Vol.60 No グルカゴン様ペプチド 1 の反芻動物における特異的な分泌と作用について Mabrouk EL-SABAGH はじめに incretin B K GIP gastric inhibitory polypeptide gluco

栄養生理研究会報 Vol.60，No.1 2016 1．はじめに  単胃動物において、血漿グルコース濃度の増加を 同程度になるように設定し、経口あるいは静脈内に グルコースを注入した場合、経口から注入する方が 血漿インスリン濃度をより増加させる。これは、食 事に伴い消化管から産生・分泌されるインクレチン （incretin）と総称される消化管ホルモンが、グルコー スの吸収により分泌され、血糖依存的に膵ラ島 B 細胞に作用し、インスリン分泌を促進するからであ る。インクレチンには、小腸上部に存在する K 細 胞から分泌される GIP（gastric inhibitory polypeptide あるいは glucose-dependent insulinotropic polypeptide） や GLP-1（glucagon-like peptide-1（7−36）amide）がある。 これらホルモンの受容体欠損マウス1）_{では、イン} スリン分泌が野生型マウスと比較して低下し、血糖 値が増加する。したがって、単胃動物においてイン クレチンは、血糖調節に重要なホルモンであると考 えられている。  発見の経緯から GIP と GLP-1 はインクレチンと 称されてはいるが、インスリン分泌促進作用以外に も生理作用を有している。GIP 受容体は脂肪や骨芽 細胞にも発現しており、脂肪取込や骨へのカルシウ ム沈着を促進する2）_{。GLP-1受容体は、多くの組織} に局在し、胃排泄抑制作用、インスリン作用増強作 用、肝臓での糖新生抑制や脂肪細胞への糖取込など のインスリン類似作用、中枢においては食欲抑制作 用など数多くの作用が報告されている3，4，5）_。しかし ながら、両ホルモンは、アミノ酸配列の N 末端か ら2番目がアラニンであるため、タンパク分解酵素 である DPP-Ⅳ（dipeptidyl-peptidase Ⅳ）によって血 中で速やかに分解され、その半減期は数分である6）_。 GLP-1は、産生細胞から毛細血管床、腸間膜静脈を 経て門脈に到達した時点で約75％が不活化、肝臓で の代謝を経て体循環に入る（first pass）ときには約 90％が不活化するとされている7）_{。このことから、} GLP-1は、多くの組織で受容体が発現しているもの の、インクレチンとしての作用と肝臓での作用が生 理的には重要であるかもしれない。  出生直後の反芻動物は、反芻胃が未発達のため、 単胃動物と同様の消化吸収様式を示すが、反芻胃の 発達や離乳により飼料の消化を反芻胃内発酵に依存 するようになる。特に炭水化物のうちデンプンや糖 類は、そのほとんどが反芻胃内発酵により揮発性脂 肪酸（VFA）として胃壁から吸収されるため、小腸 からのグルコースの吸収はほとんど無い。そのため、 離乳後の反芻動物のグルコース供給は、肝臓での糖 新生に依存しており、血漿グルコース濃度は単胃動 物と比較して低く、給飼後の血漿グルコース濃度の 変化もほとんど無い。しかしながら、VFA はイン スリン分泌を促進するため、給飼後に血漿インスリ ン濃度の増加は認められるが、血漿グルコース濃度 が低いため、生来的にインスリン感受性が弱い（イ ンスリン抵抗性）。反芻動物においても、腸管 L 細 胞には GLP-1は局在しているが、その生体内での役 割は不明な点が多い。  本稿では、反芻動物の GLP-1の分泌と作用に関し て、筆者らの研究成果を踏まえて概説する。

グルカゴン様ペプチド 1 の反芻動物における特異的な分泌と作用について

杉野利久

_{・福森理加}

_{・谷口 大}

_{・Mabrouk EL-SABAGH}

_{・小櫃剛人}

Proceedings of Japanese Society for Animal Nutrition and Metabolism 60(1): 35－43, 2016. The characteristics of secretion and action in glucagon-like peptide-1 of ruminants

