イヌのホスホフルクトキナーゼ-1 の活性調節

(1)

イヌのホスホフルクトキナーゼ

-1

の活性調節

日本大学大学院獣医学研究科金井修一郎

2019

(2)

第

1

章序論

1

第

2

章イヌの各種臓器における

PFK-1

の比活性およびアイソフォーム構成 7

2.1

緒言

8

2.2

材料および方法

10

2.2.1

材料

10

2.2.2

供試臓器

11

2.2.3

細胞質画分の分離および低分子物質の除去

12 2.2.4 PFK-1

の活性測定

12 2.2.5 FBP-1

の活性測定

13

2.2.6

ウェスタンブロッティング

13 2.2.7 real-time RT-PCR 14

2.3

結果

15 2.3.1 PFK-1

比活性

15 2.3.2 FBP-1

比活性

15

(3)

2.3.3 PFK-1

アイソフォームおよび

FBP-1

のタンパク質発現ウェスタン

ブロッティング

16 2.3.4 real-time RT-PCR 16

2.4

考察

17

第

3

章イヌ骨格筋

PFK-1

の活性調節

26

3.1

緒言

27

3.2

28

3.2.1

材料

28

3.2.2

供試臓器

29 3.2.3 PFK-1

部分精製

29

3.2.4

タンパク質濃度測定

30 3.2.5 PFK-1

の活性測定

30

3.3

結果

31

3.3.1

イヌ骨格筋

PFK-1

の精製度

31 3.3.2 pH

の効果

32 3.3.3 ATP

の効果

32 3.3.4 F-6-P

の効果

32

(4)

3.3.5 F-2,6-P

2の効果

33 3.3.6 AMP

の効果

33 3.3.7 cAMP

の効果

33

3.3.8

クエン酸の効果

34 3.3.9 UTP

の効果

34

3.4

考察

35

第

4

章イヌ肝臓

PFK-1

の活性調節

47

4.1

緒言

48

4.2

49

4.2.1

材料

49

4.2.2

イヌ肝臓

PFK-1

の部分精製

49 4.2.3 PFK-1

の活性測定

50

4.2.4

51

4.3

結果

51 4.3.1 pH

の効果

51 4.3.2 ATP

の効果

52 4.3.3 F-6-P

の効果

52

(5)

4.3.4 F-2,6-P

2の効果

52 4.3.5 AMP

の効果

53

4.3.6

53

4.3.7

コハク酸の効果

53

4.4

考察

54

第

5

章イヌ脳

PFK-1

の活性調節

64

5.1

緒言

65

5.2

66

5.2.1

材料

66

5.2.2

イヌ脳

PFK-1

の部分精製

66 5.2.3 PFK-1

の活性測定

67

5.2.4

タンパク質の定量

68

5.3

結果

68 5.3.1 pH

の効果

68 5.3.2 ATP

の効果

69 5.3.3 F-6-P

の効果

69 5.3.4 F-2,6-P

2の効果

69

(6)

5.3.5 AMP

の効果

70

5.3.6

70

5.4

考察

70

第

6

章総括

79

謝辞

83

引用文献

84

(7)

1

第

1

章序論

(8)

2

グルコースは，生体を構成する様々な細胞に取り込まれ，アデノシン三リン酸（ATP）産生の基質となる重要な栄養素である。グルコース輸送体により細

胞内に取り込まれたグルコースがリン酸化され，グルコース

6-リン酸となって

ピルビン酸まで代謝される経路が解糖である。解糖は嫌気的条件下での反応であり，ピルビン酸はさらに還元されて乳酸が生成する。この解糖の過程では，

1

分子のグルコースから

2

分子の

ATP

を産生する。一方，好気的な条件下で

は，ピルビン酸はミトコンドリア内に輸送され，クエン酸回路，電子伝達系を

経て完全に酸化されて二酸化炭素と水となるが，多くの

ATP

が産生される。そのため，解糖はあらゆる細胞において

ATP

産生の重要な初期代謝過程であり，

解糖調節は細胞機能にとって重要となる（図

1-1）

。

解糖系は，細胞質に存在する酵素により触媒される代謝系であり，代謝速度は，ヘキソキナーゼ，ホスホフルクトキナーゼ-1（PFK-1）,ピルビン酸キナー

ゼの

3

種の律速酵素により制御されている。PFK-1は，フルクトース

6-リン酸

（F-6-P）を

ATP

依存的にリン酸化し，フルクトース

1,6-ビスリン酸（F-1,6- P

2）と

ADP

生成を不可逆的に触媒する酵素であり，解糖調節において中心的な役割を担っていると考えられている [Dunaway, 1983; Mor et al., 2011; Sola-Penna

et al., 2010]。哺乳類の PFK-1

には筋肉型

PFK-M，肝臓型 PFK-L

および血小板

型

PFK-P（脳型 PFK-C）の 3

種類のアイソフォームが存在し，それぞれの遺伝

(9)

3

子によりアイソフォームがコードされる [Vora et al., 1981a; 1981b; 1982; 1983]。

3

種類の

PFK

アイソフォームは

4

量体を形成し，様々な組織において，活性制御に関わり，組織特異的な解糖系の調節を行っている [Dunaway et al., 1988;

Dunaway & Kasten, 1987]。

糖代謝は，各組織におけるエネルギー要求量やエネルギー源の違いにより，

特徴的な性質を有することが知られている。骨格筋は，好気的条件では解糖か

らクエン酸回路，電子伝達系を介して多量の

ATP

が産生されるのに対し，嫌気的条件ではピルビン酸から乳酸が生成され，必要な

ATP

を解糖のみで産生することが可能である。さらに，細胞内のグルコースからグリコーゲンを合成し貯蔵することで，必要に応じグルコースに分解し解糖を介してエネルギーの産生に利用することも可能である [Evans et al., 2019; Murray, 2016]。肝臓は，血糖維持において中心的な役割を果たす。摂食時には門脈を介して取り込んだグルコースからグリコーゲンを合成し貯蔵し，絶食時にはグリコーゲン分解だけでなく，糖新生により糖質以外からグルコースを産生し血糖を供給することが可能である [Petersen et al., 2017]。脳は，飢餓状態を除きエネルギー源を血糖に依存するが，常に十分な酸素供給があり好気的代謝のみを行うため，解糖からクエン酸回路，電子伝達系を介して多量の

