、エクソソーム中の

RNA

含有量が少なく、抽出が難しいといった問題がありました。最近、エクソソーム由来

RNA

を抽出するためのキットが市販されるようになりましたが、RNAの抽出量が少なく、UV分光光度計での検出・定量が困難となることから、total RNAのように一般的な質を確認するための基準がない、さらには続く実験に必要な量の

RNA

を確保できないといった課題があります。このアプリケーションノートでは、複数種の抽出キットで健常人のエクソソーム由来

RNA

を抽出し、アジレントの電気泳動装置バイオアナライザを用いた分析を行い、抽出キットの差が見られることを確認しました。必要な

RNA

量の確保には満たないものの、全てのサンプルをアジレント

miRNA

マイクロアレイで解析した結果、同一抽出キットを用いた場合、同一人物由来

RNA

のデータは再現性良く取得された一方、抽出キットによるデータ差も検出されました。表

1

計

18

回の抽出の内訳 抽出キット 抽出回数 抽出血清量_（

_mL

_） カラム溶出量_（

_uL

_） 得られた液量_（

_uL

_）

exoRNeasy Serum/

Plasma Midi Kit

ヒト各

A, B, C

2 回

1

14

10

～

12.8 exoRNeasy Serum/

Plasma Maxi Kit

ヒト各

A, B, C

2 回

3.7

14

11.8

～

12.6 Total Exosome isolation

from serum

および

Total

Exosome RNA & Protein

Isolation Kit

ヒト

A, B, C

各

2 回

1

100

85.6

～

100 実験

RNA

抽出

健常人

3

名分（A～

C、白人女性、70

歳代）の血清を

PromedDx

社から購入し、株式会社

DNA

チップ研究所にて

3

種類の市販キットを用いてエクソソーム由来

RNAを抽出しました。夾雑物を除くため、

–

80℃にて保存されていた血清を融解

後、φ

0.22 µm

のフィルターでろ過し、血清

3.7 mL

からは

exoRNeasy Serum/Plasma

Maxi Kit

（キアゲン社）を用いて、血清

1 mL

からは

exoRNeasy Serum/Plasma

Midi Kit

（キアゲン社）あるいは

Total

Exosome isolation from serum

と

Total

Exosome RNA & Protein Isolation Kit

の組み合わせ（サーモフィッシャーサイエン

ティフィック社、以後

Total exosome Kit

と表記）で

RNA

を抽出しました。抽出

はそれぞれのメーカー推奨プロトコルに

従い、exoRNeasyキットが提供している

miRNeasy Serum/Plasma Spike-In control

（キアゲン社）を

2

種類の

exoRNeasy

キッ

トの他、Total exosome Kitでの抽出時に

も、スタート血清量が同じ

exoRNeasy

Midi Kit

と同条件で添加しました。3人の血清サンプルから、3種類のキットで、テクニカルレプリケートとして独立して

2

回ずつ、計

18

回抽出を行いました。それぞれの血清量やカラム溶出量、最終的に得られた液量を表

1

にまとめました。

バイオアナライザでの電気泳動

溶出したサンプル溶液

1.5 uL

を

72℃

2

分で熱変性した後、Agilent RNA6000ピコキット（Agilent P/N 5067-1513）を用いて

RNA

の電気泳動を行いました。Total

exosome Kit

で抽出したサンプルは、溶出量が多く検出できなかったため、濃縮した後に再度泳動を行いました（図

1）。

また

RNA 6000

ピコキットでの泳動は、抽出時のバッファや塩の影響を受けやすいため、ポジティブコントロールとして、

9

種のヒト組織および細胞由来の

Universal Human miRNA Reference RNA

（Agilent P/N 750700）もチップごとに泳動

しました。

サンプルの濃縮

exoRNeasy Midi Kit

あるいは

exoRNeasy

Maxi Kit

で抽出した

RNA

はバイオアナ

ライザでの泳動や定量

PCR

に用いた残り

の溶液を濃縮遠心機で濃縮し、Nuclease

Free Water

（NFW）で

7 uL

に調整しました。

Total exosome Kit

で抽出した

RNA

は、原液を泳動した後、全量を濃縮し、NFW

で

4 uL

に調整しました。0.5 uLを希釈し

バイオアナライザで泳動した後、NFW

(3)