Toshihisa Sugino1_{, Rika Fukumori}2_{, Dai Taniguchi}1_{, Mabrouk EL-SABAGH}1，3_{, Taketo Obitsu}1

(1_{The Research Center for Animal Science, Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University, Higashi-Hiroshima 739－}

8528, Japan, 2_{University Farm, Department of Agriculture, Utsunomiya University, Mohka 321－4415, Japan,} 3_{Faculty of Veterinary}

2．反芻動物の GLP-1 分泌8）  図 1 にホルスタイン種子牛の出生後からの血漿 GLP-1濃度の推移を示した。血漿 GLP-1濃度は、出 生後から離乳に向けて徐々に減少したが、離乳を境 に、再び増加した。血漿グルコース濃度は出生後か ら徐々に減少し、離乳後 13 週齢では成牛と同程度 の濃度であった。一方で、血漿β−ヒドロキシ酪酸 （BHBA）濃度は、固形飼料摂取量の増加に伴い増 加し、離乳後は高値で推移した。この BHBA 濃度 の増加は、反芻胃内での酪酸発酵に依存しているも のと推測される。離乳前の血漿 GLP-1濃度は、単胃 動物と同様にグルコース濃度と類似した推移を示し たが、離乳後はグルコース濃度が低値で推移してい たにもかかわらず、GLP-1濃度が再び増加に転じた ことから、反芻動物ではグルコース吸収以外の要因 が GLP-1分泌に関与している可能性が考えられ、ま た酪酸発酵に起因する BHBA 濃度の増加と離乳後 の推移が類似していることから、インスリン分泌同 様に反芻動物では、VFA が GLP-1 分泌を促進する 一要因であると考えられた。  図2および3に、離乳前後の子牛におけるグルコー スおよび VFA 頸静脈投与後の血漿 GLP-1 濃度の推 移を示した。単胃動物ではグルコース投与によって 血漿 GLP-1濃度は増加するとされているが、離乳前 後の子牛では、グルコースによる GLP-1分泌促進は 認められなかった（図2）。本稿ではデータを示さな いが、離乳前の子牛に経口からラクトースを注入し た場合、血漿 GLP-1濃度の増加は認めている（Sugino et al., 16th AAAP proceeding, 2014）。このことから、 反芻動物においてもグルコース吸収が GLP-1分泌促 進の一要因であると考えられるが、単胃動物のそれ と比較してその効果は弱い可能性が考えられる。一 方で、VFA による血漿 GLP-1 濃度の増加は、出生 後から認められた（図3）。また、第一胃カニューレ 装着去勢ヒツジを用い、第一胃に VFA を注入した 場合も、同様に血漿 GLP-1濃度の増加が示されてお り、その効果は酪酸＞プロピオン酸＞酢酸の順で大 きかった（杉野ら、未発表）。さらに、血漿 GLP-1 濃度は、消化吸収を反芻胃内発酵に依存している成 ヒツジにおいて、給飼後の増加が認められている（杉 野ら、未発表）。このことから、反芻動物の GLP-1 図 1． 子牛の血漿 GLP-1（a），グルコース（b）およ び BHBA（c）濃度推移（n＝5）。 矢印：離乳，実線：給飼前濃度，点線：時系列 調整曲線