ATP

を産生する [Mergenthaler et al.,

2013]。また，脳の機能維持のためにグルコースを消費して乳酸産生も行ってい

(10)

4

る [Magistretti & Allaman，2018]。

近年，イヌはコンパニオンアニマルとしての地位が確立され，イヌに対してもヒト医学領域に遜色のない診療が提供されてきている。しかし，ヒトと他の動物種では，解剖学的構造，食性，行動様式が異なることから，糖代謝調節についても異なる点があると考えられるが，イヌの糖代謝調節に関する報告は少ない。そこで，本研究では，イヌのグルコース代謝を明らかにする目的の１つとして，特徴的な糖代謝を有する骨格筋，肝臓，脳に注目し，解糖系の律速酵

素である

PFK-1

について，比活性，アイソフォーム構成，細胞内因子による活

性調節について検討した。

第

2

章においては，イヌの骨格筋，肝臓および脳における

PFK-1

について，

酵素活性を測定し比活性を求め，タンパク質発現と

mRNA

発現からアイソフォーム構成について比較検討した。

第

3

章では，比活性が高く，M型のみのアイソフォームで構成されることが明らかとなったイヌの骨格筋

PFK-1

について，細胞内因子による活性調節について検討した。

第

4

章では，比活性が低く，主に

L

型と少量の

P

型のアイソフォームで構成されるイヌの肝臓

PFK-1

(11)

5

第

5

章では，比活性が高く，3種のアイソフォームが混在するイヌの脳

PFK-

1

(12)

6

図

1-1.

解糖系とクエン酸回路の概略図

(13)

7

第

2

章

イヌの各種臓器における

PFK-1

の比活性およびアイソフォーム構成

(14)

8

2.1

緒言

解糖は，グルコースの異化によりエネルギーを産生する嫌気的な反応経路で

ある。すべての細胞の細胞質内に存在し，ヘキソキナーゼ，

PFK-1

およびピルビン酸キナーゼの

3

種の律速酵素が解糖制御に関わっている。

PFK-1

は，

F-6-P

を

ATP

依存的にリン酸化し，

F-1,6-P

2と

ADP

生成を不可逆的に触媒する酵素であり，解糖調節において中心的な役割を担っていると考えられている [Dunaway,

1983; Mor et al., 2011; Sola-Penna et al., 2010]。

哺乳類の

PFK-1

には，筋肉型（PFK-M），肝臓型（PFK-L）および血小板型（PFK-

P）あるいは脳型（PFK-C）といわれる 3

種類のアイソフォームが存在する。

PFK-

1

は，その 3種のアイソフォームを基本単位として

4

量体で構成されているが，

動物種により，また，臓器により構成が異なっている。これまでに，ラット

[Dunaway & Kasten, 1986]，ウサギ [Foe & Kemp, 1985; Kemp, 1971; Tsai & Kemp, 1974]，ウシ[Fukushima & Sugiya, 1992]

およびヒト [Dunaway et al., 1988; Vora et

al., 1981a; 1981b]

における各種臓器のアイソフォーム構成について，精製した

PFK-1

を用いて，電気泳動法による解析がなされている。

グルコースは，生体を構成する様々な細胞に取り込まれ，

ATP

産生のための基質となる重要な栄養素であるが，グルコース代謝は，組織や臓器の独自な機能に依存してその調節系が異なっている。骨格筋は，安静時には脂肪酸を主なエネル

(15)

9

ギー源として利用するが，運動時にはグルコースの利用が亢進する。好気的条件

では，グルコースから代謝されたピルビン酸はアセチル

CoA

に代謝され，クエン酸回路，電子伝達系を介して多量の

ATP

が産生される。一方，嫌気的条件ではピルビン酸は乳酸となり，解糖による

ATP

産生が優先される。また，細胞内のグルコースからグリコーゲンを合成し，貯蔵するが，必要に応じてグリコーゲ

ンを分解し，解糖を介して

ATP

産生に利用する [Murray, 2016]。肝臓は，様々な代謝において重要な役割を担っているが，血糖調節においても中心的な役割を果たす。グリコーゲン合成能と糖新生能を有し，摂食時はグルコースからグリコーゲンを合成し，貯蔵するが，低血糖時はグリコーゲン分解や糖新生によりグルコースを産生し，血糖として供給する [Petersen et al., 2017]。脳は，多量のエネルギーを必要とするが，飢餓状態を除きエネルギー源として血糖に依存する。常に十分な酸素が供給されることから，解糖の代謝産物であるピルビン酸は，ミト

コンドリアにてアセチル

CoA

となり，クエン酸回路，電子伝達系を介し多量の

ATP

が合成される[Mergenthaler et al., 2013]。また一方で，近年，脳ではその機能

維持のためのグルコース取込みが亢進し，乳酸産生が亢進することも知られている[Cunnane et al., 2011; Magistretti & Allaman, 2018]。

このように臓器や組織による代謝の違いに依存して，各臓器における

PFK-1

のアイソフォーム構成や活性調節が異なるなど，特徴的であることが示唆され

(16)

10

ている [Dunaway et al., 1988; Dunaway, 1983; Kemp, 1971; Sola-Penna et al., 2010;

Tsai & Kemp, 1974]。

しかし，イヌの

PFK-1

に関する報告は少なく[Giger et al.,

1988; Mhaskar et al., 1992; Smith et al., 1996a; 1996b; Washizu et al., 1999]，各臓器に

