博 士 （ 薬 学 ） 小 松 康 雄
学 位 論 文 題 名
ヘ ア ピ ン 型 リ ボ ザ イ ム の 構 造 活 性 相 関 に 関 す る 研 究
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
1980年 代 に 触媒 的 に 作用 す るRNAが 発見 さ れ 、そ れ ら は 、RNA酵素 と いう意味 か らりボザイムと呼ばれ、現在では反応様式および必要配列から幾っかに分類されている．こ の中で、タバコリングスポットウイルスのサテライトRNAの（―）鎖の自己切断活性の中 心部位として見いだされたりボザイムとしてへアピン型リポザイムがある．ヘアピン型リポ ザイ ム は50塩 基 か らな り 、4つ のhelixと2つ の大き な内部ル ープを もつ．特 に内部 ループの配列は、切断活性に必須であり、このりボザイムの切断活性の本質を担うと考えら れている．筆者は、このへアピン型リボザイムの構造と活性の相関性について研究を行ない、
さらに構造に関して得られた知見から、新しいヘアビン型リボザイムを構築したことを報告 する．
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まず、ヘアピン型リポザイム（E50）をヘアピンループ部位で分けても切断活性示すか ど う か を 調 べ た ． ヘ ア ピ ン ル ー プ で （G30−U31の 間 ）E50を2つ の フ ラグ メ ン ト
（E30とE21） に分割 し、切断 活性を調 べた， その結果、天然型よりも若干活性が低下 す る も の の 、 ヘ ア ピ ン ル ー プ で り ボ ザ イ ム を 分 割 で き る こ と を 明 か に し た ． サテラ イトRNA全鎖長では連結活性が存在しているが、切断活性の最小配列部位（E5 O） と、ヘア ピンルー プで2つのフ ラグメ ントに分 けたE30−21が連 結活性をもっかど うかは明かではなかった，そこで、これらのりポザイムの連結活性にうぃて調べた．その結 果、E50とE30−21と もに 連 結 活性 を 示 した が、 切断活 性の低く い2つのフラ グメン トか ら な るE30―21の 方 が、1本 鎖のE50よ り も高い 連結活性 をもっ ことを明 かにし た． そ こ で 高い 連 結 活性 を も つE30―21に よって 、基質RNAの3 側 フラグメ ントを 長さの異なる別のフラグメントで組換える反応が可能であるかどうかを調べた，その結果、
本来の基質の3 側切断断片が切り出され、リボザイムによって異なるRNAフラグメント が連 結 し たRNAが生 成され、 リポザ イムによ るRNAの組換え 反応の可 能性を 示した，
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ヘアピン型リポザイムは、2つのステムループドメインからなると考えることができる．
各ドメインの内部ル―プが切断及び連結活性に必須であることより、ヘアピン型リポザイム は折れ 曲がっ た構造（ ベント構 造）を とっていると考え、以下の実験を行なった，
2つのステム間にバルジが存在すると、バルジアウトする塩基の種類によって、ベントの 度合いが異なることがある，そこでそのような影響がないように、塩基部位を含まないりボ ースの誘導体としてプロパンジオールフオスフェイト（PPL）を合成し、ペントのジャン クショ ン部位と 思われ るSlとE50の3 末端の 間に数を変えて導入した，反応の結果、
リンカーを全く含まないものは切断されず、多くのりンカーを含むりポザイムほど高い切断 率が確認された．この結果は、ヘアピン型リボザイムの活性な構造がぺント構造であること を示している．
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ヘアピン型リポザイムのべント構造のヒンジに相当する部位には、構造的なストレスが生 じていると考えられる．そこで、このヒンジ部位でりボザイムを分け、代わりにヒンジの向 かい側に相当する部位をりンカーでっなげた分子でも切断活性を示すかどうかを調べた．シ チジンリンカーによって連結した3種類の基質RNAを合成し、切断活性を調べたところ、
ヒンジ部位でりポザイムを分割したタイプでも切断反応が生じることが明かとなった．しか しながら、ヒンジ部位で本来存在しない塩基対を形成する場合は、切断反応が生じなかった．
これは、新たに形成された塩基対によって活性なべント構造を形成できなくなったためであ ると思われる．
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ヘアピ ン型リ ポザイムがベントしている場合、E30の5 末端とへアピンループは、3 次構造 上は接近 してい ると考え られる ，そこでE30の3 末 端（G30）とヘアピンルー プを接続し、ヒンジ部位で分断したドメイン変換型ヘアピン型リポザイムを構築した．この とき、2つのドメイン間の距離が重要であると考え、3〜l8個のシチジンリンカーを導入 し たRNA (RCn、n‑3、6、9、12、18)を 合 成 し 、E19を あ わ せ て 、 基 質RNAを 切 断できるかどうか調べた．反応の結果、このドメイン変換型リポザイムは、天然型と同じ部 位でSlを切断し、シチジンリンカーの数が多いほど切断活性が高くなることが明かと′なっ た興味深いことに、9個以上のシチジンリンカーをもっものは、天然型よりも切断のステッ プ（k2）が速いことが明かとなった．この新しいドメイン変換型リポザイムは、天然型と 同じ切断活性に必要な配列の傾向を示したことより、ドメイン変換型リポザイムは、活性に 必要な高次構造を保存し、天然型と同じ反応機構でRNAの切断を行なう可能性が示された，
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学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教 授 大 教 授 松 助教授 井 助教授 周
塚 栄 子 田 彰 上 英 夫 東 智
学 位 論 文 題 名