図 2． 離乳前後の子牛へのグルコース単回投与（i.v.）が血漿 GLP-1 濃度に及ぼす影響（n＝4，相対値）。

矢印：投与時間

図 3． 離乳前後の子牛への混合 VFA 単回投与（i.v.）が血漿 GLP-1 濃度に及ぼす影響（n＝4，相対値）。

矢印：投与時間

分泌は、VFA により促進され、その効果は生来的 に有していること、また VFA は反芻胃壁から吸収 されることから、吸収後の VFA が GLP-1 分泌に関 与している可能性が考えられ、その効果は酪酸およ び酪酸発酵由来の BHBA で最も大きいことが考え られる。 3．反芻動物の GLP-1 作用 3－1．インクレチン作用8）  単胃動物における GLP-1 のインスリン分泌機序 は、膵ラ島 B 細胞に局在する7回膜貫通型 G 蛋白共 役受容体に結合し、アデニル酸シクラーゼ活性を介 して細胞内 cAMP 濃度を増加させ、インスリン分泌 を惹起する。しかし、cAMP シグナルは、単独では インスリン分泌を惹起せず、細胞内 Ca2＋_濃度の増 加が同時に起きたときに、初めてインスリン分泌を 増強する。したがって、血糖値が低い状態では細胞 内 Ca2＋_{濃度が増加しないため、GLP-1 によるイン} スリン分泌は発現しない1，9，10）_{。また、GLP-1 は膵} ラ島 B 細胞のアポトーシスを抑制し、細胞増殖を 促進する11）_{。他方で、GLP-1は血中を介したインク} レチン作用のみならず、門脈から迷走神経求心路を 介して、脳幹経由で迷走神経遠心路を刺激しインス リン分泌を増強することも報告されている7）_。この ように GLP-1によるインスリン分泌促進は、①血中 を介した血糖依存的な経路、②膵ラ島 B 細胞増殖 を介した経路、③神経系を介した経路の3つの経路 が考えられている。  前項で述べたように、反芻動物の GLP-1 分泌は、 生来的に VFA により促進され、またグルコースに よる促進効果は弱い。図4に離乳前後の子牛におけ る血漿 GLP-1 濃度とインスリン濃度との相関を示 した。両者は離乳前後ともに正の相関関係にあった が、相関係数は離乳後の方が高値であった。図5に 離乳前後の子牛における GLP-1 頸静脈投与後の血 漿インスリン濃度増加面積を示した。GLP-1による インスリン分泌促進作用は、出生後から認められた が、その効果は離乳により増大した。血漿グルコー ス濃度は離乳前が離乳後と比較し高値であったにも 関わらず（図 1b）、GLP-1 とインスリンとの関係性 は離乳後の方が強い。したがって、反芻動物におけ る GLP-1のインスリン分泌促進作用は、血糖依存的 ではなく、他の経路を介した作用であると推察され るが、その作用機序に関しては今後の検討課題であ る。反芻動物は、VFA によりインスリン分泌が促 進される。また著者らの研究により、GLP-1は VFA により分泌が促進され、また GLP-1 は血糖非依存 的にインスリン分泌を促進することが明らかとなっ た。このことから、反芻動物におけるインスリン分 泌機序には、GLP-1が関与している可能性が考えら れる。 図 4． 離乳前後の血漿 GLP-1とインスリン濃度との相関