おける

PFK-1

については比較検討はなされていない。本章では，イヌのグルコ

ース代謝の一端を理解することを目的とし，グルコース代謝の異なる骨格筋，肝

臓，脳における

PFK-1

の比活性の違いを検討し，mRNAおよびタンパク質の発現よりアイソフォーム構成について検討した。

また，糖新生能を有する肝臓については，

PFK-1

の逆向きとなる

F-1,6-P

2から

F-6-P

への反応を触媒するフルクトースビスホスファターゼ-1（FBP-1）について

も比活性の違いと，mRNAおよびタンパク質発現について検討した。

2.2

2.2.1

材料

酵素活性の測定に用いたアデノシン一リン酸（AMP），

aldolase

（ALD），

glycerol 3-phosphate dehydrogenase

（G3PDH），

glucose-6-phosphate dehydrogenase

（G6PDH）

は和光純薬工業株式会社 (Osaka, Japan) から購入した。ATP，F-6-P，F-1,6-P2，

NAD， NADP， triosephosphate isomerase

（TPI），

phosphoglucose isomerase （PGI）

は

Sigma-Aldrich (St. Luis, MO, USA)

から購入した。ウェスタンブロッティング

(17)

11

に用いた

SDS

サンプルバッファー（Red Loading Buffer）は New England Biolabs

（Ipswich, MA, USA），7.5％ポリアクリルアミドゲル（Mini-PROTEAN TGX ゲ

ル）は

Bio-Rad Laboratories

（Hercules, CA, USA），ポリフッ化ビニリデン（PVDF）

膜（Immobilon-P）は

Merck Millipore（Burlington, MA, USA）

，ブロッキング試薬

（ブロックエース）は

DS Pharma Biomedical（Osaka, Japan）

，抗

PFK-P・PFK-M

抗体（ab204131），抗

PFK-L

抗体（ab181064）および抗

FBP-1

抗体（ab109732）

は

Abcam（Cambridge, UK）

，HRP 結合抗ウサギ

IgG

抗体および化学発光試薬

（ECL Western blotting Analysis System）は

GE Healthcare（Chicago, IL, USA）から

購入した。

real-time RT-PCR

に用いた

TRIzol

は

Thermo Fisher Scientific

（Waltham,

MA, USA）

，

RNeasy Mini Kit

は

Qiagen

（Venlo, Netherlands），

PrimeScript RT Master Mix， SYBR Premix Ex Taq™II

およびプライマーは

Takara Bio Inc.

（Kusatsu，

Japan）

から購入した。その他の一般試薬は，和光純薬工業株式会社および

Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA)から購入した。

2.2.2

供試臓器

本研究に使用した骨格筋，肝臓，脳は，日本大学動物実験委員会によって承認された他の実験に使用された後，ペントバルビタールナトリウム（150 mg / kg体重）の静脈内投与により人道的に安楽死されたビーグル犬（オス

2

頭，メス

2

頭，

(18)

12

1~2

歳）より，安楽死後，速やかに摘出した。臓器は，摘出後，実験に使用するまで-80°Cで保存した。本研究のプロトコルは，日本大学動物実験委員会（承認番号：AP13B074-1）によって承認された。

2.2.3

細胞質画分の分離および低分子物質の除去

実験は

4°C

環境で実施した。骨格筋，肝臓，脳（各

300 mg）を外科剪刀で細

切し，ペレットミキサーを用いて，10 mM ジチオトレイトール（DTT）を含む

50 mM

トリスリン酸バッファー（

pH 8.0）溶液にてホモジナイズした後，

100,000×g

で

30

分間，超遠心し，細胞質画分を得た。

PD-10

カラム（GE Healthcare）

を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより

PFK-1

の活性調節因子となる低分子を除去した細胞質画分を実験に供した。細胞質画分のタンパク質濃度は

Bradford

法により測定した[Bradford, 1976]。

2.2.4 PFK-1

の活性測定

PFK-1

の活性測定は，活性調節因子の影響を受けない至適条件下で実施した

[Fukushima & Sugiya, 1992]。50 mM HEPES

バッファー（pH 8.2），100 mM KCl，

6.5 mM MgCl

2，1 mM NH4

Cl，5 mM KH

2

PO

4，0.3 mM NADH，0.5 units ALD，0.5

units G3PDH，5 units TPI，1 mM F-6-P，5 mM ATP

および

0.1 mM AMP

を含む混

(19)

13

合溶液に細胞質画分を加えて

1 mL

とし，25°C にて反応を行い，

U-2900 Spectrophotometer（Hitachi High-Technologies Corporation，Tokyo，Japan）を使用

して， NADH の酸化の変化を

340 nm

の吸光度の減少で継時的に測定した。

NADH

のモル吸光係数から，25°C で

1

分あたり

1 µmol

の

F-6-P

をリン酸化す

る酵素活性を

PFK-1

活性の

1 unit

として示した。

2.2.5 FBP-1

の活性測定

FBP-1

の活性測定は，

50 mM HEPES

バッファー（pH 7.4），

100 mM KCl， 5 mM EGTA， 1 mM MgSO

4，1 mM NH4

Cl， 0.5 mM NADP， 5 units G6PDH，10 units PGI

および

0.2 mM F-1,6-P

2を含む溶液に，細胞質画分を加えて

1 mL

とし，25°Cに

て反応を行い，U-2900 分光光度計を使用して， NADP の還元の変化を

340 nm

の吸光度の増加で継時的に測定した[Sawada et al., 2000]。NADP のモル吸光係数

から

25°C

で

1

分あたり

1 µmol

の

F-1,6-P

2を加水分解する酵素活性を

FBP-1

活性の

1 unit

として示した。

2.2.6

ウェスタンブロッティング

細胞質画分を

SDS

サンプルバッファーにて

95°C 5

分間処理し，7.5％ポリアクリルアミドゲルの各レーンに

PFK-1

活性

0.3 munits

相当をロードし，電気泳

(20)