qRT-PCR

実験

エクソソームから

RNA

を抽出する際に添

加した、miRNeasy Serum/Plasma

Spike-In control

（キアゲン社）を検出するため

qRT-PCR

を行いました。exoRNeasy Midi

Kit

あるいは

exoRNeasy Maxi Kit

で抽出した

RNA

は原液を

1.5 uL、

Total exosome

Kit

で抽出した

RNA

は濃縮後の

RNA

溶液

1.5 uL

をテンプレートとし、exoRNeasy Kit

に含まれる

Ce_miR-39_1 miScript Primer

Assay

および

miScript II RT Kit

（キアゲン社）を用いて逆転写反応を行いました。その後、

miScript SYBR Green PCR Kit

（キ

アゲン社）を用い、AriaMxリアルタイム

PCR

システム（Agilent P/N G8830A）でリアルタイム

PCR

反応を行いました。

AriaMx

リアルタイム

PCR

システムは

Fast

タイプの装置のため、サーマルプロファイルはキアゲン社推奨のプロファイルから変更しました。また定量範囲を検証するため、

miRNeasy

Serum/Plasma Spike-In Control

を

10

～

10

6

_copies

_{となるように調整し、検量線} を得ました。エクソソーム由来

RNA

サンプルおよび検量線のデータはトリプリケートでデータを得ました。

マイクロアレイ実験

miRNA

マイクロアレイ実験は、Input

RNA

量の変更を除いて

Agilent miRNA

microarray protocol Version 3.1.1 August

2015

（G4170-90011）の和文プロトコルに従いました。通常、アジレント

miRNA

マイクロアレイのプロトコルでは、吸光度測定結果をもとに

total RNA 100 ng

をラベル化に用いますが、本検討ではエクソソーム由来

RNA

サンプルについては、濃度に関わらず濃縮遠心後の

7 uL

のうち

2 uL

をラベル化に用いました。

miRNA Complete Labeling and Hybキット

（Agilent P/N 5190-0456）を用いてラベ

ル化を行う際、各

RNA

サンプルには

microRNA Spike In

キット（Agilent P/N

5190-1934）に含まれる

Labeling Spike-In

を添加しました。またラベル化反応後、

Hyb Spike-In

を添加し、3スライドの

SurePrint G3 Human miRNA マイクロアレ

イ

8

×

60K Rel.21.0

（Agilent P/N G4870C）にハイブリダイゼーションしました。マイクロアレイ実験に問題が生じた際、サンプル溶液の影響かどうかを判断するため、Universal Human miRNA Reference

RNA

（Agilent P/N 750700）をポジティブコントロールとして、エクソソーム由来

RNA

と同時にラベル化反応を行い、1スライドごとに

2

アレイずつハイブリダイズしました。マイクロアレイは洗浄後、

SureScanマイクロアレイスキャナ（Agilent

P/N G4900DA）でスキャンし、スキャナ

付属の

Feature Extraction

ソフトウェア

ver.11.5

で数値化を行いました。スポット位置の自動認識がずれたデータは、マニュアルでスポット位置の修正を行いまし

た。また

Feature Extraction

が

Detected

とコールした

miRNA

を、バックグラウンドと区別して検出された

miRNA

として扱いました。

マイクロアレイのデータ解析

Feature Extraction

から出力された数値化テキストファイルを

GeneSpring GX

ソフトウェア ver.14.5（Agilent）に取り込み、解析を行いました。組織あるいは培養細胞由来の

total RNA

を解析する際は、90

percentile

のシグナル強度で

percentile

shift

を行うアレイ間補正が推奨されていますが、本検討では、全体のシグナル強度が低いこと、またサンプル間の違いがマイクロアレイデータに及ぼす影響を検証するため、アレイ間補正は行わずデータの解析を行いました。

(4)

