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  こ の 病 原 菌 を バ ナ ナ の 表 面 に 接 種 し 、3日 後 に 腐 敗 し た バ ナ ナ を 酢 酸 エ チ ル に て 抽 出 し た 。 抽 出 液 か ら1が 単 離 さ れ た た め 、Z． theobromaeは 果 物 の 中 に こ の 毒素 を蓄 積 する こ と が 示 さ れ た 。 こ の こと によ り1n vitroと´ 打レ ´vo両 方に おい て腐 敗 を弓Iき起 こ す化 合 物1を 単 離 す る こ と に 成 功 し た 。aーmethylene‑y‑butyrolactones類 化 合 物 は 様 カ な 抗 菌 活性 や抗 腫 瘍活 性を 持っ て おり 、オ レフ ィン の 二重 結合 が

a− methylene‑y−butyrolactones類 の 抗 生 物 質 の 活 性 中 心 で あ る と い う こ と が 、 sulfhydryl受 容 体 と 反 応 す る こ と に よ る と い う こ と が 解 明 さ れ て い る 。 化 合 物1が decumbicacidに変 換さ れ た 時、 毒性 が消 失し た こと によ り、

a―me thylene‑'yーbutyrolactonesの 活性 は彊 ーexomethyleneラク ト ン構 造に 由来 す ること が 示 唆 さ れ た 。 同 じ く 、exomethyleneユ ニ ッ ト が 化 合 物1の 腐 敗 を 引 き 起 こ す 活 性 中 心 で あ る と 考 え ら れ る 。 この 新し い毒 素 の発 見に より と， theobromaeの 病因 が明 らか に なっ た 。ま た、 こ の病 原体 によ る 腐敗 を防 ぐこ とも 可 能に なる 。

2P expansumlj>らの新規抗菌毒素の単 離

  ムtheobromaeに 対 す る 抗 菌 活 性 を 指 標 と し て 、Pexpansumt c養 液 の 酢 酸 エ チ ル 抽 出 物 を シ リ カ ゲ ル カ ラ ム を 用 い て 精 製 し た 。 得 ら れ た 活 性 画 分 は 、 そ れ ぞ れ メ タ ノー ルお よ び エ タ ノ ー ル で 結 晶 化 を 行 い 、 白 色 結 晶 と し て 化 合 物3お よ び4が 得 ら れ た 。 これ らの 化合物はMS，IR，および各種NMRスベ クトルデータから、

6−hydroxy―1，8−dimethoxyー3，5―dimethylisochroman (3)お よび1−ethoxy−6−hydroxy‑

8―methoxy―3，5−dimethylisochroman(4)と 推 定 さ れ、 そ の構 造か ら3およ び4は同 じ化 合 物 の メ タ ノ ー ル お よ び エ タ ノ ー ル 付 加 化 合 物 と 考 え ら れ た 。P expansumの 培 養 液 中 に 化 合 物3お よ び4の 出 発 物 質 と な る 化 合 物 が 存 在 す る の か 否 か 確 認 す る た め 、 非ア ルコ ー ル 性 有 機 溶 媒 の み を 用 い て 培 養 液 の 精 製 を 試 み た 。 そ の 結 果 、 化 合 物5、6お よ び7が 単離され た。化合物6は4，6―dihydro−8−methoxy−3，5ーdimethyl−6−oxo―3H‑benzopyranと 決定した 。化合物5の構造は間接

的に1，6―dihydroxyー8−methoxyー 3，5−dimethylisochromanと 推定 さ れ た 。 単 離 さ れ た 化 合 物 を そ れ ぞ れ 比 較 す る と6は 明 ら か に 不 安 定 で あ り 、 精 製 過 程 で 容 易 に メ タ ノ ー ル 、 エ タ ノ ー ル ま た は 水 と 反 応 し 、 新 規 化 合 物3、4 お よ び5が 生 成 し た も の と 推 察 される。

..CH3     3 MeOH       HO       4 EtOH

6 Ri=H, R2=H, R3=OCH3 8 R1=CH3, R2=COOH, R3=OH

5 H20

7 Hlfdrogenation

3 R=OCH3 4 R=OCH2CH3 6 R=OH 7 R=H

..CH3

  続 い て 、 こ れ ら の 化 合 物 の 立 体 化 学 に つ い て 検 討 し た 。 化 合 物3のC−3位 は 開 環 反 応 を 経 た 後 、 改 良Mosher法 に よ り5と 決 定 し た 。 従 っ て 、4と6のC―3位 もSと 決 定 し た 。 さ ら に 、NOE差 ス ベ ク ト ル か ら4と5は 、 い ず れ も15お よ び3Fで あ る こと が 明ら かと なっ た。