14

動によりタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は

PVDF

膜に転写した。

PVDF

膜は，ブロッキング試薬で

50

分間処理した。その後，PVDF膜は，一次

抗体である抗

PFK-P

・PFK-M抗体（1：

1,000），抗 PFK-L

抗体（1：

500）

，抗

FBP- 1

抗体（1：1,000）と

120

分間反応させた。洗浄後，PVDF膜を二次抗体である

HRP

結合抗ウサギ

IgG

抗体（1：10,000）と

90

分間反応させた。検出には化学発

光を用い，化学発光シグナルを冷却

CCD

カメラ（ImageQuant LAS 4000 mini; GE

Healthcare）で測定した。

2.2.7 real-time RT-PCR

骨格筋，肝臓および脳から

TRIzol（Thermo Fisher Scientific）もしくは RNeasy Mini Kit

（Qiagen）を用いて

total RNA

を抽出し，

RNA

チップ電気泳動（Experion™

Automated Electrophoresis System, Experion™ RNA StdSens Analysis kit, Bio-Rad Laboratories）にて実験に適切な品質を確認した。 total RNA 500 ng

より

PrimeScript RT Master Mix（Takara Bio Inc.）を用いて逆転写し，cDNA

を合成した。cDNA 2

µL，SYBR Premix Ex Taq™II（Takara Bio Inc.），特異的なプライマー（表 2-1）を

加えて総反応量

25 µL

で

real-time PCR

を実施した。サーマルサイクラー（Thermal

CyclerDice®Real Time System II TP900，Takara Bio Inc.）を使用して熱変性 95°C 5

秒間，アニーリングおよび伸長反応

60°C 30

秒間のサイクルで

PCR

反応を行っ

(21)

15

た。増幅産物について，解離曲線で単一のピーク，アガロースゲル電気泳動で単

一のバンドを示すことを確認した。

PCR

増幅効率は，連続希釈した

cDNA

を基に作成した検量線の勾配から計算し，定量に適していることを確認した。 real-

time PCR

の結果は，ソフトウェア（Thermal Cycler Dice^®

Real Time System Software Ver.5.11B, Takara Bio Inc.）で second derivative method

および

comparative cycle

threshold (ΔΔCt) method

を使用して分析した。ハウスキーピング遺伝子は，

BestKeeper

ソフトウェアを使用して[Okabayashi et al., 2019]，Ct値の標準偏差に基づき評価し，GAPDH，ACTB，RPS18，および

TBP

の値は

1.15，1.43，0.69，

およびそれぞれ

1.34

であったため，

RPS18

を内部標準遺伝子として相対的

mRNA

発現量を算出した。

2.3

結果

2.3.1 PFK-1

比活性

各臓器における

PFK-1

の比活性は，骨格筋

0.309±0.044 units/mg protein（平均

値±標準誤差），肝臓

0.038±0.0078 units/mg protein，脳 0.290±0.033 units/mg protein

であった（図

2-1）

。

2.3.2 FBP-1

比活性

(22)

16

肝臓における

FBP-1

の比活性は，

0.057±0.0132 units/mg protein

であった（図

2-2）

。データとしては示さないが，骨格筋および脳には

FBP-1

の活性は認められなかった。

2.3.3 PFK-1

FBP-1

のタンパク質発現ウェスタンブロッテ

ィング

ウェスタンブロッティングの結果を図

2-3

に示す。

PFK-1

の各アイソフォームについて，骨格筋では

M

型，肝臓では

P，L

型，脳では

P，M，L

型が検出された。また，肝臓では

FBP-1

が検出された。

2.3.4 real-time RT-PCR

各臓器における内部標準遺伝子

RPS18

の

mRNA

発現量には差はなかった（図

2-4）

。また標的遺伝子の増幅効率および定量性について検討し，すべて適正な範

囲であった（図

2-5）

。

real-time RT-PCR

の結果を図

2-6

に示す。

PFK-1

の各アイソフォームについて，

骨格筋ではほぼ

M

型のみ，脳では

M， P， L

型の順で，肝臓では

L

型が主で

P

型とわずかに

M

型が認められた。また，肝臓において

FBP-1

の

mRNA

発現が確認された。

(23)

17

2.4

考察

至適条件下における

PFK-1

活性は，活性調節因子の影響を排除した最大活性を示しており，骨格筋や脳で比活性が高く，

FBP-1

活性を有する肝臓では比活性が低いことが明らかとなった。

本章で得られた結果から，イヌの骨格筋

PFK-1

は

M

型のみで構成されていることが明らかとなり，他の動物における過去の報告と一致した[Dunaway et al.,

1988; Dunaway & Kasten, 1987; Fukushima & Sugiya, 1992; Kemp, 1971]。骨格筋は

安息時／運動時でエネルギー要求量が大きく変化し，PFK-1 のアイソフォーム

が

M

型のみであることが運動状況等に応じた活性調節に適していると示唆された。

雑食性のヒトおよびラットの肝臓

PFK-1

では，L，M，P 型の順で構成され

[Dunaway et al., 1988; Dunaway & Kasten, 1987]，草食性のウサギおよびウシでは

主に

L

型で構成されると報告されている[Fukushima & Sugiya, 1992; Kemp, 1971]。

イヌの肝臓

PFK-1

は主に

L

型および少量の

P

型で構成されており，肝臓

PFK-1

のアイソフォーム構成と食性には関連性があることが示唆された。また，糖新生能を有することから，解糖と糖新生のバランスを調節する因子により活性調節がなされることが示唆された。

(24)

18

イヌの脳

PFK-1

は， P，M，L型の順で構成されており，他の動物と同様，3

種のアイソフォームにより構成されていることが明らかとなった[Dunaway et al.,

1988; Dunaway & Kasten, 1987; Fukushima & Sugiya, 1992; Kemp, 1971]。これは，

常に嫌気的および好気的にそれを消費する臓器という特徴がアイソフォーム構成にも反映していると考えられる。

(25)

19

表

2-1. Real-time PCR

に用いたプライマーの配列

Symbol GenBank accession no. Primer sequences Length (bp) RPS18 NM_001048082.1 F: ATAGCCTTTGCCATCACAGCAATTA

R: TTGGTGAGATCGATGTCTGCTTTC 86

PFK-M NM_001003199.1 F: GCTGACACAGCCCTCAACACTATC R: CGCAGTAGCCACCCATAGTTTC 109

PFK-L XM_544922.6 F: AGACCTGAAAGCCAACGTGGAG R: GGCCCAGAACGTTGGTCCTA 173

PFK-P XM_005617183.3 F: GTCCAACGTGGAGCACCTGA

R: CCTCGGAGTACAGCTGGTAGATGAA 122

(26)

20

図

2-1.