結果と考察

バイオアナライザでの電気泳動

exoRNeasy Serum/Plasma Midi

あるいは

Maxi Kit

で抽出したエクソソーム由来

RNA

を

Agilent RNA 6000

ピコキットで

泳動すると、small RNA領域にピークが見られた一方、高分子側にもスメアなピークが観察されました（図

1 a

および

b）。

一部のサンプルはスメアなピーク中に階段状のピークが検出され、濃度も高く算出されました。階段状のピークがサンプル溶液中のバッファ由来か判断するため、

3

倍に希釈し泳動したところ同様な泳動

結果が得られました（data not shown）。

またラダや

Universal Human miRNA

Reference RNA、ブランクレーンに異常

は見られないため、泳動に問題は生じておらず、サンプルの特性であると判断しました。

Total exosome Kit

で抽出した

RNA

は原

液ではバイオアナライザ

RNA 6000

ピコキットの検出限界を下回り、ピークが観察されなかったので、濃縮後再度泳動を行いました（図

1 c）。その結果、ヒト

A

および

C

について

small RNA

領域にわずかにピークが検出されましたが、ヒト

B

の

2

サンプルに関してはノイジーになりました。サンプルレーン以外は正常に泳動できているため、ノイズはサンプル溶液由来と判断しました。またいずれのサンプルも、便宜上濃度は算出されましたが、

RNA 6000

ピコキットの検出範囲以下の濃度となりました。また全体の傾向として、抽出した血清量が多いほど、濃度が高くなり、より多くの

RNA

が得られていることが示されました。図

1.

エクソソーム由来

RNA

の泳動図

a.

血清

1 mL

から

exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit

で抽出

b.

血清

3.7 mL

から

exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit

で抽出

c.

血清

1 mL

から

Total Exosome isolation from serum

と

Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit

で抽出（濃縮後のサンプル）

miRNA UniRef

：

Universal Human miRNA Reference RNA

A~C

：正常人

3

名濃度：

RNA 6000

ピコキットの測定値

a.

c.

b.

776 pg/uL 17 pg/uL 1458 pg/uL 189 pg/uL 14 pg/uL 282 pg/uL 220 pg/uL 14 pg/uL 335 pg/uL 298 pg/uL 15 pg/uL 150 pg/uL 778 pg/uL 7 pg/uL 1439 pg/uL 72 pg/uL 11 pg/uL 185 pg/uL 200 n t 200 n t 500 n t 500 n t 500 n t 1000 nt 1000 nt 4000 nt 2000 nt₄₀₀₀ nt 1000 nt 2000 nt₄₀₀₀ nt 500 n t 200 n t 3452 pg/uL 3987 pg/uL 4251 pg/uL

(5)

定量

PCR

による

SpikeIn

の検出

各抽出の成否を判断するために抽出時に添加した

miRNeasy Serum/Plasma Spike-In

control

の検出を行いました。まず、この

Spike-In control

を用いて検量線を得、定量性が保たれている範囲を検証したと

ころ、今回の実験系では

20

～

32 Cq

で

直線性が得られました（図

2 a）。

exoRNeasy Serum/Plasma Midi

あるいは

Maxi Kit

で抽出した各サンプルの

Cq

値は、検量線で直線性が得られた範囲で検出され、抽出は成功していることを確認できました（図

2 b）。一方、Total exosome

Kit

で抽出したサンプルは

Cq

値

32

を超え、定量範囲内では検出できませんでした。血清

1 mL

から抽出した

exoRNeasy Midi

Kit

使用時と同じ条件で

miRNeasy Serum/

Plasma Spike-In control

を添加しましたが、溶出量が多いこと、濃縮し溶液量を調節したことなどから、検出できなかったことが考えられます。 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 10 1000 100000 0 5 10 15 20 25 30 A, Qiag en M idi A, Qiag en M idi A, Qiag en M axi A, Qiag en M axi B, Qiag en M idi B, Qiag en M idi B, Qiag en M axi B, Qiag en M axi C, Qiag en M idi C, Qiag en M idi C, Qiag en M axi C, Qiag en M axi

図

2. miRNeasy Serum/Plasma Spike-In control

の検出

a. Spike-In control

を用いた検量線

b.

各サンプル中の

Spike-In control

の

Cq

値

a.

b.