  本 菌 の 主 要 な 代 謝 産 物 の ー っ で あ る7は 化 学 的 方 法 に よ り 、 そ の 絶 対 構 造 が 決 定 さ れ た 。6の エ タ ノ ー ル 付 加 物 で あ る4は 培 養 液1リ ッ ト ル 当 た り 約180 mg単 離 さ れ 、6が 戸 expansumの 主 要 な 抗 菌 化 合 物 と 示 唆 さ れ た 。

  化 合 物3、4お よ び6の 工 ． theobromaeに 対 す る 菌 叢 成 長 阻 害 活 性 （100pg/ml)は 、 そ れ ぞ れ76%，74%お よ び69%で あ っ た 。 し か し な が ら 、7は 同 濃 度 で10%以 下の 阻害 活性 しか 認 め ら れ な か っ た 。 化 合 物6の 類 縁 化 合 物 で あ るcitrinin (8)は 抗 菌 活 性 試 験 中 に dihydrocitrininに 誘 導 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る こ と か ら 、 同 様 な メ カ ニ ズ ム に よ り6 も 抗 菌 活 性 試 験 中 に 、 そ の 一 部 が7に 変 換 さ れ る も の と 思 わ れ る 。 構 造 活 性 相 関 の 観 点 か ら す る と 、6の 誘 導 体 で あ る3、4お よ び7の 抗 菌 活 性 が そ れ ぞ れ 異 な っ て い る こ と は 大 変 興 味 深 い も の で あ り 、 そ の 解 明 は ムtheobromaeの 防 除 に 非 常 に 有 用 で あ る と 思 わ れ

ー 154―

る。また、化合物

はcitirnin と構造が類似しているので、同じ生合成経路を経て生成 されると予想され、citrinin と同様に多様な生物活性を有するものと推定される。

以上の結果をまとめると、ムtheobromae およびその拮抗微生物

の培養 液 中 か ら

種 の新 規化 合物 とそ の誘 導体 が見 出さ れた。 これ らの 抗菌 物質 はム

の腐敗を引き起こすメカニズムの解明および、その病害の予防に資するもの と思われる。

― 155ー

学位論文審査の要旨

    学 位 論 文 題 名

  Studies on novel toxins fromaplant pathogen     Lasiodiplodia theobroTnae and its

  antagonistic organlSmfを 銘 ZCZZZ彪 所 ￡ ゆ ロ 銘 S勿 九     （ ・ 植 物 病 原 菌 己 鯲 め dゆ め dを 競 ピ 〇 ろ 朋 絖 ロ ￠ 及 び そ の 拮 抗 微 生 物R咒 むZzZ砒 絖 啣 ロ 髭s勿 繊 の 新 規 毒 素 に 関 す る 研 究 ）

  Lasiodiplodia theobromaeは熱 帯地 方お よび亜熱帯地方に広 く見られる病原菌であ る。この病原菌は生育して いる植物に感染し、多数の種類の疾病を引き起こすのみなら ず、貯蔵されている果物お よび根菜類にも感染し腐敗をもたらす。現在、病原菌に対す る生物学的な防除法が注目 されている。病原菌を生物学的にコントロールすることによ って疾病を予防することは 環境に優しい理想的な方法であると言える。多くの研究によ って、病原菌の拮抗微生物 が生成した抗生物質が病原菌の抑制に関係していることが示 されている。本研究では病 原菌E． theobromaeからの毒素の単離、構造解析、及びこの病 原体の拮抗微生物であるPenicil´ ium expansumiJゝらの抗生物質の単離、構造解析を目標 に研究を行った。

1ムtheobromaeからの新規毒素の単離

  供 試病 原菌 は宮 古島 で羅 病し たマ ンゴ ーの 枝か ら分離された。毒素検出の生物検定 には、バナナに針で穴を開け、そこに試料をのせて、 病斑形成の有無を測定する方法を 用いた。ムtheobromaeはPD培地で培養を行い、培養濾 液を酢酸エチルで抽出を行い活性 のあった酢酸エチル抽出部を、シリカゲルカラムで精 製を繰り返し、さらにHPLCで精製 し化合物1を単離した。MS，IR，NMR，2次元‑NMR (HMoc，HMBC，1H一1HCOSY)などの解析によ り 、 化 合 物 1は 新 規 化 合 物

