スライド 1

(1)

微生物の力だけ：

担子菌を用いた木質資源からのエタノール生成

宮崎大学農学部森林緑地環境科学科

准教授亀井一郎

(2)

従来技術とその問題点

前処理（脱リグニン）糖化酸触媒，高温，高圧アルカリ処理酵素処理発酵発酵（酵母）課題前処理への投入エネルギー、薬品の環境負荷糖化用酵素のコスト発酵効率（おもにヘキソースの発酵性）

(3)

新技術の特徴・従来技術との比較

木材 _{セルロース} _{グルコース} エタノール嫌気条件好気条件薬品熱酵素酵母コスト↑ コスト↑ バイオエタノール生産既存技術 本発明の骨子 脱リグニン前処理セルロースの糖化・発酵

(4)

植物細胞壁の主要成分のひとつであるリグニンを分解することが出来る微生物。

リグニン（モデル構造）

低分子化、無機化可能

Lignin peroxidase, Manganese peroxidase, Laccase カワラタケ

白色腐朽担子菌

White-rot fungi ワンポットエタノール発酵必要条件：リグニン分解能セルロース糖化能エタノール発酵能白色腐朽菌結論：エタノール発酵能を持った白色腐朽菌脱リグニンセルロース糖化発酵

(5)

白色腐朽菌

Phlebia sp. MKFC40001について

沖縄マングローブ林で採取された高塩濃度条件下で生育可能でかつ高塩濃度条件下で高いリグニン分解活性を持つ白色腐朽菌 _{（Xin et al. 2002）} 熱帯、亜熱帯沿岸に茂るマングローブ林 満潮になると海水に浸る環境 陸上の森林と大きく異なる環境 塩添加に応答してリグニン分解酵素遺伝子の発現が誘導される特殊な性質を持つ． （Kamei et al. 2008）

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スクリーニングにより，本菌がセルロースからエタノールを直接生成できることが明らかになった。

(6)

0 5 10 15 20 25 0 24 48 72 96 120 0 5 10 15 20 25 0 24 48 72 96 120 0 5 10 15 20 25 0 24 48 72 96 120 0 5 10 15 20 25 0 24 48 72 96 120 C onc ent rat ion ( g/ l) C onc ent rat ion ( g/ l) C onc ent rat ion ( g/ l) C onc ent rat ion ( g/ l) time (h) time (h) time (h) time (h) A B C D Phlebia sp. MKFC40001によるヘキソースの発酵 glucose mannose galactose fructose sugar ethanol 収量 0.40 g/g sugar 収量 0.41 g/g sugar 収量 0.44 g/g sugar 収量 0.41 g/g sugar 変換率 86.9% 変換率 79.0% 変換率 79.5% 変換率 78.2% すべての六炭糖を効率よくエタノールに変換することが出来る．

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0 5 10 15 20 25 0 24 48 72 96 120 C onc ent rat ion ( g/ l) C onc ent rat ion ( g/ l) time (h) time (h) A xylose B arabinose 0 5 10 15 20 25 0 24 48 72 96 120 Phlebia sp. MKFC40001によるペントースの発酵 sugar ethanol 収量 0.33 g/g sugar 変換率 65.0% エタノール生産は観察されず 六炭糖よりも時間はかかるものの，Phlebia sp. MKFC40001は120時間の培養で xyloseをすべて消費し，エタノールを生産できる．初期濃度に対して理論収率の65.0%のエタノールが生産された． xylitol

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0 5 10 15 20 25 0 120 240 360 0 5 10 15 20 25 0 120 240 360 C onc ent rat ion ( g/ l) C onc ent rat ion ( g/ l) time (h) time (h) A cellobiose B maltose Phlebia sp. MKFC40001による二糖類の発酵 sugar ethanol 培養の初期にグルコースの産生が観察され，その後エタノールの生産が見られる．加水分解→エタノール発酵が起こっていることが示された．マルトースよりもセロビオースの消費およびエタノール生産が早く，β-グルコシダーゼ活性が高いことが考えられる． glucose

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0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 100 200 300 C onc ent rat ion ( g/ l) C onc ent rat ion ( g/ l) time (h) time (h) A B Phlebia sp. MKFC40001による広葉樹未晒クラフトパルプの発酵 半好気条件（シリコン栓）好気条件（シリコ栓）使用した広葉樹未晒クラフトパルプ1 gから硫酸加水分解で得られる糖

Glucose: 803 mg, xylose: 174 mg, galactose 2 mg

最大エタノール収量理論値：499.8 mg/ g 広葉樹KP 収量 0.36 g/g KP 理論収率の71.8%がエタノールに変換された． glucose ethanol cellobiose

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0 1 2 3 4 5 0 100 200 300 Phlebia sp. MKFC40001による新聞紙の発酵（菌の接種方法による違い） 菌糸体プラグ菌糸体の破砕物

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Conc entr ati on ( g/l ) time (h) Table 1

Chemical composition of UHKP and waste news paper (w/w %) Substrate

Glucan* Xylan* Mannan* Arabinan* Garactan* Lignin Recovery UHKP 82.0 17.0 0.2 ND ND 2.5 101.7 Newspaper 58.5 7.8 4.8 ND ND 15.2 85.8 ND: Not detected

*Each value was calculated from the composition of sulfuric acids hydrolysate of each substrate.