copies Cq （ ∆ Rn ） Av er age C q （ ∆ Rn ）

(6)

miRNA

マイクロアレイ

シグナル強度

本検討では、推奨プロトコルよりも少ない

RNA

量をラベル化・ハイブリダイズしていること、エクソソーム由来

RNA

は

miRNA

含有量が少ないことが予想されることから、シグナル強度の確認を行いました。マイクロアレイに搭載されている

miRNA

の

90 percentile

のシグナル強度を確認したところ（図

3 a）、ポジティブコン

トロールの

Universal Human miRNA

Reference RNAを除き、全てのサンプルで、

有意なシグナル強度ではないことを示す

0.1となりました。一方

99 percentile

では

シグナル強度が観察され（図

3 b）、

miRNA

が検出されていることが示唆され

ました。ただし、Total exosome Kitで抽

出されたヒト

B

の

2

サンプルのみ、99

percentile

のシグナル強度も

0.1

となりました。図

3. miRNA

マイクロアレイで検出されたシグナル強度

a. 90 percentile

のシグナル強度

b. 99 percentile

のシグナル強度 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 65.7 61.0 58.0 _55.5 50.1 52.1 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 A, Qiag en M idi A, Qiag en M idi A, Qiag en M axi A, Qiag en M axi A, Tot al exos ome A, Tot al exos ome B, Qiag en M idi B, Qiag en M idi B, Qiag en M axi B, Qiag en M axi B, Tot al exos ome B, Tot al exos ome C, Qiag en M idi C, Qiag en M idi C, Qiag en M axi C, Qiag en M axi C, Tot al exos ome C, Tot al exos ome miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef

a.

6.5 8.6 18.4 19.4 4.1 4.0 10.7 10.6 53.9 48.1 0.1 0.1 27.4 7.2 7.2 25.6 2.5 1.8 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 A, Qiag en M idi A, Qiag en M idi A, Qiag en M axi A, Qiag en M axi A, Tota l exoso me A, Tota l exoso me B, Qiag en M idi B, Qiag en M idi B, Qiag en M axi B, Qiag en M axi B, Tota l exoso me B, Tota l exoso me C, Qiag en M idi C, Qiag en M idi C, Qiag en M axi C, Qiag en M axi C, Tota l exoso me C, Tota l exoso me miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef 1746.21556 .1 1585 .5 1289 .0 1481 .4 1805 .5

b.

90 p er ce nt ile s igna l in te ns ity 99 p er ce nt ile s igna l in te ns ity ヒト

A

ヒト

A

ヒト

B

ヒト

B

ヒト

C

ヒト

C

(7)

マイクロアレイ結果の

QC

本検討で用いた

microRNA Spike In

キッ

ト（Agilent P/N 5190-1934）は、ヒトには相同

miRNA

が存在しない、人工合成

RNA

の混合物です。Labeling Spike-Inは

RNA

サンプルに添加しラベル化反応を行い、Labeling Spike-Inに対応したマイクロアレイ上のシグナル強度を確認することで、ラベル化反応の成否を判断することができます。同様に

Hyb Spike-In

はラベル化反応後、ハイブリダイズ時にサンプルに添加することで、ハイブリダイゼーション以降の実験ステップを評価することができます。今回の結果では

Hyb Spike-In

は添加したすべてのアレイで基準の

2.5

を超え、ハイブリダイズ以降の実験ステップに問題が生じていないことが示されました（図

4 b）。一方、Labeling Spike-In

を添加したサンプルのうち、ヒト

B

のエクソソーム

由来

RNA

を

Total exosome Kit

で抽出し

たデータは、Labeling Spike-Inが検出されず負の値となりました（図

4 a）。

またアレイ内の再現性は

CV15%

以下が目安となります。アレイ全体のシグナル強度が低いので、アレイ内再現性が悪くなることが予測されましたが、Universal

Human miRNA Reference RNA

だけでは

なく、エクソソーム由来

RNA

のデータも

15%

下回りました。ただしヒト

B

のエク

ソソーム由来

RNA

を

Total exosome Kit

で抽出したサンプルは、検出された

miRNA

数が少なく、正しく計算されず負の値となりました（図

4 c）。

-1 0 1 2 3 4 A, Qiag en M idi A, Qiag en Maxi A, Tota l exoso me B, Qiag en M idi B, Qiag en Maxi B, Tota l exoso me C, Qiag en M idi C, Qiag en Maxi C, Tota l exoso me miR U niRef miR U niRef miR U niRef 0 1 2 3 4 5 A, Qiag en M idi A, Qiag en M axi A, Tota l exoso me B, Qiag en M idi B, Qiag en M axi B, Tota l exoso me C, Qiag en M idi C, Qiag en M axi C, Tota l exoso me miR U niRef miR U niRef miR U niRef 図

4. miRNA

マイクロアレイの

QC

a. Labeling Spike-In

b. Hyb Spike-In

c.