イヌ骨格筋，肝臓および脳における

PFK-1

の比活性

イヌ骨格筋，肝臓および脳の細胞質画分の

PFK-1

活性を

pH 8.2

の至適条件で測

定した。

PFK-1

活性は，

1

分間あたりの

340 nm

の吸光度の減少を測定し，

NADH

のモル吸光係数から

unit

を算出し，タンパク質濃度当りの比活性をとして示した。値は

4

例の平均値

±

標準誤差を示す。

(27)

21

図

2-2.

イヌ肝臓における

FBP-1

の比活性

イヌ肝臓の細胞質画分の

FBP-1

活性を

pH 7.4

の至適条件で測定した。

FBP-1

活性は，1分間あたりの

340 nm

の吸光度の増加を測定し，NADPのモル吸光係数から

unit

を算出し，タンパク質濃度当りの比活性をとして示した。値は

4

例の平均値±標準誤差を示す。

(28)

22

(a)

(b)

図

2-3.

イヌ骨格筋，肝臓および脳

PFK-1

FBP-1

のタン

パク質発現

(a)

イヌ骨格筋，肝臓および脳において，約

0.3 munits

の

PFK-1

活性を有する細胞質画分を用い，PFK-P, -M および

PFK-L

に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより

PFK-1

アイソフォームタンパク質発現の検討を行った。(b) FBP-1に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより，

イヌ肝臓の細胞質画分の

FBP-1

タンパク質発現の検討を行った。独立に繰り返し実施した

3

例中の代表的な結果を示す。

(29)

23

図

2-4.

イヌ骨格筋，肝臓および脳における内部標準遺伝子

RPS18

の

PCR

標準

曲線

イヌ骨格筋

(

●

)

，肝臓

(

▲

)

および脳

(

■

)

から抽出した

total RNA

から合成した

cDNA

をそれぞれ階段希釈したサンプルを用いて

RPS18 mRNA

発現を

real-time

RT-PCR

にて検討した。横軸は希釈率，縦軸は

Ct

値を示す。

PCR

効率は標準曲

線の傾きから計算し，相関係数

(R

²

)

は近似線より求めた。各臓器間に差はなかった。

16 20 24 28 32 36

0.0001 0.001 0.01 0.1 1

Ct (2nd Derivative Max.)

Initial Quantity

RPS18

skeletal muscle, brain & liver

R

²

=0.998, efficiency 108.6%

(30)

24

図

2-5.

標的遺伝子の増幅効率および定量性

PFK-1

アイソフォーム

mRNA

発現については脳より抽出した

total RNA，FBP-1

については肝臓より抽出した

total RNA

から合成した

cDNA

をそれぞれ階段希釈したサンプルを

real-time RT-PCR

にて検討した。横軸は希釈率，縦軸は

Ct

値を示す。

PCR

効率は標準曲線の傾きから計算し，相関係数(R²

)は近似線より求め

た。すべてのプライマーが定量性を示した。

18 23 28

0.001 0.01 0.1 1

Initial Quantity

22 27 32

0.001 0.01 0.1 1

16 21 26 31 36

0.0001 0.01 1

Initial Quantity 18

23 28 33 38

0.0001 0.01 1

FBP-1

R

²

=0.999, efficiency 112.4%

PFK-M

R

²

=0.994, efficiency 111.1%

PFK-P

R

²

=0.997, efficiency 105.3%

PFK-L

R

²

=0.991, efficiency 120.1%

(31)

25

図

2-6.

イヌ骨格筋，肝臓および脳における

PFK-1

アイソフォームおよび肝臓に

おける

FBP-1

の

mRNA

発現

イヌ骨格筋，肝臓および脳における標的遺伝子の

PFK-1

アイソフォーム

mRNA

の相対発現量を

real-time RT-PCR

にて検討した。値は

3 skeletal

muscle liver

liver

brain

(32)

26

第

3

章

イヌ骨格筋

PFK-1

の活性調節

(33)

27

3.1

緒言

哺乳類の

PFK-1

には筋肉型（M），肝臓型（L）および血小板型（P）の

3

種類

のアイソフォームが存在し，様々な臓器でその臓器の特徴を反映した

4

量体で構成されるが [Sola-Penna et al., 2010]，骨格筋は

M

型のアイソフォームのみで構成される [Dunaway & Kasten, 1987; Dunaway et al., 1988]。PFK-1は様々な細胞内

因子によりアロステリックな活性調節が行われるが，骨格筋の

PFK-1

においても活性調節についての検討がなされ [Kemp & Foe, 1983]，さらにラット

M

型

PFK-1

アイソフォームの

cDNA

クローニングがなされ，基質である

ATP

や

F-6-

P

の結合部位や活性促進因子や活性抑制因子の反応部位のアミノ酸配列が明らかとなった [Ma et al., 1996]。近年，ウサギ [Banazak et al., 2011]およびヒト [Kloos

et al., 2014]の M

型

PFK-1

アイソフォームの結晶構造が報告され，酵素触媒部位

や活性促進および抑制部位の詳細な構造がさらに明らかにされつつある。

ヒト医学領域では，垂井病として知られるヒト

M

型

PFK-1

活性を欠損した糖原病があり，症状として運動不耐，運動時有痛性筋けいれん，横紋筋融解症，ミオグロビン尿症および溶血を特徴とする常染色体劣性遺伝性疾患である

[Brüser et al., 2012b; Sherman et al., 1994 ; Tarui et al., 1965]。獣医学領域において

も，イングリッシュスプリンガースパニエルやウィペットにおいて，M型

PFK-

1

のナンセンス変異による慢性溶血と労作性ミオパシーを伴う遺伝性疾患が報

(34)