(3S, 4R)3― carboxy− 2― methylene−heptanー4―olide  と 決 定さ れた 。HPLCに よ って精製 している問に化合物1は

decumbic acid (2)に転化する。

lsomenzation

(3S,4R)‑3 carboxy‑2.methylene‑heptan.4.olide (1)

  18pgの 化 合 物1を 用 い て バ ナ ナ の 表 面に 注入 する と、 顕著 な表 面腐 敗活 性を 示し た 。 一 方 で 、 単 離 さ れ た2は 活 性 を 示 さ な か っ た 。

彦 士

信 幸

照

哲

英

原 原

方 浦

吉

田

生

松

授 授

授 授

教

教 教

教 助

査 査

査 査

主 副

副 副

  この 病原菌 をバナナ の表面 に接種し 、3日 後に腐 敗したバ ナナを酢酸エチルにて抽出 した 。抽出 液から1が単離 された ため、ムtheobromaeは果物 の中にこの毒素を蓄積する こ と が示 さ れ た。 こ の こと に よ りむ汀troとむ汀vo両方に おいて腐 敗を引 き起こす 化 合物1を単 離する ことに成 功した 。a−methylene‑ybutyrolactones類化合物は様々な抗 菌活性や抗腫瘍活性を持っている。exomethyleneがsulfhydryl受容体と反応する゛ことに より活性を発現することが解明されている。

2P expansuRrlj)らの新規抗菌毒素の単離

  ムtheobromaeに 対 す る抗 菌 活 性を指 標として 、PexpansumのPD培養 液の酢酸 エチル 抽出物を シリカゲ ルカラ ムを用い て精製した。得られた活性画分は、メタノールおよび エタノー ルで結晶 化を行 ったとこ ろ、白色結晶の化合物3および4が得られた。これらの 化合物はMS，IR，および各．種NMRスペクトルデータから、

6―hydroxy―1，8―dimethoxy―3，5ーdimethylisochroman (3)および1―ethoxy―6−hydroxy‑

8―methoxy―3，5―dimethylisochroman(4)と決定した。その構造から3および4は同じ化 合物 のメ タノール および エタノー ル付加 化合物と 考えられ た。P expansumC)培養液中 に化合物3およ び4の出発物 質となる 化合物が存在するのか否か確認するため、非アルコ ール性有 機溶媒の みを用 いて培養 液の精 製を試み た。そ の結果、化合物5、6および7が 単離された。化合物6は4，6−dihydroー8−methoxy−3，5一dimethyl−6一oxo‑3H‑benzopyranと 決 定 し た 。 化 合

物5の構造は

1，6ーdihydroxy

―8―methoxy−3， 5−dimethyliso

...CH3    3 MeOH     HO       4 EtOH

5 H20 7 Hydrogenation

、.cH3HO

OCH3

chromanと推定  e  3R=OCH3  8     4 R=OCH2CH3

された。単離さ6R＝OH れた化合物を  7 R=H

そ れぞれ 比較する と6は明らか に不安定 であり 、精製過 程で容 易にメタノール、エタノ ー ル ま た は 水 と 反 応 し 、 新 規 化 合 物3、4お よ び5が 生 成 し た も の と 推察 さ れ る。

  続いて、 これらの 化合物 の立体化 学につ いて検討 した。 化合物3を酸性条件下で処理 すると8を生じた。開環反応物8の立体化学は改良Mosher法によりざと決定した。さらに、

3のNOE差スベ クトルからC−3位のCH3とC−1位のOCH3はシスの関係にあることが明らかに なり、C−1位の立体配置を5であると決定した。

  6の エ タ ノ ール 付 加 物で あ る4は 培 養 液1リ ッ トル 当 た り約180 mg単 離さ れ 、6がP expansumの主要な抗菌化合物と示唆された。

  化合物3、4、6お よび7の工． theobromaeに対する菌叢成長阻害活性（100pg/ml)は、

それぞれ76%，74%，69%および10％以下であった。

  以上 の結果 をまとめ ると、 工． theobromaeおよび その拮 抗微生物Pexpansumの 培養 液 中 か ら2種 の 新 規 化 合 物 と そ の 誘 導 体 が 見 出 さ れ た 。 こ れ ら の 抗 菌 物 質 は ム theobromaeの腐敗を 引き起 こすメカ ニズムの解明および、その病害の予防に資するもの と 思われ る。よっ て審査 員一同は 何国春が博士（農学）の学位を受けるのに十分な資格 を 有する ものと認 めた。