アレイ内

CV%

a.

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 A, Qiag en M idi A, Qiag en M idi A, Qiag en M axi A, Qiag en M axi A, Tota l exoso me A, Tota l exoso me B, Qiag en M idi B, Qiag en M idi B, Qiag en M axi B, Qiag en M axi B, Tota l exoso me B, Tota l exoso me C, Qiag en M idi C, Qiag en M idi C, Qiag en M axi C, Qiag en M axi C, Tota l exoso me C, Tota l exoso me miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef

c.

b.

La be lin g S pik e-In のシグナル強度アレイ内 CV % Hy b S pi ke -I n のシグナル強度ヒトB ヒトC ヒトB ヒトC ヒトA ヒトA ヒトB ヒトC ヒトA

exoRNeasy Midi Kit exoRNeasy Maxi Kit Total exosome Kit miRNA UniRef

(8)

マイクロアレイの検出感度

各サンプルで検出された

miRNA

数を比較するため、Detectedとコールされた

miRNA

（バックグラウンドとくらべ、シグナル強度が有意に差があると判定された

miRNA）をまとめました（図

5）。その結

果、若干の差はあるものの、同一人物から同じキットで抽出したサンプルでは似た傾向を示しました。一方で、同一人物由来でも抽出キットが異なると検出数に違いが生じることが示されました。特にヒト

B

のエクソソーム

由来

RNA

を

Total exosome Kit

で抽出し

たサンプルは、2回のデータとも検出

miRNA

数が少なく、前述のマイクロアレイの

QC

結果と合わせ、サンプル溶液中に

miRNA

が少なかった、あるいは何らかの要因でラベル化反応がうまくいかなかったことが考えられます。

再現性

同じ抽出キットを用いた各

6

データで検出された

miRNA

から算出した

correlation

値を

GeneSpring GX

ソフトウェアを用いて比較しました（図

6 a

～

c）。その結果、

同一条件で抽出した同一人物由来の

2

回のアレイデータは再現性は高く、個人間の違いが捉えられていることが示されました。また図

1 a.

のバイオアナライザのデータでは同一人物由来でも、small RNA領域のみに検出されたサンプルと、階段状のスメアピークが検出されたサンプルがありましたが、このピーク形状の違いは、アレイデータの再現性との関連性は見いだされませんでした（図

6 d）。

抽出キット間の比較

本検討に用いた、健常人

3

名を

3

つの抽出キットで抽出したことのアレイデータへの影響を確認するため、

PCAを行いました。

PCA

ではマイクロアレイ実験のポジティブコントロールとして用いた

Universal Human

miRNA Reference RNA

およびラベル化

がうまくいっていないと思われる、ヒト

B

の

エクソソーム由来

RNA

を

Total exosome

Kit

で抽出した

2

データを除き、残り

16

データで解析しました。また

16

データ中

8

データで検出された

115

個の

miRNA

で解析しました（図

7）。その結果、個人

間差よりも用いた抽出キットの違いが、マイクロアレイデータに影響を与えることが示されました。このことから、抽出方法は比較したい一連のサンプルで、統一することが望ましいことが示唆されました。 99 128 128 141 _{69 76 89 106} 223 195 6 12 153 92 111 162 _{55 47} 740 736 766 711 720 0 100 200 300 400 500 600 700 800 A, Qiag en M idi A, Qiag en M idi A, Qiag en Maxi A, Qiag en Maxi A, Tota l exoso me A, Tota l exoso me B, Qiag en M idi B, Qiag en M idi B, Qiag en Maxi B, Qiag en Maxi B, Tota l exoso me B, Tota l exoso me C, Qiag en M idi C, Qiag en M idi C, Qiag en Maxi C, Qiag en Maxi C, Tota l exoso me C, Tota l exoso me miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef miR U niRef 747 図

5. Detected

とコールされた

miRNA

の数ヒト

A

ヒト

B

ヒト

C

(9)

a.

b.