理論収率の51.1%がエタノールに変換された．菌体の接種法を変えるだけで生成速度も上昇した。新聞紙はリグニンやインクを多く含む。不純物を含むセルロース材料でも発酵が可能

(11)

先行研究との比較（グルコース，キシロース）

Fungus Ethanol (g/g glucose) Ethanol (g/g xylose)

Rhizopus oryzae 0.41 0.28 Mucor corticolous 0.43 0.15 Mucor indicus 0.39 0.22 Saccharomyces cerevisiae 0.42 Peniophora cinerea Trametes suaveolens Phlebia sp. MKFC40001 0.41 0.09 0.39 0.06 0.44 0.33 グルコースからのエタノール収量は酵母並みに高い．キシロースについても既報に比べて各段に高い収量を示す．白色腐朽菌酵母

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Phlebia sp. MKFC40001を用いた広葉樹木粉の脱リグニンとエタノール発酵 Phlebia sp. MG-60は白色腐朽菌なので，好気的な脱リグニン処理とその後の糖化， エタノール発酵が単一菌で可能ではないかと考えた．約80%の含水率に調製したコナラ木粉（乾燥重量：400 mg） 14日間28℃ 暗所で培養（脱リグニン）実験 PDA培地で培養した菌糸片を接種シリコ栓 20 mlの発酵用液体培地を加え，シリコン栓で通気を遮断所定期間28℃ 暗所で培養（糖化，発酵）分析シリコン栓シリコン栓 14日間28℃ 暗所で培養

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Phlebia sp. MKFC40001の菌糸体（PDA培地上） 未処理の木粉 MKFC40001によるリグニンの分解（８週後）白くなる菌糸前処理発酵エタノール

(14)

嫌気条件好気条件 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 14 28 42 56 A m o u nt o f c om p on e nt s ( m g )

Incubation time (day)

リグニングルカン菌処理木粉重量好気条件下で生物的脱リグニン前処理嫌気条件に切替えてエタノール発酵木材エタノールコントロール木粉重量キシラン

白色腐朽菌Phlebia sp. MKFC40001を用いた脱リグニン同時糖化発酵

好気条件での生物的脱リグニン処理でリグニン含有量が大きく減少し、一方でグルカン（グルコースポリマー）含有量は大きな変化がない。選択的なリグニンの分解

(15)

嫌気条件好気条件好気条件下で生物的脱リグニン前処理 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 E th a no l c o nv e rs io n r a te ( % ) 嫌気条件に切替えてエタノール発酵木材エタノール ●前処理56日 ○前処理42日 ■前処理28日 □前処理14日 ◇前処理0日

白色腐朽菌Phlebia sp. MKFC40001を用いた脱リグニン同時糖化発酵

好気条件下での前処理期間が長くなるにつれ、エタノール変換率も高くなる。 注目点 本実験で，木材からエタノールを生成するのに要したのは，菌と水と発酵用培地のみであ ること。

(16)

嫌気条件好気条件好気条件下で生物的脱リグニン前処理嫌気条件に切替えてエタノール発酵木材エタノール

白色腐朽菌Phlebia sp. MKFC40001を用いた脱リグニン同時糖化発酵

嫌気条件好気条件木材エタノール

白色腐朽菌Phlebia sp. MKFC40001を用いた統合バイオリファイナリー

乳酸酢酸その他有価物期間の短縮化生産可能製品の多様化

検討課題

(17)

想定される用途

①木質系廃材，林地残材からのエタノール生産

②紙パルプ系廃棄物からのエタノール生産

③きのこ廃菌床等食品廃棄物からのエタノール生産

また，遺伝子組換えによる分子育種で最終製品の多様化

が期待できる。

(18)

実用化に向けた課題

・全プロセス完結に要する時間の短縮化

現在最も厳しい条件で培養しているため，培養

条件を改善することで，期間短縮が可能

・エタノール耐性の向上

変異株の取得および分子育種による改善を検討中

・様々なバイオマス種に対する特異性と効果

バイオマス種に対応した微生物種の適用により解決

可能

(19)

企業への期待

・様々な形態のセルロース系廃棄物を供給可能な企業

との共同研究を希望する。

・木質系廃材からのバイオエタノール生産を考えている

企業には，本技術の導入が有効であると思われる。

・処理に必要な時間については，各種バイオマス材料に

対応して処理条件を最適化したり，分子育種を進めること

で大幅に短縮することが可能である。

(20)

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称：担子菌を用いるエタノールの製造方法

• 出願番号：PCT/JP2012/055444

• 出願人：宮崎大学，九州大学，静岡大学

• 発明者

：亀井一郎、目黒貞利、近藤隆一郎、

森智夫、平井浩文

(21)

スライド 1

微生物の力だけ：

担子菌を用いた木質資源からのエタノール生成

宮崎大学農学部 森林緑地環境科学科

准教授 亀井一郎

従来技術とその問題点

新技術の特徴・従来技術との比較

白色腐朽担子菌

白色腐朽菌

Phlebia sp. MKFC40001について

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宮崎大学農学部森林緑地環境科学科

准教授亀井一郎