28

告されており [Gerber et al., 2009; Giger et al., 1985; Inal et al., 2012; Vora et al., 1985]，

イヌにおいても

M

型

PFK-1

アイソフォームの重要性が報告されている。

本章では，イヌの骨格筋から部分精製された

PFK-1

を使用して，活性調節因子による効果について検討した。

3.2

3.2.1

材料

ATP，アデノシン二リン酸（ADP）

，

AMP，ウリジン三リン酸（UTP）

，環状

AMP

（cAMP），クエン酸，

ALD，および G3PDH

は，和光純薬工業株式会社（Osaka，

Japan）から購入した。 F-6-P， F-1,6-P

2，

D-フルクトース-1,2-サイクリック-6-二リ

ン酸（F-1,2c-6-P2），

NAD， phenylmethylsulfonyl fluoride

（PMSF）および

TPI

は，

Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）から購入した。Blue Sepharose 6 Fast Flow

（Cibacron Blue）は，

GE Healthcare

（Little Chalfont，

UK）から購入した。 Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate

は

Bio-Rad（Hercules, CA, USA）から入手し

た。ウシ血清アルブミン（BSA）はは

Roche（Mannheim, Germany）から入手し

た。フルクトース

2,6-ビスリン酸（F-2,6-P

2）は，

F-1,2c-6-P

2から合成した [Uyeda

et al., 1981b]。F-2,6-P

2のモル濃度は，リン濃度を測定し [Itaya & Ui, 1966]，それ

に基づいて算定した。その他の試薬は，和光純薬工業株式会社および

Sigma-

(35)

29

Aldrich

から入手した。

3.2.2

供試臓器

第

2

章と同様に，日本大学動物実験委員会によって承認された他の実験において，ペントバルビタールナトリウム（150 mg / kg体重）の静脈内投与により人

道的に安楽死されたビーグル犬（オス

2

頭，メス

2

頭，

1∼2

歳）より摘出した骨格筋を-80°Cで保存した後に使用した。本研究のプロトコルは，日本大学動物実験委員会（承認番号：AP13B074-1）によって承認された。

3.2.3 PFK-1

部分精製

イヌの骨格筋

PFK-1

の部分精製は，既に報告された方法 [Fukushima & Sugiya,

1992]

を一部改変して行った。熱処理を除き，すべての精製ステップは

4°C

環境

で実施した。外科剪刀で

15 g

の骨格筋を細切し，テフロンホモジナイザーを用いて，1 mM PMSFおよび

10 mM DTT

を含む

50 mM

トリスリン酸バッファー

（pH 8.0）溶液にて

500 rpm

で

5

分間ホモジナイズし，100,000×gで

30

分間，超

遠心し，細胞質画分を得た。得られた細胞質画分を

52°C

で

3

分間加熱処理した

後，

10,000×g

で

10

分間遠心し，変性タンパク質を除去した。熱処理した上清を，

0.1 mM EDTA，0.05 mM F-1,6-P

2および

10 mM DTT

を含む

50 mM

トリスリン酸

(36)

30

バッファー（pH 8.0）溶液（A バッファー溶液）で平衡化した

Blue Sepharose 6 Fast Flow（Cibacron Blue）カラム（1×5 cm）にロードした。 A

バッファー溶液

に

0.15 mM ADP

を加えた溶液（50 mL）でカラムを洗浄後，

A

バッファー溶液に

5 mM ATP

および

2 mM F-6-P

を加えた溶液（Bバッファー溶液）を流速

1 mL /

min

で流し，PFK-1を溶出した。PFK-1活性を有する画分を回収し，

50％硫酸ア

ンモニウムでタンパク質を沈殿させ，

10,000×g

で

30

分間遠心分離した。沈査画

分を

10 mM DTT

を含む

50 mM

トリスリン酸バッファー（pH 8）溶液に溶解し

た後，硫酸アンモニウムを除去するために透析を行い，透析された溶液を部分精

製

PFK-1

として使用した。

3.2.4 PFK-1

部分精製における各ステップで得られた

PFK-1

画分について，ウシ血

清アルブミンを指標に

Bradford

法 [Bradford, 1976]でタンパク質濃度を測定した。

3.2.5 PFK-1

の活性測定

至適条件での

PFK-1

活性（Vmax）は，50 mM HEPESバッファー（pH 8.2），

100 mM KCl，6.5 mM MgCl

2，1 mM NH4

Cl，5 mM KH

2

PO4，0.3 mM NADH，0.5

units ALD，0.5 units G3PDH，5 units TPI，1 mM F-6-P，5 mM ATP

および

0.1 mM

(37)

31

AMP

を含む混合溶液に部分精製

PFK-1

を加えて最終容量を

1 mL

とし，25°Cで反応を行った。U-2900 Spectrophotometer（Hitachi High-Technologies Corporation）

を使用して，

NADH

の酸化を

340 nm

の吸光度の減少で継時的に測定した。

NADH

のモル吸光係数から，25°Cで

1

分あたり

1 μmol

の

F-6-P

をリン酸化する酵素活

性を

PFK-1

活性の

1 unit

と定義した。

PFK-1

の活性調節因子の効果の検討においては， 50 mM HEPES バッファー

（pH 7.3），100 mM KCl，6.5 mM MgCl2，1 mM NH4

Cl，5 mM KH

2

PO

4，0.3 mM

NADH， 0.5 units ALD， 0.5 units GDH， 5 units TPI

および濃度の異なる

F-6-P， ATP

および

AMP

を含む混合溶液に部分精製

PFK-1

を加え，容量を

1 mL

とし，25°C で反応を行い，340 nmの吸光度の減少を継時的に測定した。ここで得られた値を

v

とし，至適条件下で得られた最大反応速度（Vmax）に対する比率

v/V

maxとして表した [Uyeda et al., 1981a; Uyeda & Racker, 1965]。

3.3

結果

3.3.1

イヌ骨格筋

PFK-1

の精製度

イヌ骨格筋の細胞質画分を分離し，そこから

PFK-1

を部分精製した。表

3-1

に精製の各ステップのタンパク質濃度と

PFK-1

活性を示す。イヌ骨格筋

PFK-1

は，

細胞質画分より

159

倍精製され，比活性は

4.6 units /mg protein，回収率は 31.6％

(38)