ヒトA ヒトA ヒトB ヒトB ヒトC ヒトC ヒトA

1.00 0.94 0.84 0.88 0.80 0.86

ヒトA

0.94 1.00 0.73 0.83 0.71 0.81

ヒトB

0.84 0.73 1.00 0.93 0.95 0.91

ヒトB

0.88 0.83 0.93 1.00 0.91 0.91

ヒトC

0.80 0.71 0.95 0.91 1.00 0.91

ヒトC

0.86 0.81 0.91 0.91 0.91 1.00

ヒトA ヒトA ヒトB ヒトB ヒトC ヒトC ヒトA

1.00 0.99 0.95 0.94 0.71 0.89

ヒトA

0.99 1.00 0.94 0.93 0.68 0.88

ヒトB

0.95 0.94 1.00 1.00 0.70 0.92

ヒトB

0.94 0.93 1.00 1.00 0.72 0.92

ヒトC

0.71 0.68 0.70 0.72 1.00 0.86

ヒトC

0.89 0.88 0.92 0.92 0.86 1.00

図

6.

アレイ間の再現性

a. exoRNeasy Midi Kit

で抽出したレプリケート間の

Correlation

値（

67 miRNAs

）

b. exoRNeasy Maxi Kit

Correlation

値（

75 miRNAs

）

c. Total exosome Kit

Correlation

値（

51 miRNAs

）

d.

ヒト

A

のエクソソーム由来

RNA

を

exoRNeasy Maxi Kit

で抽出したテクニカルレプリケートのスキャタープロット

（アレイ間補正なし、両アレイで検出された

124 miRNAs

を表示）

c.

d.

Log10 signal intensity

ヒト

A

ヒト

A

Lo g1 0 s igna l in te ns ity ヒトA ヒトA ヒトB ヒトB ヒトC ヒトC ヒトA

1.0

0.9 -0.1

-0.3

0.8

0.6

ヒトA

0.9

1.0 -0.1

-0.2

0.8

0.7

ヒトB

-0.1

1.0

0.9

0.0

0.1

ヒトB

-0.3

-0.2

0.9

1.0 -0.2

0.0

ヒトC

0.8

0.0 -0.2

1.0

0.7

ヒトC

0.6

0.7

0.1

0.0

0.7

1.0

(10)

結論

最近では次世代シーケンサによる

small

RNA

の解析も報告されるようになりましたが、解析手法に関わらず、試料となる

RNA

の確認は重要です。Agilent 2100バイオアナライザ電気泳動システムを用いることで、エクソソーム由来

RNA

が抽出できているかという確認や、抽出キットによる泳動パターンの違いを検出することができました。またバイオアナライザのデータが次に続く実験の成否に関連することが示唆されました。アジレント

miRNA

マイクロアレイでは、通常プロトコルで推奨されている、組織や培養細胞由来の

total RNA

を想定した量には満たない

RNA

量でもデータが得られることが示されただけでなく、個人間の再現性や抽出キットの違いを捉えられることも判明しました。エクソソーム由来

RNA

をアジレント

miRNA

マイクロアレイを用いて解析することで、迅速・簡便に疾患などサンプル特有の

miRNA

発現差を検出できることが期待されます。 参考文献

1. Tanaka M. et al. (2009) Down-regulation of miR-92 in human plasma is a

novel marker for acute leukemia patients. PLoS ONE 2009;4(5):e5532

2. Kosaka N. (2016) Decoding the Secret of Cancer by Means of Extracellular

Vesicles. J Clin Med. 2016 Feb 4;5(2).

3. Tominaga N. et al., Brain metastatic cancer cells release

microRNA-181c-containing extracellular vesicles capable of destructing blood-brain barrier.

Nat Commun. 2015 Apr 1;6:6716.

4. Delić D. et al., (2016) Urinary Exosomal miRNA Signature in Type II Diabetic

Nephropathy Patients. PLoS One. 2016 Mar 1;11(3):e0150154

謝辞本アプリケーションノートの作成にあたり、株式会社

DNA

チップ研究所の上田由美様、石澤洋平様には

RNA

の抽出をはじめ、多大なご協力を頂きました。ここに感謝の意を表します。図

7.

マイクロアレイの

PCA

データ

Color by Kit

Shape by Individual

Total exosome exoRNeasy Maxi exoRNeasy Midi A C B

(11)

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本資料掲載の製品は全て研究用です。その他の用途にご利用いただくことはできません。このアプリケーションノートの情報、記述、および仕様は予告なく変更されることがあります。Agilent Technologiesは本書に含まれる誤植、あるいは本品の性能、または使用に関する偶発的ないし間接的な損害に関して責任を負いません。アジレント・テクノロジー株式会社