3－2．膵外作用12，13，14）  先述のように、GLP-1受容体は多くの組織で発現 しており、GLP-1は膵ラ島 B 細胞におけるインスリ ン分泌促進作用の他、A 細胞ではグルカゴン分泌抑 制、中枢神経系では摂食抑制があり、神経系を介し た作用として胃酸分泌抑制や消化管運動抑制作用な どを有する。また、Ⅱ型糖尿病（インスリン抵抗性） では、インスリン作用増強やインスリン類似作用を 発現する15）_{。このように単胃動物において GLP-1は、} インクレチンとしての作用以外にも栄養代謝におい て重要な作用を有することが明らかとなってきてい る。しかしながら、GLP-1 は DPP- Ⅳにより速やか に不活化され、肝臓を通過する量は少ない。したがっ て、門脈から迷走神経求心路を介した作用および肝 臓での作用が生理的条件下では重要であるかもしれ ない。  表1にホルスタイン種去勢牛への GLP-1頸静脈単 回投与 30 分後に変化した肝臓代謝物を示した。肝 臓代謝物はバイオプシーにより得られた組織片を用 い、CE-TOFMS により解析した。結果として、203 代謝物のピークが検出され、そのうち主要代謝物は 85（47 cations, 38 anions）検出された。GLP-1 の投 与により対照区と比較して変化した肝臓代謝物は20 産物であり、その変化した代謝物から、GLP-1 は、 肝臓での糖新生、脂質合成および尿素合成を促進し ている可能性が示された。GLP-1投与による血漿イ ンスリン濃度の増加は一過性であり、バイオプシー 時にはすでに低値で推移していた（GLP-1 は高値） ことから、この肝臓代謝物への影響は GLP-1による 可能性が考えられる。  そこで詳細に GLP-1 の肝臓での作用を検討する ために、去勢ヒツジを用いて、ユーグリセミックク ランプと GLP-1 注入併用試験を実施した。血漿イ ンスリン濃度はユーグリセミッククランプ開始後か ら高値を示し、その後、GLP-1注入により一過性の 増加を示した後、ユーグリセミック終了後、速やか に減少し、試験終了まで低値で推移した（data not shown）。一方、血漿 GLP-1濃度は、GLP-1注入開始 から試験終了まで高値で推移した（data not shown）。 図6にその時の血漿成分濃度を示した。血漿トリグ リセリド（TG）濃度は、インスリン注入に伴い増 加したが、インスリン注入終了後は減少した。総コ レステロール（T-CHO）濃度は、インスリン注入に よる影響は見られず、GLP-1 注入により減少した。 血漿遊離脂肪酸（NEFA）、ケトン体および乳酸濃度 は、インスリンにより減少したが、GLP-1注入下で は増加した。また、血漿グルカゴン濃度は試験期間 を通して低値で推移した。  図 7 にインスリン、GLP-1 および併用注入時の去 勢ヒツジ肝臓代謝物濃度（相対値）を示した。これ 図 5． 離乳前後の子牛への GLP-1 単回投与（i.v.）が血漿インスリン濃度に及ぼす影響 （n＝ 4，増加面積：min・ng／mL）。 矢印：離乳

図 6． 去勢ヒツジにおけるユーグリセミッククランプおよび GLP-1 注入が血漿成分に及ぼす影響（n＝ 4）。 〇：ユーグリセミッククランプ開始時と比較して有意差あり（p＜0.05） △：GLP-1注入開始時と比較して有意差あり（p＜0.05） □：ユーグリセミッククランプ終了時と比較して有意差あり（p＜0.05） ※グルコースは基礎血糖値を維持するように可変的に試験終了まで頸静脈から注入 表 1． 去勢牛への GLP-1 単回投与（i.v.）後に変化した肝臓代謝物（n＝3）。 Ratio：GLP-1投与後の肝臓代謝物／生理食塩水（対照区）投与後の肝臓代謝物

ら肝臓代謝物の一部は、図6で示した血漿成分と同 様の変化を示しており、また、多数の肝臓代謝物に おいて GLP-1はグルカゴン様の作用を示した。  以上のことから、反芻動物の GLP-1は単胃動物と は異なり、インスリン作用の増強あるいはインスリ ン類似作用は示さず、グルカゴン様の作用を示す可 能性が考えられる。 4．おわりに  反芻動物の GLP-1は、単胃動物とは異なり、グル コースによる分泌刺激は生来的に弱く、反芻動物の 主要エネルギー源である VFA により分泌が促進さ れる。また、インクレチンとしての作用は単胃動物 同様に有するが、それは血糖依存的作用ではない。 また膵外作用に関しては抗インスリン（グルカゴン 様）作用を示すことが考えられる。反芻動物は、主 要吸収エネルギー源を前述のように VFA に依存し ており、生来的にインスリン抵抗性を有する。この ような動物種において、GLP-1が抗インスリン作用 を示すことは、ある意味で合目的である。 【参考文献】

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