32

であった。

3.3.2 pH

の効果

部分精製されたイヌ骨格筋

PFK-1

の活性を

1 mM F-6-P，5 mM ATP

および

0.1 mM AMP

の条件下にて

pH 7.0〜8.8

で測定し， pH依存性を検討した。その結

果，図

3-1

に示すように，

pH 8.2

で最も高い活性が認められたことから，イヌの骨格筋

PFK-1

の至適

pH

は

8.2

であった。

3.3.3 ATP

の効果

PFK-1

の基質の

1

つである

ATP

の効果を検討した。0.1 mM F-6-P および

0.1 mM AMP

の条件下で，ATP濃度を

0∼10 mM

と変化させイヌ骨格筋

PFK-1

活性

を検討したところ，低濃度（<1 mM）の

ATP

は活性を亢進し，さらに濃度を上げると活性は抑制され，5 mM ATPでほぼ完全に阻害した（図

3-2）

。

3.3.4 F-6-P

の効果

PFK-1

のもう

1

つの基質である

F-6-P

の効果を検討した。

5 mM ATP

および

0.1 mM AMP

の存在下の活性抑制がなされた条件下で，

F-6-P

濃度を

0∼2 mM

と変化

させイヌ骨格筋

PFK-1

活性を検討したところ，図

3-3

に示すように

F-6-P

の濃度

(39)

33

に依存してシグモイド型に活性は上昇した。イヌ骨格筋

PFK-1

活性は

1 mM F- 6-P

でほぼプラトーレベルに達した。

3.3.5 F-2,6-P

2の効果

PFK-1

の強力な活性化因子とされている

F-2,6-P

2の効果について検討した。

0.1 mM F-6-P，5 mM ATP

および

0.1 mM AMP

の存在下の活性抑制がなされた条件

下で，F-2,6-P2濃度を

0∼90 μM

PFK-1

活性を検討したと

ころ，図

3-4

に示すように，用量依存的に活性の亢進が認められた。

3.3.6 AMP

の効果

PFK-1

の活性化因子の

1

つとされている

AMP

の効果について検討した。0.1

mM F-6-P

および

2.5 mM ATP

の存在下の活性抑制がなされた条件下で，AMP濃

度を

0∼0.5 mM

PFK-1

3-5

に示

すように，用量依存的に活性の亢進が認められ，

0.1 mM AMP

でプラトーに達した。

3.3.7 cAMP

の効果

細胞内情報伝達に関わる分子

cAMP

の効果について検討した。0.1 mM F-6-P

(40)

34

および

2.5 mM ATP

の存在下の活性抑制がなされた条件下で，また，cAMP分解

酵素ホスホジエステラーゼの阻害のために

1 mM 3-イソブチル-1-メチルキサン

チンを加えた

cAMP

濃度を

0∼0.5 mM

PFK-1

3-6

に示すように，AMP と類似した用量依存的な活性の亢進が認められた。

3.3.8 PFK-1

の抑制因子の

1

つとされているクエン酸の効果について検討した。0.1

mM F-6-P

および

0.1 mM AMP

の存在下で

ATP

を

0.3 mM

として活性が認められ

る条件下で，クエン酸濃度を

0∼5 mM

PFK-1

3-7

に示すように，用量依存的に活性が阻害された。

3.3.9 UTP

の効果

ヌクレオシド三リン酸の

1

つである

UTP

は

ATP

のように代謝反応の基質としての機能を有することから，UTPの効果について検討した。0.1 mM F-6-P およ

び

0.1 mM AMP

の存在下で，ATPの代わりに

UTP

濃度を

0∼10 mM

と変化させたところ，図

3-8

に示すように，UTPは低濃度でイヌ骨格筋

PFK-1

活性を亢進し，高濃度では活性を抑制し，

ATP

に類似した効果を示した。しかし，活性の亢

(41)

35

進は

ATP

に比べ低濃度（<0.5 mM）で認められ，また，5 mMでは最大活性の約半分の活性を示が認められ，抑制するのには

10 mM

を要した。

3.4

考察

本章では，イヌ骨格筋から

PFK-1

を部分精製し，活性調節因子の効果について検討した。PFK-1の

M

型アイソフォームには，酵素触媒部位，活性促進部位

および活性抑制部位と

3

つのアデニンヌクレオチド結合部位が存在する

[Banaszak et al., 2011; Brüser et al., 2012a]。イヌ骨格筋の PFK-1

は，構成するアイ

ソフォームが

M

型のみであることから，骨格筋

PFK-1

の活性調節は，

M

型アイソフォームの特徴を反映していると考えられる。

ATP

は，高エネルギーリン酸化合物でありエネルギー代謝の目的生成物でありながら，PFK-1 による反応においてリン酸供与体としてだけでなく活性抑制

因子としての機能も有する。本章の結果から，ATP は低濃度では

PFK-1

の触媒

部位に結合し，高濃度では活性抑制部位に結合することで，活性を抑制すること

が示唆された。ラットやウサギの

M

型

PFK-1

アイソフォームには

ATP

による活性部位と抑制部位が存在し，活性調節に関わることから [Ma et al., 1996;

Banaszak et al., 2011]，イヌも同様な活性部位を有していると考えられる。

(42)

36

イヌ骨格筋

PFK-1

は，ATPで阻害された活性を

F-6-P，AMP，F-2,6-P

2は解除したことから，これらは活性調節因子として機能することが示唆された。また，

cAMP

も

AMP

と同様な効果を示した。

M

型

PFK-1

アイソフォームはリン酸化部

位を有することから

cAMP

依存性リン酸化酵素による活性調節が考えられたが，

リン酸化状態でも脱リン酸化状態でも調節因子の効果は明確でないことから，

リン酸化による調節は未だ不明である [Foe & Kemp, 1982; Kemp & Foe, 1983]。

本研究で使用した

cAMP

濃度も高く，AMP と同様な効果を示したことから，

cAMP

の効果はリン酸化を介するものではなく，AMP の結合部位に作用したものと考えられる。

F-2,6-P

2 によるアロステリックな触媒部位は他の活性化因子と異なっており，

この部位への

F-2,6-P

2の結合は

M

型

PFK-1

の活性化にとって重要である [Ma et

al., 1996; Banaszak et al., 2011]。ラット M

型

PFK-1

において

F-2,6-P

2は

1∼2 μM

で

V

maxの

50%程度まで ATP

抑制を解除し，また抑制因子の効果も解除する [Uyeda

et al., 1981a]が，イヌ骨格筋 PFK-1

はさらに高濃度の

F-2,6-P

2を必要とし，ATP

阻害の解除の割合も

V

maxの

30%であることから，他種の M

型

PFK-1

とは異なった性質を有するかもしれない。内在性の

F-2,6-P

2 はホスホフルクトキナーゼ-2

（PFK-2）/フルクトース

2,6-ビスホスファターゼ（FBP-2）により産生調節がな

されることから [Rider et al., 2004]，PFK-2の発現の検討も必要と思われる。

(43)

37

イヌ骨格筋

PFK-1

アイソフォームにおいて，クエン酸は抑制因子として機能することが示された。ラットやウサギの

M

型

PFK-1

においてもクエン酸の阻害部位が同定されており，イヌにおいても同様な構造の存在が考えられる。

イヌ骨格筋

PFK-1

アイソフォームにおいて，

UTP

は基質である

ATP

と同様に低濃度では活性化因子として，また，高濃度では抑制因子として活性調節に関わ

ることが示唆された。

UTP

は

ATP

より低濃度でイヌ骨格筋

PFK-1

を活性化したことから，PFK-1の

ATP

による触媒部位に結合し，ATPよりも効率的なリン酸

供与体として機能すると考えられる。しかし，抑制効果には

ATP

より高い濃度が必要であったことから，ATP と比べて活性抑制部位には結合しにくいと考えられる。

M

型

PFK-1

アイソフォームは，アクチン [Liou & Anderson, 1980] ，カルモジュリン [Marinho-Carvalho et al., 2006]，カベオリン [Vallejo & Hardin, 2005] などのタンパク質と結合して活性が修飾されることが知られており，それが骨格筋の機能に関わるグルコース代謝の調節に関わっていると考えられていることから，イヌ骨格筋の

PFK-1

の活性化における他の調節因子も明らかにすることが必要と考えられる。

(44)

38

表

3-1.

イヌ骨格筋

PFK-1

の精製

Step Total

activity

Total

protein Specific activity Yield Purification

Cytosol

(units) 38.03

(mg) 1313.4

(units/mg protein) 0.029

(%) 100.0

(fold)

1.00 Heat-treatment 28.80 421.47 0.068 75.7 2.36

Blue Sepharose 20.74 15.03 1.380 54.5 47.66

Dialysis 12.03 2.61 4.609 31.6 159.18

(45)

39

図

3-1.

イヌ骨格筋

PFK-1

に対する

pH

の効果

イヌ骨格筋から部分精製した

PFK-1

活性について

pH

を変化させて測定した。

PFK-1

活性は

1

分間あたりの

340 nm

の吸光度の減少で示した。

pH 8.2

で最も高

い活性が認められた。値は

3

例の平均値

±

7.0 7.6 8.2 8.8

(46)

40

図

3-2.

イヌ骨格筋

PFK-1

活性に対する

ATP

の効果

イヌ肝臓から部分精製した

PFK-1

の活性を，

pH 7.3

および

0.1 mM F-6-P

の条件下において

ATP

濃度を

0

∼

10 mM

まで変化させ，測定した。低濃度では

PFK-1

活性の活性化されたが，高濃度では阻害がみられ，

5 mM

でほぼ完全に阻害された。

値は

3

例の平均値

±

(47)

41

図

3-3.

イヌ骨格筋

PFK-1

に対する

F-6-P

の効果

PFK-1

の活性を，

pH 7.3

および

5 mM ATP

の条件下で

F-6-P

濃度を

0

∼

2 mM

まで変化させ，測定した。

F-6-P

の濃度依存的に

PFK-

1

に対する

ATP

阻害が解除された。値は

3

例の平均値

±

(48)

42

図

3-4.

イヌ骨格筋

PFK-1

に対する

F-2,6-P

2の効果

PFK-1

の活性を，

pH 7.3

，

0.1 mM F-6-P

，

5 mM ATP

および

0.1 mM AMP

の条件下で

F-2,6-P

2濃度を

0-90 μM

まで変化させ，測定し

た。

F-2,6-P

2の濃度依存的に

PFK-1

に対する

ATP

阻害が解除された。値は

3

例

の平均値±標準誤差を示す。

(49)

43

図

3-5.

イヌ骨格筋

PFK-1

活性に対する

AMP

の効果

PFK-1

活性を，

pH 7.3

，

0.1 mM F-6-P

および

2.5 mM

ATP

の条件で測定した。

PFK-1

に対する

ATP

阻害が

AMP

により解除された。値は

3

(50)

44

図

3-6.

イヌ骨格筋

PFK-1

活性に対する

cAMP

の効果

PFK-1

活性を，

pH 7.3

，

0.1 mM F-6-P

および

2.5 mM ATP

の条件で測定した。

PFK-

１に対する

ATP

阻害が

cAMP

により解除された。

値は

3

(51)

45

図

3-7.

イヌ骨格筋

PFK-1

活性に対するクエン酸の効果

PFK-1

の活性を，

pH 7.3

，

0.1 mM F-6-P

，

0.1 mM

AMP

および

0.3 mM ATP

の条件下で，クエン酸の濃度を

0

∼

5 mM

まで変化させ，

測定した。縦軸はクエン酸が存在しないときの活性を

100%

として，残存活性で示した。クエン酸の濃度依存的に

PFK-1

活性の阻害が認められた。値は